@phdthesis{Jordan2001, author = {Jordan, Bruce}, title = {The identification of NRAGE}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180090}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{Wiese2015, author = {Wiese, Katrin Evelyn}, title = {Sensing supraphysiological levels of MYC : mechanisms of MIZ1-dependent MYC-induced Apoptosis in Mammary Epithelial Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-132532}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Deregulated MYC expression contributes to cellular transformation as well as progression and maintenance of human tumours. Interestingly, in the absence of additional genetic alterations, potentially oncogenic levels of MYC sensitise cells to a variety of apoptotic stimuli. Hence, MYC-induced apoptosis has long been recognised as a major barrier against cancer development. However, it is largely unknown how cells discriminate physiological from supraphysiological levels of MYC in order to execute an appropriate biological response. The experiments described in this thesis demonstrate that induction of apoptosis in mammary epithelial cells depends on the repressive actions of MYC/MIZ1 complexes. Analysis of gene expression profiles and ChIP-sequencing experiments reveals that high levels of MYC are required to invade low-affinity binding sites and repress target genes of the serum response factor SRF. These genes are involved in cytoskeletal dynamics as well as cell adhesion processes and are likely needed to transmit survival signals to the AKT kinase. Restoration of SRF activity rescues MIZ1- dependent gene repression and increases AKT phosphorylation and downstream function. Collectively, these results indicate that association with MIZ1 leads to an expansion of MYC's transcriptional response that allows sensing of oncogenic levels, which points towards a tumour-suppressive role for the MYC/MIZ1 complex in epithelial cells.}, subject = {Myc}, language = {en} } @phdthesis{Schlegelmilch2012, author = {Schlegelmilch, Katrin}, title = {Molecular function of WISP1/CCN4 in the musculoskeletal system with special reference to apoptosis and cell survival}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73430}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.}, subject = {Knorpelzelle}, language = {en} } @phdthesis{Philippi2011, author = {Philippi, Nicole}, title = {Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Apoptose der Leberzellen ist abh{\"a}ngig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellul{\"a}ren Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener {\"a}ußerer Einfl{\"u}sse und nat{\"u}rlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzust{\"a}nde anzunehmen. Die verschiedenartigen Einfl{\"u}sse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzust{\"a}nde. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzust{\"a}nde, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst ver{\"a}ndert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellul{\"a}ren Netzwerkes und seiner verschiedenen Zust{\"a}nde dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabh{\"a}ngig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer {\"U}bereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-M{\"o}glichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso ber{\"u}cksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsm{\"o}glichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazellul{\"a}re Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.}, subject = {Systembiologie}, language = {de} } @phdthesis{Karunakaran2012, author = {Karunakaran, Karthika}, title = {Mechanisms of apoptosis regulation in human cells infected with Simkania negevensis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72098}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Chlamydiales are obligate intracellular gram-negative bacteria that have gained high medical relevance. These important human pathogens cause diverse diseases including trachoma and wide spread sexually transmitted diseases. Chlamydia establishes membrane bound inclusions in the host cell and loots the host for nutritional requirements. Infections are usually recognized by the host immune system and eliminated systematically, by triggering apoptosis. However, the pathogen Chlamydia has evolved various strategies to prevent the detection as well as protect the invaded cell against apoptosis or any other form of cell death. The evolutionary conservation of cell death regulation has not been investigated in the order Chlamydiales, which also includes Chlamydia-like organisms with a broader host spectrum. The present study was aimed at investigating the apoptotic response of human cells infected with the Chlamydia-like organism Simkania negevensis (Sn). Simkania infected cells exhibited strong resistance to apoptosis induced by intrinsic stress or by the activation of cell death receptors. Apoptotic signaling was blocked upstream of mitochondria since Bax translocation, Bax and Bak oligomerisation and cytochrome c release were absent in these cells. Caspases were differentially regulated upon Sn infection. Caspase-3 and -9 were not activated upon Sn infection and apoptosis induction; whereas caspases-8 was activated in Sn infected cells even without apoptosis induction. This indicates that, Sn utilizes death receptor association independent caspase activation for thriving in the host environment. Infected cells turned on pro-survival pathways like cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP-1/2 and XIAP) and the Akt/PI3K pathway. Sn infection also 20 activated the pro-survival transcription factor NF-кB. Blocking any of these survival pathways sensitized the infected host cell towards apoptosis induction, demonstrating their role in infection-induced apoptosis resistance. The NF-кB mutant cells also showed reduced infectivity of Sn, which indicated an essential role of NF-кB in Sn infection. It was interesting to observe that, Acanthamoeba castellanii, a natural host of Sn, survived maintaining its trophozoite forms after infection with Sn upon starvation. The metacaspases, responsible for encystment could be regulated by Sn upon infection. This suggests an early level of gene regulation indicating how the pathogen evolved its ability to inhibit apoptosis in higher organisms. The resistance to apoptosis pathways subverted in Sn-infected cells was similar but not identical to those modulated by Chlamydia. Together, the data supports the hypothesis of evolutionary conserved signaling pathways to apoptosis resistance as common denominators in the order Chlamydiales.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{GrosseWilde2001, author = {Große-Wilde, Anne}, title = {Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors f{\"u}r TRAIL (mTRAIL-R)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-559}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie geh{\"o}ren. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten prim{\"a}ren Zellen resistent gegen{\"u}ber TRAIL sind. In pr{\"a}klinischen Studien mit M{\"a}usen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizit{\"a}t von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben betr{\"a}chtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. {\"U}ber die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in M{\"a}usen zu etablieren. Zun{\"a}chst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch {\"u}ber 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach {\"U}berexpression Caspase-abh{\"a}ngig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu k{\"o}nnen, sollten mTRAIL-R-defiziente M{\"a}use generiert werden. Zur Modifikation des f{\"u}r p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalit{\"a}t oder sekund{\"a}re kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use, k{\"o}nnen nun in vivo f{\"u}r die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Dwertmann2012, author = {Dwertmann, Anne}, title = {Impact of the Tumor Suppressor Arf on Miz1 and Sumoylation of Myc and Miz1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71876}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Upon oncogenic stress, the tumor suppressor Arf can induce irreversible cell cycle arrest or apoptosis, depending on the oncogenic insult. In this study, it could be shown that Arf interacts with Myc and the Myc-associated zinc-finger protein Miz1 to facilitate repression of genes involved in cell adhesion. Formation of a DNA-binding Arf/Myc/Miz1 complex disrupts interaction of Miz1 with its coactivator nucleophosmin and induces local heterochromatinisation, causing cells to lose attachment and undergo anoikis. The assembly of the complex relies on Myc, which might explain why high Myc levels trigger apoptosis and not cell cycle arrest in the Arf response. This mechanism could play an important role in eliminating cells harboring an oncogenic mutation. Arf furthermore induces sumoylation of Miz1 at a specific lysine by repressing the desumoylating enzyme Senp3. A sumoylation-deficient mutant of Miz1 however does not show phenotypic differences under the chosen experimental conditions. Myc can also be modified by Sumo by multisumoylation at many different lysines, which is unaffected by Arf. The exact mechanism and effect of this modification however stays unsolved.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{Schweizer2002, author = {Schweizer, Ulrich}, title = {Genetische Untersuchungen zur Rolle von Cytochrom C und Stat3 bei der Regulation des embryonalen Zelltods von Motoneuronen der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3732}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Genetische Inaktivierung des somatischen Cytochrom C Gens der Maus Cytochrom C wurde als ein Interaktionspartner im Apoptosom beschrieben. Ziel dieses Projektes war es, die Rolle von Cytochrom C bei der Apoptose von Nervenzellen in vivo durch genetische Inaktivierung in der Maus zu untersuchen. Die homozygote Deletion des Cytochrom C Gens f{\"u}hrt jedoch zu einem sehr fr{\"u}hen Entwicklungsdefekt: Schon am 8. Embryonaltag findet man nur noch Embryonen ohne erkennbare K{\"o}rperachse. Im weiteren wurden daher heterozygote Tiere untersucht, die in bestimmten Geweben, wie Gehirn und R{\"u}ckenmark, eine Reduktion der Menge von Cytochrom C aufweisen. Am ersten Tag nach der Geburt konnten keine Unterschiede zwischen Tieren mit einem oder zwei Cytochrom C Genen in Bezug die Anzahl von Motoneuronen gefunden werden. Auch nach perinataler Fazialisl{\"a}sion war die Rate des Zelltods bei Tieren mit heterozygoter Deletion des Cytochrom C Gens unver{\"a}ndert. In vitro zeigte sich jedoch eine erh{\"o}hte Resitenz von Motoneuronen gegen{\"u}ber Fas-induzierter Apoptose. Bei der Analyse der Apoptose von Thymozyten zeigte sich ein Trend, der eine kleine, aber reproduzierbare Verz{\"o}gerung einer sp{\"a}ten Zelltodphase nach UV-induzierter Apoptose nahelegt. Erste Experimente deuten außerdem auf einen Effekt der Cytochrom C Gendosis auf den Verlauf einer Experimentellen Autoimmunencephalitis (EAE) hin. Charakterisierung der NFL-Cre Maus Die zelltypspezifische Genablation mit dem Cre/loxP System umgeht einige der gr{\"o}ßten Probleme der klassischen Methode der Geninaktivierung in M{\"a}usen, indem nur in bestimmten Geweben oder Zelltypen, eventuell sogar nur ab einem bestimmten Zeitpunkt, ein Gen gezielt ausgeschaltet werden kann. Allerdings h{\"a}ngt das Cre/loxP System von der Verf{\"u}gbarkeit von brauchbaren Cre-transgenen Mauslinien mit entsprechenden Expressionsmustern und -kinetiken ab. Wir haben eine transgene Mauslinie etabliert und analysiert, die die Cre Rekombinase unter der Kontrolle des humanen Neurofilament-L Promotors exprimiert. Das Expressionsmuster von Cre wurde in mehreren Geweben mit RT-PCR und durch Verkreuzung mit einer Reportergenmaus untersucht. Im Gehirn wurden Cre exprimierende Zelltypen mit in-situ Hybridisierung, Immunhistochemie und wiederum mit Hilfe der Reportermaus identifiziert. Dabei zeigte sich eine spezifische Cre Expression in bestimmten Neuronpopulationen wie hippocampalen Pyramidenzellen und spinalen und cranialen Motoneuronen. Unsere NFL-Cre Maus besitzt einige Eigenschaften, die bisher publizierte Cre-Linien nicht aufweisen, so z.B.eine starke Cre Expression in hippocampalen Pyramidenzellen, aber nicht in K{\"o}rnerzellen des Gyrus dentatus; Expression in cortikalen Pyramidenzellen, aber keine Expression im Striatum; Expression in zerebell{\"a}ren Purkinje-, aber nicht K{\"o}rnerzellen; sowie die Expression in spinalen und cranialen Motoneuronen, aber nicht in angrenzenden Interneuronen. Die Rolle von Stat3 f{\"u}r das {\"U}berleben von Motoneuronen Die Mitglieder der CNTF/LIF/Cardiotrophin Genfamilie sind potente {\"U}berlebensfaktoren f{\"u}r embryonale und l{\"a}dierte Motoneurone sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Faktoren binden an Rezeptorkomplexe, die gp130 und LIFR als signaltransduzierende Komponenten enthalten. Im Gegensatz zu den Rezeptoren f{\"u}r andere neurotrophe Faktoren, f{\"u}hrt die Aktivierung von gp130 und LIFR zur Phosphorylierung und Aktivierung des Transkriptionsfaktors Stat3. Es war aber zu Beginn dieser Arbeiten unklar, ob die Aktivierung von Stat3 f{\"u}r den {\"U}berlebenseffekt der neuropoietischen Zytokine notwendig ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde Stat3 in Motoneuronen mit Hilfe des Cre/loxP Systems konditional inaktiviert. Stat3 ist nicht f{\"u}r das {\"U}berleben embryonaler Motoneurone essentiell, obwohl man in vitro eine Verschiebung der Dosis-Wirkungskurve f{\"u}r CNTF findet. In vivo hingegen kann kein erh{\"o}hter Zelltod von Motoneuronen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu, kommt es bei adulten Tieren mit Inaktivierung von Stat3 in Motoneuronen zu einem erh{\"o}hten Zelltod nach Fazialisl{\"a}sion. Diese Neurone k{\"o}nnen wiederum durch die Applikation neurotropher Faktoren, einschließlich CNTF, gerettet werden. Durch semiquantitative RT-PCR kann man zeigen, daß Stat3-regulierte Gene, deren Expression nach Nervenl{\"a}sion induziert wird, in Neuronen mit Inaktivierung von Stat3 weniger stark exprimiert werden. Zu diesen Genen geh{\"o}ren Reg-2, ein Mitogen f{\"u}r Schwannzellen, das von regenerierenden Neuronen exprimiert wird, und Bcl-xL, ein Gen, welches direkt in die Apoptoseregulation eingreift. Diese Daten zeigen, daß Stat3 Aktivierung eine essentielle Rolle f{\"u}r das {\"U}berleben nach L{\"a}sion von postnatalen Motoneuronen spielt, aber nicht w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung. Das bedeutet, daß die Signalwege ein und desselben neurotrophen Faktors sich w{\"a}hrend der Entwicklung und reifung des Organismus ver{\"a}ndern k{\"o}nnen.}, subject = {Cytochrom c}, language = {de} } @article{SeherNickelMuelleretal.2011, author = {Seher, Axel and Nickel, Joachim and Mueller, Thomas D. and Kneitz, Susanne and Gebhardt, Susanne and Meyer ter Vehn, Tobias and Schlunck, Guenther and Sebald, Walter}, title = {Gene expression profiling of connective tissue growth factor (CTGF) stimulated primary human tenon fibroblasts reveals an inflammatory and wound healing response in vitro}, series = {Molecular Vision}, volume = {17}, journal = {Molecular Vision}, number = {08. Okt}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-140189}, pages = {53-62}, year = {2011}, abstract = {Purpose: The biologic relevance of human connective tissue growth factor (hCTGF) for primary human tenon fibroblasts (HTFs) was investigated by RNA expression profiling using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology to identify genes that are regulated by hCTGF. Methods: Recombinant hCTGF was expressed in HEK293T cells and purified by affinity and gel chromatography. Specificity and biologic activity of hCTGF was confirmed by biosensor interaction analysis and proliferation assays. For RNA expression profiling HTFs were stimulated with hCTGF for 48h and analyzed using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology. Results were validated by real time RT-PCR. Results: hCTGF induces various groups of genes responsible for a wound healing and inflammatory response in HTFs. A new subset of CTGF inducible inflammatory genes was discovered (e.g., chemokine [C-X-C motif] ligand 1 [CXCL1], chemokine [C-X-C motif] ligand 6 [CXCL6], interleukin 6 [IL6], and interleukin 8 [IL8]). We also identified genes that can transmit the known biologic functions initiated by CTGF such as proliferation and extracellular matrix remodelling. Of special interest is a group of genes, e.g., osteoglycin (OGN) and osteomodulin (OMD), which are known to play a key role in osteoblast biology. Conclusions: This study specifies the important role of hCTGF for primary tenon fibroblast function. The RNA expression profile yields new insights into the relevance of hCTGF in influencing biologic processes like wound healing, inflammation, proliferation, and extracellular matrix remodelling in vitro via transcriptional regulation of specific genes. The results suggest that CTGF potentially acts as a modulating factor in inflammatory and wound healing response in fibroblasts of the human eye.}, language = {en} } @phdthesis{Kilic2002, author = {Kilic, Mehtap}, title = {Formation of caspase activating complexes and activation of caspase-12 during apoptosis in AKR-2B mouse fibroblasts}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7190}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Der Zelltod kann in Dichte-arretierten AKR-2B Mausfibroblasten durch Entzug des Serums oder Behandlung mit Anisomycin induziert werden. Der Zelltod zeigt zwar die f{\"u}r die Apoptose typischen morphologischen Ver{\"a}nderungen der Zelle wie Zellfragmentierung und Chromatinkondensation jedoch fehlen andere apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder {\"A}nderung des Membranpotentials der Mitochondria. W{\"a}hrend der Apoptose wurde eine beachtliche DEVDase Aktivit{\"a}t nach- gewiesen, die einem einzelnen Enzym zugeordnet werden konnte. Dieses Enzym hatte typische Eigenschaften von Effektor-Caspasen, wie die der Caspase-3, besaß jedoch einen ungew{\"o}hnlich hohen KM Wert von 100 µM, und die Molmasse der großen Untereinheit betrug 19 kDa anstelle der erwarteten 17 kDa. Mit Hilfe des rekombinanten mCaspase-3 Proteins wurde dieses Enzym in der vorliegenden Untersuchung als Caspase-3 identifiziert. Die N-terminale Sequenzierung des mCaspase-3 Proteins ergab, daß sich die Spaltstelle seiner Prodom{\"a}ne von der des humanen homologen Proteins unterschied (Asp-9 von Asp-28). Somit betrug die Molmasse der großen Untereinheit der aktiven Caspase-3 19 kDa. Dar{\"u}berhinaus stimmte der KM-Wert der rekombinanter mCaspase-3 von ~100 µM mit der {\"u}berein, die in Zellextrakten bestimmt wurde. Die Affinit{\"a}tmarkierung in Kombination mit einer 2D-Gelelektrophorese best{\"a}tigte, daß tats{\"a}chlich Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase in AKR-2B-Zellen w{\"a}hrend der Apoptose aktiviert wird. Im Folgenden wurde untersucht, welcher Signalwege in AKR-2B-Zellen, denen Serum aus dem N{\"a}hrmedia entzogen wurden war oder die mit Anisomycin behandelt worden waren, zur Aktivierung der Caspase-3 f{\"u}hrt. Da eine Beteiligunug des Rezeptor-vermittelte Signalweges bereits zuvor ausgeschlossen worden war,wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob der mitochondrial vermittelte Signalweg bei der Aktivierung von Caspase-3 ein Rolle spielt. Gelfiltrations- experimente ergaben, daß Caspase-3 als freies Enzym und nur in geringen Mengen innerhalb unterschiedlich große Komplexe der Molmassen 600 kDa und 250 kDa eluiert wird. Obwohl die apparenten Molmassen der Caspase-3-haltigen Komplexe mit k{\"u}rzlich ver{\"o}ffentlichten Daten {\"u}bereinstimmten, enthielten sie weder Apaf-1 noch Caspase-9. Dies deutet daraufhin, daß der mitochondrial-vermittelte Signalweg ebenfalls nicht an der Caspase-3 Aktivierung beteiligt ist. Dar{\"u}berhinaus wurde ein neuer Caspase-6 enthaltender Komplex (450 kDa) nach Serumentzug in AKR-2B-Zellen gefunden, der sich deutlich von Caspase-3 haltigen Komplexen unterscheidet. Caspase-3 ist f{\"u}r die meisten morphologische Ver{\"a}nderungen w{\"a}hrend der Apoptose verantwortlich. Wahrend der Apoptose in der AKR-2B-Zellen zwar Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase identifiziert worden war, jedoch keine intranukleosomale Fragmentierung nachgeweisen werden konnen, da bei wurde die intrazellul{\"a}re Lokalisation der Caspase-3 untersucht. Durch {\"U}berexpression eines Caspase-3-GFP Fusionskonstruktes in AKR-2B Zellen wurde die Procaspase-3 im Cytoplasma lokalisiert, w{\"a}hrend die aktive Caspase-3 vorwiegend in membranumh{\"u}llten Vesikeln und zum Teil im Cytoplasma aktiviert wurde. Ebenfalls wurde eine m{\"o}gliche Beteiligung von Caspase-12 und eine ER-Streß vermittelte Signalleitung an der Apoptose in AKR-2B-Zellen untersucht. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß Caspase-12 im Fall von Serumentzug oder Behandlung mit Anisomycin zeitgleich mit Caspase-3 aktiviert wurde, was zur Bildung von zwei Spaltprodukte der Molmassen 47 kDa und 35 kDa f{\"u}hrte. Gelfiltrationsexperimente ergaben, daß Caspase-12 als freies Enzym w{\"a}hrend der Apoptose auftritt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde in allen Publikationen beschrieben, daß Caspase-12 in Folge von ER-Streß aktiviert wird. Nach Serumentzug oder Zugabe von Anisomycin zu AKR-2B-Zellen wurde jedoch kein Anstieg der Synthese des Chaperon-Proteins Grp78, einem Marker f{\"u}r ER-Streß, beobachtet. Dies zeigt, daß beide Behandlungen nicht zur ER-Streß f{\"u}hren. Im Gegensatz dazu erzeugten bekannte Indikatoren von ER Streß wie Thapsigargin und A23187 (ionophor) ER-Streß in AKR-2B-Zellen, was zu unspezifischem Abbau der Caspase-12 f{\"u}hrte. Darum ist es unwahrscheinlich, daß in AKR-2B- Zellen Caspase-12 bei ER-Streß aktiviert wird. Zusammenfassend zeigten diese Daten, daß Caspase-12 in AKR-2B-Zellen {\"u}ber Signalwegen aktiviert wird, die ER stress un- abh{\"a}ngig sind und zeigen daß Caspase-3 bei der Aktivierung von Caspase-12 beteiligt ist somit liefern die vorliegenden Untersuchungen einen Hinweis darauf daß neben den klassischen Signalwege weitere Signalwege existieren, die zur Apoptose f{\"u}hrten.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} }