@phdthesis{Tsai2003,
  author    = {Tsai, Chyn-Bey},
  title     = {Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L. heterologously expressed in Pichia pastoris},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5544},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Zusammenfassung Hintergrund: In einer vorhergehenden Studie wurde gezeigt, dass die Nitratreduktase (NR, EC 1.6.6.1) aus Bl{\"a}ttern von Ricinus communis L. im Vergleich zu NRs der meisten anderen h{\"o}heren Pflanzen durch verschiedene Faktoren unterschiedlich reguliert wird. Die Aktivit{\"a}t ist ungew{\"o}hnlich Mg2+-sensitiv, zeigt ein ver{\"a}ndertes pH-Profil und ist nur gering ATP-abh{\"a}ngig inaktivierbar. Das Ziel dieser Arbeit war, die abweichenden Eigenschaften von Ricinus NR, aus molekularer und physiologischer Sicht detaillierter aufzukl{\"a}ren. Zu diesem Zweck wurde das NR Gen von R. communis geklont, heterolog exprimiert und charakterisiert. Ergebnisse: Die abgeleitete Proteinsequenz zeigte, dass Ricinus NR hohe {\"A}hnlichkeit mit anderem NRs teilte, abgesehen von der N-terminalen Region. In der N-terminalen Region besitzt die Ricinus NR eine s{\"a}urehaltige Sequenz, die nur in den h{\"o}heren Pflanzen konserviert ist. In der Moco-bindenden Region waren einige in 17 Pflanzen NRs konservierte Aminos{\"a}urepositionen ver{\"a}ndert. Zu diesen Positionen geh{\"o}rten His103, Gln123, Val266 und Ala284, die Asparagin, Arginin, Aspartat und Prolin in den anderen Pflanzen ersetzten. Auch an der Dimerisierungs- und Hinge 1-Region, zeigte die Ricinus NR eine ver{\"a}nderte Aminos{\"a}uresequenz. Anstatt Isoleucin und Glycin, besaß die Ricinus NR an den Stellen 460 und 498 Asparagin und Alanin. Durch ein Arg an der Stelle 482 kommt es zu einer zus{\"a}tzliche Trypsinschnittstelle innerhalb des 481KRHK484-Motivs (die meisten NR besitzen hier KPHK). Zus{\"a}tzlich enth{\"a}lt die Ricinus NR eine Serinphosphorylierungsstelle (Ser-526) innerhalb des m{\"o}glichen 14-3-3 Bindemotivs 523KSVS*TP528, was eine allgemeine Eigenschaft von Nitratreduktasen ist. Im C-Terminus von Ricinus NR best{\"a}tigte die Sequenz 886CGPPP890, dass die Ricinus NR ein NADH-spezifisches Enzym ist. Die Ricinus NR und Arabidopsis NR2 (AtNR2) wurden in Pichia pastoris funktionell exprimiert und die Eigenschaften miteinander verglichen. Die rekombinante Ricinus NR (RcNR) selbst wurde nicht durch die Inkubation mit MgATP inhibiert, ebenso AtNR2. Da der Hefeextrakt vermutlich die Faktoren zur Regulierung der NR nicht enth{\"a}lt, wurden entsalzte Blattextrakte von Arabidopsis (ADL), Spinat (SDL) und Ricinus (RDL) zugesetzt, die Kinasen und 14-3-3 Proteine enthielten. Damit keine endogenen NRs sich im Extrakt befinden wurden die Bl{\"a}tter vor Extraktion 4 Tage im Dunkeln gehalten. In Bezug auf die Inhibierung der NR durch ATP wurde festgestellt, dass die RcNR gegen{\"u}ber einer solchen Inhibierung unempfindlich ist, AtNR2 dagegen in jedem Fall durch ATP inaktiviert wird. Bei Kombination von RcNR mit NR-freien Extrakten aus Pflanzen zeigte sich die erh{\"o}hte Mg2+-Sensitivit{\"a}t nur, wenn man RcNR mit RDL inkubierte, nicht aber wenn man RcNR mit SDL oder ADL inkubierte. Es liegt auf der Hand, dass ein oder einige Faktoren in RDL vorkommen, die mit RcNR interagieren und seine hohe Mg2+-Sensitivit{\"a}t hervorrufen. Außerdem, ergab eine Inkubation von AtNR2 mit unterschiedlichen NR-freien Blattextrakten eine bedeutende Aktivierung der Enzymaktivit{\"a}ten, sowohl in Anwesenheit von Mg2+ als auch EDTA. Dies wurde jedoch nicht f{\"u}r die RcNR festgestellt. Nach Verwendung von Ammoniumsulfat zur Fraktionierung des RDL, fand man zus{\"a}tzlich heraus, dass ungef{\"a}hr 0,2 mg des Proteins der Fraktion die mit 0-35\% Ammoniumsulfat gef{\"a}llt wurde ausreichten die maximale Hemmung des RcNR hervorzurufen. Schlussfolgerungen: Die Unempfindlichkeit gegen{\"u}ber ATP erscheint eine angeborene Eigenschaft von Ricinus NR, w{\"a}hrend die hohe Mg2+-Sensitivit{\"a}t von einem oder einigen Faktoren in den Bl{\"a}ttern von Ricinus abh{\"a}ngt. Diese(r) bis jetzt unbekannte Faktor(en) war Hitze-sensitiv und konnte durch Ammoniumsulfat ausgef{\"a}llt werden. Er scheint spezifisch auf die rekombinante Ricinus-NR einzuwirken, und liefert eine Mg2+-Sensitivit{\"a}t vergleichbar dem authentischen Blattenzym. Außerdem gibt es vermutlich auch positiv regulierende Faktor(en) f{\"u}r die Nitratreduktase aus Bl{\"a}ttern h{\"o}herer Pflanzen.},
  subject      = {Rizinus},
  language  = {en}
}