@article{SchultheisLiewaldBambergetal.2011,
  author    = {Schultheis, Christian and Liewald, Jana Fiona and Bamberg, Ernst and Nagel, Georg and Gottschalk, Alexander},
  title     = {Optogenetic Long-Term Manipulation of Behavior and Animal Development},
  series = {PLoS ONE},
  volume    = {6},
  journal   = {PLoS ONE},
  number    = {4},
  doi       = {10.1371/journal.pone.0018766},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-141250},
  pages     = {e18766},
  year      = {2011},
  abstract  = {Channelrhodopsin-2 (ChR2) is widely used for rapid photodepolarization of neurons, yet, as it requires high-intensity blue light for activation, it is not suited for long-term in vivo applications, e. g. for manipulations of behavior, or photoactivation of neurons during development. We used "slow" ChR2 variants with mutations in the C128 residue, that exhibit delayed off-kinetics and increased light sensitivity in Caenorhabditis elegans. Following a 1 s light pulse, we could photodepolarize neurons and muscles for minutes (and with repeated brief stimulation, up to days) with low-intensity light. Photoactivation of ChR2(C128S) in command interneurons elicited long-lasting alterations in locomotion. Finally, we could optically induce profound changes in animal development: Long-term photoactivation of ASJ neurons, which regulate larval growth, bypassed the constitutive entry into the "dauer" larval state in daf-11 mutants. These lack a guanylyl cyclase, which possibly renders ASJ neurons hyperpolarized. Furthermore, photostimulated ASJ neurons could acutely trigger dauer-exit. Thus, slow ChR2s can be employed to long-term photoactivate behavior and to trigger alternative animal development.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Reyer2020,
  author    = {Reyer, Antonella},
  title     = {Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen},
  doi       = {10.25972/OPUS-21867},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {Ebenso wie Tiere verf{\"u}gen Pflanzen {\"u}ber die F{\"a}higkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repr{\"a}sentieren elektrische Signale - Membranpotential{\"a}nderungen an der Plasmamembran - die fr{\"u}hesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge ver{\"a}nderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden k{\"o}nnen. Stimuli wie K{\"a}lte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Best{\"a}ubung f{\"u}hren zur {\"A}nderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotential{\"a}nderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abh{\"a}ngigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen {\"u}ber die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare' Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen f{\"u}hrt ein Ber{\"u}hrungsreiz zur Ausl{\"o}sung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgor{\"a}nderungen basierenden, nastischen Bewegung f{\"u}hrt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotential{\"a}nderungen sehr variabel, abh{\"a}ngig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und - mit Ausnahme der Reaktion auf einen K{\"a}ltestimulus - lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Gr{\"u}nalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der f{\"u}r seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor ben{\"o}tigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die M{\"o}glichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgel{\"o}st werden. Dadurch erm{\"o}glicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabh{\"a}ngige Natriumkan{\"a}le die Depolarisation, w{\"a}hrend spannungsabh{\"a}ngige Kaliumkan{\"a}le die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen ver{\"a}nderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abh{\"a}ngige Anionenkan{\"a}le vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. F{\"u}r die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von ausw{\"a}rtsgleichrichtenden Kaliumkan{\"a}len postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL m{\"o}glich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkan{\"a}le und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabh{\"a}ngige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein m{\"o}glicher Beitrag des ausw{\"a}rtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der ausw{\"a}rtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK {\"o}ffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential f{\"u}r Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele nat{\"u}rliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringf{\"u}gig {\"u}berschreiten, leistet der GORK einen geringf{\"u}gigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen m{\"o}glicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterst{\"u}tzen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik w{\"a}hrend eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals m{\"o}glich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials w{\"a}hrend der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Dar{\"u}ber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In {\"U}bereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak'-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einw{\"a}rtsgleichrichtende Kaliumkan{\"a}le, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkan{\"a}len bestimmt wird. Das m{\"o}gliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge f{\"u}r die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kan{\"a}le, ihrer spektralen Diversit{\"a}t und ihrer Einkreuzung in ausgew{\"a}hlte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert.},
  subject      = {pflanzliche Elektrophysiologie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grotemeyer2019,
  author    = {Grotemeyer, Alexander},
  title     = {Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\)},
  doi       = {10.25972/OPUS-17879},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the 'classical' Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions.},
  subject      = {Optogenetik},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Baumann2013,
  author    = {Baumann, Melanie},
  title     = {Optogenetische Simulation und Analyse elektrischer und Calcium-basierter Signale in Pflanzen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-87974},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in h{\"o}heren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette f{\"u}r WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht m{\"o}glich. Demgegen{\"u}ber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch f{\"u}r stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen best{\"a}tigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der {\"U}berexpression eine starke {\"U}berladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis f{\"u}r einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotential{\"a}nderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkan{\"a}le f{\"u}hren k{\"o}nnte. F{\"u}r die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden.   Transkriptionelle {\"A}nderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakbl{\"a}ttern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form g{\"a}nzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, w{\"a}hrend kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten.},
  subject      = {Channelrhodopsin-2},
  language  = {de}
}