@phdthesis{Foerster2012,
  author    = {F{\"o}rster, Sabine},
  title     = {Nuclear Hormone Receptors and Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Echinococcus multilocularis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85832},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite's Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier.},
  subject      = {Signaltransduktion},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Duell2012,
  author    = {D{\"u}ll, Johannes},
  title     = {Untersuchungen zur aktivierungsabh{\"a}ngigen Phosphorylierung der MAP Kinasen von T Zellen, die durch chim{\"a}rische T Zellrezeptormolek{\"u}le aktiviert werden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85318},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus prim{\"a}r humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chim{\"a}rischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chim{\"a}rischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und betr{\"a}gt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der {\"U}berpr{\"u}fung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegen{\"u}ber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chim{\"a}rischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstst{\"a}ndig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantit{\"a}t als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen {\"u}ber einen chim{\"a}rischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung {\"u}ber den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die {\"u}ber den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die {\"u}ber den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker f{\"u}r T Zellen. Die T Zellen, die durch die chim{\"a}rischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollst{\"a}ndige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellul{\"a}ren Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Ph{\"a}nomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen best{\"a}tigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen f{\"u}hrt zu einer h{\"o}heren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung {\"u}ber den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht f{\"u}r eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalit{\"a}t der T Zelle nach sich ziehen w{\"u}rde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird best{\"a}tigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalit{\"a}t dieser T Zellen zu schließen.},
  subject      = {T Zellen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Deiss2012,
  author    = {Deiß, Katharina},
  title     = {Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern erm{\"o}glicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gew{\"a}hlt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung f{\"u}r die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpr{\"a}zipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass f{\"u}r diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molek{\"u}len notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfl{\"a}che wurden die Aminos{\"a}uren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP f{\"u}r seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP f{\"u}r die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine h{\"o}here Affinit{\"a}t zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivit{\"a}t von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivit{\"a}t von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufkl{\"a}rung dieses Mechanismus erweitert unser Verst{\"a}ndnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen.},
  subject      = {Signaltransduktion},
  language  = {de}
}