@phdthesis{Hennig2006,
  author    = {Hennig, Susanne},
  title     = {Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20984},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue {\"o}kologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der F{\"a}higkeit, Biofilme auf abiotischen Oberfl{\"a}chen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilit{\"a}t. Ein markantes Beispiel f{\"u}r genotypische Variabilit{\"a}t ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und pr{\"a}zise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON" Mechanismus der Phasenvariation, die pr{\"a}zise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabh{\"a}ngigen Prozess vollst{\"a}ndig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Pr{\"a}zise Exzision war hingegen abh{\"a}ngig von der Integrit{\"a}t der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte pr{\"a}zise Exzision Transposase-unabh{\"a}ngig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision f{\"u}r die vollst{\"a}ndige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verk{\"u}rzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war pr{\"a}zise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verk{\"u}rzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der pr{\"a}zisen Exzision ca. dreifach erh{\"o}ht. Diese Beobachtungen unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionsh{\"a}ufigkeit im Ungleichgewicht stehen. W{\"a}hrend der Durchf{\"u}hrung der Experimente zur pr{\"a}zisen Exzision aus icaC wurden nach mehrt{\"a}giger Passage h{\"a}ufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Ph{\"a}notyp als der Wildtyp auf. Anstelle von f{\"a}diger extrazellul{\"a}rer Substanz wie beim Wildtyp wurde verst{\"a}rkt eine polymorphe, aus globul{\"a}ren Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 \% NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollst{\"a}ndig, w{\"a}hrend es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 \% Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich st{\"a}rkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erh{\"o}ht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erh{\"o}hten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis {\"u}ber einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verf{\"u}gt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung f{\"u}hren kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro n{\"a}her charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog {\"u}berexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erh{\"o}hte Affinit{\"a}t zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verk{\"u}rzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Dom{\"a}ne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminos{\"a}uren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA {\"u}berpr{\"u}ft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen f{\"u}hrten zu einer stark abgeschw{\"a}chten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsverm{\"o}gens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdom{\"a}ne eines Elements der IS256-Familie n{\"a}her beschrieben.},
  subject      = {Staphylococcus epidermis},
  language  = {de}
}