@phdthesis{Hoerst2013,
  author    = {H{\"o}rst, Alexander},
  title     = {Aspekte der Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung mittels kontinuierlicher Ultrafiltration},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77775},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Die Plasmaproteine dienen dem K{\"o}rper u.a. als Transportproteine. Dem Serumal-bumin kommt hierbei die gr{\"o}ßte Bedeutung zu. Aufgrund seiner Aufgabe weist es eine Reihe unterschiedlicher Bindungsstellen f{\"u}r eine Vielzahl unterschiedlichster Liganden auf, wobei die Bindung von Substanzen sowohl an spezifischen Stellen als auch unspezifisch erfolgen kann. Das Ausmaß dieser Bindungen hat Einfluss auf andere pharmakokinetische Parameter, wie die Bioverf{\"u}gbarkeit und die Elimination eines Arzneistoffes. Treten mehrere Stoffe in Wechselwirkung mit dem Albumin, so k{\"o}nnen sich diese gegenseitig in ihrer Bindung beeinflussen. Das Ausmaß der Beeinflussung ist von der H{\"o}he der Bindung der einzelnen Stoffe und dem zugrunde liegenden Bindungsmechanismus abh{\"a}ngig. Die klinische Relevanz der Beeinflussung h{\"a}ngt von der therapeutischen Breite und von zus{\"a}tzlich auftretenden Wechselwirkungen, der Substanzen wie z.B. wechselseitige Inhibition der Stoffwechselenzyme der Substanzen ab. F{\"u}r die experimentelle Bestimmung der Proteinbindung stehen eine Reihe von Me-thoden zur Verf{\"u}gung, die sich im Messprinzip, dem apparativen Aufwand und der Simulation der physiologischen Bedingungen unterscheiden. In der vorliegenden Arbeit wurde die kontinuierliche Ultrafiltration verwendet. Diese stellt die Bedingungen im K{\"o}rper nach und erm{\"o}glicht die Bindungskinetik besser zu betrachten als andere Verfahren, da durch die Titration des Albumins mit der Arzneistoffl{\"o}sung die Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Protein {\"u}ber einen breiten Konzentrationsverlauf beobachtet werden. Die Methode wurde von Heinze etabliert, von Albert weiterentwickelte und jetzt opti-miert. Durch die Konstruktion neuer Messzellen sowie der Entwicklung eines neuen Puffersystems konnte sie f{\"u}r Substanzen zug{\"a}nglich gemacht werden, die aufgrund ihrer hohen Lipophilie und ihrer starken Adsorption an die Messzellen bisher nicht messbar waren. Dar{\"u}ber hinaus wurden die folgenden Untersuchungen durchgef{\"u}hrt: a) Es wurde die gegenseitige Verdr{\"a}ngung von zwei Arzneistoffen aus der Proteinbindung untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich eine Reihe basischer Arzneistoffe durch saure Arzneistoffe verdr{\"a}ngen ließ, so z.B. Imipramin HCl durch Phenprocoumon. Das dem Phenprocoumon strukturell sehr {\"a}hnliche Warfarin rief diese Verdr{\"a}ngung hingegen nicht hervor. Tryptophan, das in HPLC Experimenten die Bindung von Imipramin HCl verringerte [117], hatte im Ultrafiltrationsexperiment keinen Einfluss auf dessen Bindung. Die gegenseitige Beeinflussung zweier Stoffe kann folglich sehr unterschiedlich sein und ist schwer vorhersagbar. Des Weiteren sind die Ergebnisse solcher Bestimmungen stark von der gew{\"a}hlten Methode abh{\"a}ngig und dadurch nur schwer zu vergleichen. Aufgrund der komplexen und uneinheitlichen Wechselwirkungen der basischen und sauren Arzneistoffe in Bezug auf ihre Bindung, kann davon ausgegangen werden, dass basische Arzneistoffe eine Bindestelle an Albumin besitzen. Jedoch l{\"a}sst sich aus der vorliegenden Messung nicht beurteilen, wie spezifisch basische Stoffe an Albumin binden. b) Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Derivate des Acetylcysteins, die kovalent an Cys34 binden k{\"o}nnen, unterschiedliche Ver{\"a}nderung im Bindungsverhalten von Albumin hervorrufen. So nahm die Bindung des Diphenhydraminhydrochlorids in Gegenwart von {\"a}quimolaren Mengen Acetylcystein und Cysteamin ab, w{\"a}hrend die Anwesenheit von Acetylcysteamin den gegenteiligen Effekt hatte. Dies zeigt, dass der Ver{\"a}nderung der Bindung ein komplexerer Zusammenhang als die reine Belegung des Cys34 zugrunde liegen muss. c) Unterschiede in der Proteinbindung von Ephedrin und seiner Stereoisomere konnten mittels kontinuierlicher Ultrafiltration best{\"a}tigt werden. Die Abweichungen in den Ergebnissen in Bezug auf andere Bestimmungsmethoden [130-132] zeigten erneut, wie stark die Messung der Proteinbindung von den Versuchsbedingungen abh{\"a}ngt. d) F{\"u}r die Messung des antiinfektiven Bisnaphthalimids MT02 wurde eine Messzelle aus PVDF konstruiert, die weniger Wechselwirkungen mit adsorbierenden Arzneistoffen zeigt. Aufgrund der Unbest{\"a}ndigkeit der Substanz unter den Versuchsbedingungen war die Messung dennoch nicht m{\"o}glich. e) Die Proteinbindung des Naphthylisochinolins GB AP05 konnte mit Hilfe der bereits erw{\"a}hnten neu konstruierten Messzelle bestimmt werden. Die Bindung war deutlich h{\"o}her als bei anderen Vertretern dieser Gruppe. Die Ursache hierf{\"u}r k{\"o}nnte in der Adsorption der Substanz an die Messzellen begr{\"u}ndet sein. Da GB AP05 stark an den Kunststoff PMMA binden kann, der aufgrund seiner Beschaffenheit vorwiegend Wasserstoffbr{\"u}ckenbindungen f{\"u}r eine Adsorption bereitstellen kann, ist eine hohe Bindung an Albumin, das eine Vielzahl von Bindestellen mit unterschiedlichen chemischen Gruppen aufweist, nicht unwahrscheinlich. f) F{\"u}r eine Reihe von Fluorchinoloncarboxamiden wurde das Ausmaß ihrer Protein-bindung bestimmt. Dieses lag in fast allen F{\"a}llen bei 80 \% oder h{\"o}her. Die einzigen Ausnahmen, GHQ237Ox und GHQ243Ox, legen den Schluss nahe, dass eine basi-sche Seitenkette in Position 1 und das Fehlen des Fluorsubstituenten in Position 6 die Bindung reduzieren k{\"o}nnen. Da nicht alle Substanzen in der Pufferl{\"o}sung gel{\"o}st werden konnten, wurde neben dem bereits durch Albert etablierten DMSO-haltigen Puffer ein Polysorbat 20 haltiger entwickelt, in dem hoch lipophile Substanzen mizellar gel{\"o}st werden k{\"o}nnen. Durch Bestimmung der Proteinbindung von Carbamazepin konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit der Mizellen keinen Einfluss auf die Bindung hat, d.h. im Umkehrschluss dass die Methode zur Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung geeignet ist.},
  subject      = {Serumalbumine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Volpp2021,
  author    = {Volpp, Miriam},
  title     = {Bestimmung der Plasmaproteinbindung von niedrig affinen Liganden am Beispiel der Ephedra-Alkaloide},
  doi       = {10.25972/OPUS-21961},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-219619},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2021},
  abstract  = {Zur Bestimmung der Bindungsaffinit{\"a}t von Liganden zu den Plasmaproteinen, insbesondere Albumin, wurden {\"u}ber die Jahre zahlreiche Methoden entwickelt. Die Grundlage dieser Arbeit war die Bestimmung der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide unter Verwendung einzelner dieser etablierten Methoden. Aufgrund ihres Anwendungsgebiets als Notfallmedikation bei An{\"a}sthesie-bedingter Hypotonie und den damit verbundenen Anforderungen an die Pharmakokinetik, sollten die Ephedra-Alkaloide niedrig-affine Liganden der Plasmaproteine darstellen. In der Literatur und in vorhergehenden Arbeiten wurden f{\"u}r die Ephedra-Alkaloide jedoch sehr unterschiedliche, teilweise der Indikation widersprechende Affinit{\"a}ten bestimmt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide weiter untersucht und die Affinit{\"a}t zu Albumin bzw. anderen Plasmaproteinen im humanen Serum bestimmt werden. Neben der Affinit{\"a}t sollte auch die Stereoselektivit{\"a}t der Bindung genauer betrachtet werden, die bei der Bindung vieler Wirkstoffe eine Rolle spielt. Als Referenzmethode diente die kontinuierliche Ultrafiltration, die auch schon bei H{\"o}rst verwendet wurde. Folgende Schlussfolgerungen konnten aus den Ergebnissen dieser Arbeit gezogen werden: 1) Die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration zeigten, dass die Ephedra-Alkaloide, Ephedrin und Pseudoephedrin, ein nur geringes Ausmaß an Plasmaprotein-bindung von 4 - 9 \% gegen{\"u}ber bovinem und humanem Serumalbumin zeigen. Eine deutlich h{\"o}here Plasmaproteinbindung von 19 - 37 \% konnte hingegen bei der Verwendung von humanem Serum bestimmt werden. Die Affinit{\"a}t von Pseudoephedrin war dabei jeweils geringer als die von Ephedrin. 2) Diese Ergebnisse mit humanem Serum und die Tatsache, dass Albumin vorwiegend saure Stoffe bindet, legen nahe, dass die Ephedra-Alkaloide vermehrt an andere Plasmaproteine in Serum binden. Erste Messergebnisse mit saurem α1 Glykoprotein best{\"a}tigen diese Vermutung. 3) Eine Stereoselektivit{\"a}t konnte nur in geringem Maß bei (+) Ephedrin beobachtet werden, wobei der Unterschied nur im Serum signifikant ist. Pseudoephedrin dagegen zeigte keinerlei Stereoselektivit{\"a}t. Diese Beobachtung passt zu den Schlussfolgerungen der Pfeiffer'schen Regel zur Stereoselektivit{\"a}t einer Bindung. 4) Andere Sympathomimetika mit einer zus{\"a}tzlichen Phenolgruppe im Molek{\"u}l zeigen eine {\"a}hnlich niedrige Affinit{\"a}t zu Albumin von ca. 10 \%. Eine zus{\"a}tzliche Phenolgruppe scheint die sauren Eigenschaften des Liganden nicht ausreichend zu erh{\"o}hen, um die Affinit{\"a}t zu Albumin signifikant zu steigern. 5) Das terti{\"a}re Kohlenstoffatom am Stickstoff des Ephedrins scheint in gewisser Weise an der Bindung zu Albumin beteiligt zu sein. Sympathomimetika mit einer zus{\"a}tzlichen Methylgruppe an diesem Kohlenstoffatom, wie Ephedrin, Pseudoephedrin und Oxilofrin, zeigen eine gr{\"o}ßere Streuung der Messergebnisse. Eine zus{\"a}tzliche Methylgruppe in dieser Position scheint die Bindung daher sterisch zu hindern. 6) Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Ultrafiltration best{\"a}tigen weitestgehend die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration 7) Eine Bestimmung des Ausmaßes der Plasmaproteinbindung von niedrig-affinen Stoffen ist mit den anderen orthogonalen Methoden ACE, NMR und iTC nicht m{\"o}glich. Diese drei verwendeten Methoden trennen nicht wie die klassischen Methoden den gebundenen vom ungebundenen Wirkstoff, sondern beruhen auf einer Ver{\"a}nderung bestimmter Messparameter: bei der ACE die Migrationszeit, bei der NMR-Spektroskopie die chemische Verschiebung der Signale bzw. der Diffusionskoeffizient und bei der iTC die frei werdende Bindungsw{\"a}rme. Bei allen drei Methoden war die {\"A}nderung der Messgr{\"o}ße aufgrund der niedrigen Plasmaproteinbindung zu gering, um auswertbar zu sein. 8) Eine St{\"o}rgr{\"o}ße bei die orthogonalen Methoden war vielfach auch das Albumin selbst bzw. dessen Eigenschaften. Bei der Affinit{\"a}ts-Kapillarelektrophorese sind physiologische HSA-Konzentrationen wegen des starken Basislinienrauschens nicht messbar. Zudem bewirkt der Albuminzusatz im Trennpuffer eine Viskosit{\"a}ts{\"a}nderung, die den EOF verlangsamt und so die Messung st{\"o}rt. Bei der NMR-Spektroskopie k{\"o}nnen wegen der {\"U}berlagerung der Signale durch die breiten Albuminbanden weder Ver{\"a}nderungen in der chemischen Verschiebung noch des Diffusionskoeffizienten zuverl{\"a}ssig bestimmt werden. In der iTC erschwerte die Schaumbildung der L{\"o}sung, die durch die Oberfl{\"a}chenaktivit{\"a}t des Albumins verursacht wird, die Messung. In dieser Arbeit konnte somit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide mit verschiedenen Methoden erfolgreich bestimmt werden. Damit best{\"a}tigte diese Arbeit, dass die Ephedra-Alkaloide, wie deren Indikation vermuten l{\"a}sst, zu den niedrig affinen Liganden des Albumins z{\"a}hlen. Um genauer eingrenzen zu k{\"o}nnen durch welche Plasmaproteine im Blutserum die Ephedra-Alkaloide transportiert werden, sollten die Untersuchungen zum sauren α1-Glykoprotein fortgesetzt und gegebenenfalls durch weitere Bestimmungen mit anderen Plasmaproteinen erg{\"a}nzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben auch gezeigt, dass viele der unz{\"a}hligen Methoden zur Untersuchung der Plasmaproteinbindung bei der Bestimmung von niedrig affinen Liganden ihre Grenzen haben. Nach wie vor sind zur Bestimmung einer niedrigen Bindungsaffinit{\"a}t weiterhin die klassischen Methoden, wie die kontinuierliche Ultrafiltration, Mittel der Wahl. Nicht zuletzt deshalb erfreuen sich diese Methoden auch heute noch großer Beliebtheit.},
  subject      = {Proteinbindung},
  language  = {de}
}