@phdthesis{Kaeppler2004,
author = {K{\"a}ppler, Ulrich},
title = {Synthese und Testung nichtpeptidischer Cystein-Protease-Inhibitoren - Etacryns{\"a}ure als Leitstruktur},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12122},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2004},
abstract = {Cystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und f{\"u}r das {\"U}berleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, k{\"o}nnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-unges{\"a}ttigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einer Michael-Reaktion addieren. Als Leitstruktur diente das Diuretikum Etacryns{\"a}ure, dessen Struktur an verschiedenen Positionen modifiziert wurde. Der Hauptsyntheseweg kann wie folgt beschrieben werden: Die Acylseitenkette gew{\"u}nschter Kettenl{\"a}nge wurde durch Friedel-Crafts-Acylierung in entsprechend substituierte Anisole eingef{\"u}hrt. Diese wurden in einer unmittelbar anschließenden Reaktion zu acylierten Phenolen gespalten, die in einem Folgeschritt mit Bromessigs{\"a}ureethylester zu acylierten Phenoxyessigs{\"a}ureethylestern verethert wurden. In diese wurde in a-Position zum Keton eine Doppelbindung eingef{\"u}hrt. {\"U}ber eine Mannich-Reaktion mit N,N,N',N'-Tetramethyldiaminomethan/Acetanhydrid oder Urotropin/Acetanhydrid erh{\"a}lt man so die acylierten Phenoxyessigs{\"a}ureethylester mit a,b-unges{\"a}ttigter Ketonstruktur. Zur Darstellung der entsprechenden unges{\"a}ttigten S{\"a}uren aus den acylierten Phenoxyessigs{\"a}ureethylestern bedient man sich einer basenkatalysierten Aldokondensation mit Formaldehyd, unter deren Bedingungen der Ethylester zur S{\"a}ure gespalten wird. Kupplung von Etacryns{\"a}ure mit Aminen unter Aktivierung mit DCC/N-Hydroxysuccinimid f{\"u}hrte zu den Etacryns{\"a}ureamiden. Methylierung der acylierten Phenole und anschließende Mannich-Reaktion dient der Darstellung der acylierten Anisole mit a,b-unges{\"a}ttigter Ketonstruktur. Auf diesem Syntheseweg wurden 28 Derivate mit Michael-System synthetisiert. Diese wurden an den Cystein-Proteasen Papain, Cathepsin B (CB), Falcipain (FP) und Rhodesain (RD) getestet. Gegen Serin-Proteasen wurde keine Hemmung festgestellt. Die meisten Inhibitoren zeigten bei CB, FP und RD eine nicht-zeitabh{\"a}ngige Kinetik der Enzyminaktivierung. Nur bei Papain wurde eine zeitabh{\"a}ngige Kinetik beobachtet. Die Substanzen wurden zwar als irreversible Inhibitoren konzipiert, Dialyseversuche beweisen jedoch eine reversible Hemmung. Da eine Vergleichssubstanz ohne aktivierte Doppelbindung unwirksam ist, kann von einer kovalenten Reaktion mit den Cystein-Proteasen ausgegangen werden. Bestimmt wurden die Dissoziationskonstanten Ki der Enzym-Inhibitor-Komplexe EI als Maß f{\"u}r die Affinit{\"a}ten der Inhibitoren zum Enzym und, soforn m{\"o}glich, auch die Alkylierungsgeschwindigkeitskonstanten ki der Reaktion zu modifiziertem Enzym E-I. Eine allgemeine Selektivit{\"a}t f{\"u}r einzelne Enzyme konnte nicht gefunden werden. Die besten Inhibitoren (Ki = 3.2 - 57.5 µM) waren die Etacryns{\"a}ureamide. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass wie erwartet das a,b-unges{\"a}ttigte System essentiell f{\"u}r die Wirksamkeit an Cystein-Proteasen ist, ebenso ein aromatischer Ring. Eine l{\"a}ngere Seitenkette an der Doppelbindung, die mindestens einen Ethylrest tr{\"a}gt, sowie zwei benachbarte Halogenatome am aromatischen Ring erwiesen sich als wirkungssteigernd. Ester und Amide zeigten generell bessere Hemmeigenschaften als die freien S{\"a}uren. Methoxy-Gruppen am Aromaten hatten keinen Wirkungsverlust zur Folge, senken aber die L{\"o}slichkeit in w{\"a}ssrigem Medium. Viel versprechend ist auch der [5-Chlor-2-(2-methylenbutyryl)-phenoxy]-essigs{\"a}ureethylester, der das a,b-unges{\"a}ttigte Doppelbindungs-System in ortho-Position zum phenolischen Sauerstoffatom tr{\"a}gt. Innerhalb der Amide sind kurze, volumin{\"o}se Reste wie der tertButylrest von Vorteil, eine gewisse Selektivit{\"a}t wird mit langkettigen Amiden wie dem n-Hexylamid f{\"u}r FP gegen{\"u}ber CB und RD erreicht. Die Verbindungen wurden auf die Wachstumshemmung von grampositiven und gramnegativen Problemkeimen, sowie auf die Hemmung der Biofilmbildung grampositiver Erreger getestet. Bei gramnegativen Keimen wurde das Wachstum nicht gehemmt. Bei den grampositiven Keimen Staphylococcus aureus und S. epidermidis wirkten ebenfalls der Etacryns{\"a}ureethylester und das Hexylamid, Benzylamid, Anilid der Etacryns{\"a}ure am besten (MHK = 5 - 20 µM). Die genannten Verbindungen zeigten auch die st{\"a}rkste Hemmwirkung auf die Biofilmbildung (100 \% bei 20 - 40 µM bis zu 95 \% bei 2.5 - 5 µM an S. aureus). Aufgrund positiver Screeningergebnisse in einem enzymatischen HPLC-Assays an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) wurden Docking-Experimente mit Etacryns{\"a}ure-tertbutylamid an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse f{\"u}hrten zur Synthese einer modifizierten Verbindung, die eine geringe Verbesserung der Enzyminhibition im fluorimetrischen Assay zeigte.},
subject = {Cysteinproteasen},
language = {de}
}
@phdthesis{Pfeuffer2009,
author = {Pfeuffer, Thomas},
title = {Synthese und Testung von Aza-Peptiden als Cystein- und Aspartat-Protease Inhibitoren sowie Kristallisation und Elektronendichtebestimmung von Aziridin-, Epoxid- und Michael-Akzeptor substituierten Bausteinen},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47792},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2009},
abstract = {Proteasen als Peptid hydrolysierende Enzyme spielen eine essenzielle Rolle im Verlauf verschiedenster Erkrankungen, wie z.B. SARS, Malaria oder Alzheimer. Die irreversible Hemmung dieser Proteasen gilt somit als neues Konzept in der Wirkstoffentwicklung. Dabei ist es von immenser Bedeutung, die Interaktion der beteiligten Proteine zu kennen, um einen geeigneten Wirkstoff zu entwickeln. Ein Ziel dieser Arbeit war es, kleine elektrophile Bausteine wie Aziridine, Epoxide oder Akzetor-substituierte Olefine zu synthetisieren und zu kristallisieren. In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Prof. Luger (FU Berlin) konnten mittels hochaufl{\"o}sender R{\"o}ntgenstrukturanalyse bei ulta-niedrigen Temperaturen die Elektronendichten von mehreren Protease-Inhibitor-Modell-Verbindungen bestimmt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war ausgehend von bekannten aktiven Aziridinen, Epoxiden oder Michael-Systemen, azapeptidische Analoga darzustellen, welche durch ihre Hydrazid-Verkn{\"u}pfung eine bessere Hydrolysebest{\"a}ndigkeit gegen{\"u}ber enzymatischem Abbau bieten. Alle synthetisierten Verbindungen wurden in fluorimetrischen Enzym-Assays an acht Protesen (Cathepsin B, Cathepsin L, Falcipain 2, Rhodesain, SARS-CoV-Mpro, SARS-COV-plpro, SAP2 and Cathepsin D)getestet und die Hemmkonstanten bestimmt},
subject = {Azapeptide},
language = {de}
}
@phdthesis{Stempka2011,
author = {Stempka, Martin},
title = {Expression und Reinigung der SARS-Coronavirus-Mpro und deren Co-Kristallisation mit spezifischen Inhibitoren},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57083},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2011},
abstract = {Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom") handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivit{\"a}t einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schl{\"u}sselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren f{\"u}r diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolek{\"u}len an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Molek{\"u}ls pro Enzym-Monomer: {\"u}berraschenderweise hatten bis zu vier Molek{\"u}le MH211A bzw. zwei Molek{\"u}le UK-VI-1g an ein Proteasemolek{\"u}l gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminos{\"a}uren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der N{\"a}he der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimts{\"a}ure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei m{\"o}gliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer R{\"o}ntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass fr{\"u}her ver{\"o}ffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal {\"u}berdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und fr{\"u}heren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.},
subject = {SARS},
language = {de}
}
@phdthesis{Schneider2011,
author = {Schneider, Thomas},
title = {Synthese von reversiblen und kovalent-reversiblen Cysteinprotease-Inhibitoren},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67491},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2011},
abstract = {Als Vorlage f{\"u}r diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgef{\"u}hrten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1' mit eingef{\"u}gten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingef{\"u}gt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbons{\"a}ure durch die g{\"u}nstigere Verbindung Cyclohexancarbons{\"a}ure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig gekl{\"a}rt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die f{\"a}hig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu k{\"o}nnen. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verl{\"a}uft. Um diese Berechnungen zu best{\"a}tigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem {\"U}berschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilit{\"a}t der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und best{\"a}tigen damit die QM-Berechnungen.},
subject = {Coronaviren},
language = {de}
}
@phdthesis{Herb2011,
author = {Herb, Monika},
title = {Synthese von Pyridin-, Pyridylessigs{\"a}ure- und Thiazol-Derivaten als potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66495},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2011},
abstract = {Einen m{\"o}glichen Ansatzpunkt f{\"u}r eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese {\"u}bernehmen die Polyprotein-Spaltung w{\"a}hrend der Virusreplikation und sind damit essentiell f{\"u}r das {\"U}berleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigs{\"a}ure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivit{\"a}ten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgef{\"u}hrt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enth{\"a}lt Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigs{\"a}ure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbons{\"a}ure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigs{\"a}ure-Derivate mit einer zus{\"a}tzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1'- bzw. S2'-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinit{\"a}t zum Enzym erh{\"o}hen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbons{\"a}uren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verkn{\"u}pft wurden. In den {\"u}brigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von S{\"a}ure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einf{\"u}hrung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgef{\"u}hrten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 \%, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 \% bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigs{\"a}ure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal gr{\"o}ßere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 f{\"u}hrte die Einf{\"u}hrung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den gr{\"o}ßten Einfluss auf die Aktivit{\"a}t zeigte jedoch die Einf{\"u}hrung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.},
subject = {Coronaviren},
language = {de}
}
@phdthesis{Welker2013,
author = {Welker, Armin},
title = {Theoretische und experimentelle Wirkstoffsuche an den Zielproteinen SARS-Coronavirus-Papain-like-Protease und Elongin-C},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72500},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2013},
abstract = {Um Wirkstoffe gegen das SARS-Coronavirus zu erhalten, wurden in dieser Arbeit Proteaseinhibitoren gegen die SARS-CoV-PLpro entwickelt. Ein Ansatz um neue Wirkstoffe gegen HIV zu finden, wurde {\"u}ber eine versuchte Blockade von Elongin-C beschritten. Bei der computergest{\"u}tzten Suche nach neuen SARS-CoV-PLpro-Inihibitoren wurde zun{\"a}chst die strukturell bekannte Ligand-Bindetasche analysiert, und nach Evaluation des Dockingprozesses wurden mehrere Screeningprojekte an den R{\"o}ntgenkristallstrukturen 3E9S und 3MJ5 durchgef{\"u}hrt. Von 24 kommerziell erworbenen Screening-Verbindungen riefen 7 eine St{\"o}rung des beim Enzymassay gemessenen Fluoreszenzsignals hervor (Quenching bzw. Eigenfluoreszenz). Letztlich konnte den beiden inhibitorisch aktiven Imidazolderivaten B6 und B9 je ein IC50-Wert von etwa 50 µM zugewiesen werden. Das Imidazolscaffold er{\"o}ffnet damit eine neue Substanzklasse zur Inhibition der SARS-CoV-PLpro. Im pr{\"a}parativ-chemischen Teil des SARS-Projekts wurden weitere Substanzklassen dargestellt, von denen die Inhibitoren vom Benzamid-Typ und Isoindolin-Typ eine Hemmung im einstelligen Mikromolaren Bereich (IC50) zeigten. Die Isoindolin-Derivate sind damit eine weitere, in dieser Arbeit entwickelte Leitstruktur zur Hemmung der SARS-CoV-PLpro. Bei der Suche nach einem Wirkstoff gegen HIV-1 wurde die neue Zielstruktur Elongin-C zur Inhibition durch niedermolekulare Liganden ausgew{\"a}hlt. Vier virtuelle Screeningprojekte f{\"u}hrten zur Bestellung von 27 Verbindungen. Die durchgef{\"u}hrten Untersuchungen lassen noch keine abschließende Beurteilung der Ergebnisse zu, und der bisherige Zellassay wird noch durch spezifischere Methoden zur Bestimmung einer Ligandbindung an Elongin-C erg{\"a}nzt werden. Falls es gelingt, einer der Verbindungen Elongin-C-blockierende Aktivit{\"a}t nachzuweisen, sind aufgrund des Eingriffs in einen zellul{\"a}ren Mechanismus neben der anti-HIV-Wirkung noch weitere pharmakologische Effekte denkbar, und das therapeutische Potenzial eines solchen Stoffs k{\"o}nnte in zuk{\"u}nftigen Experimenten erforscht werden.},
subject = {Proteaseinhibitor},
language = {de}
}
@phdthesis{Schad2013,
author = {Schad, Caroline},
title = {Synthese und Testung neuartiger peptidomimetischer, selektiver Inhibitoren parasit{\"a}rer Cystein-Proteasen},
url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-90973},
school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
year = {2013},
abstract = {Parasit{\"a}re Protozoen wie Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien weisen eine Vielzahl von Cystein-Proteasen der Papainfalimilie (CAC1) auf, welche als Pathogenit{\"a}ts- und Virulenzfaktoren identifiziert werden konnten. Die aktuell eingesetzten Medikamente zur Behandlung der von diesen Parasiten hervorgerufenen Infektionskrankheiten (Leishmaniose, Afrikanische Schlafkrankheit, Chagas-Krankheit, Malaria) sind aufgrund von Nebenwirkungen, hohen Kosten und sich entwickelnden Resistenzen suboptimal. Die parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen stellen daher potentielle Targets zur Entwicklung neuer Therapieans{\"a}tze dar. Das angestrebte Ergebnis der Entwicklung ist es, selektive Inhibitoren der parasit{\"a}ren Proteasen zu entwickeln, w{\"a}hrend die Wirt-Proteasen unbeeinflusst bleiben. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung der literaturbekannten Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren RV122C (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) und RV212C (Boc-(R)-Leu-(S)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) sowie des Michael-Akzeptor-basierten Inhibitors 16a (Boc-(S)-Phg-(S)-vGln(Trt)-OEt) hinsichtlich ihrer selektiven inhibitorischen Aktivit{\"a}t an parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen. Bei allen synthetisierten Verbindungen handelt es sich um potenziell irreversible, kovalente und kompetitive Inhibitoren. Der Aziridinring und das Michael-System stellen elektrophile Bausteine dar, die von dem nucleophilen Thiolatrest des aktiven Zentrums einer Cystein-Protease angegriffen werden und in der irreversiblen Alkylierung des aktiven Zentrums resultieren. Die Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte mittels fluorimetrischer und photometrischer Enzymassays. Zur Evaluierung der biologischen Aktivit{\"a}ten wurden ggf. weitere biologische Testungen durchgef{\"u}hrt. Die Leitstrukturen RV122C und RV212C der Aziridinylpeptide wurden als Inhibitoren von Proteasen der Cathepsin-L-Subfamilie identifiziert. Eine zweite Serie von Stereo- und Konstitutionsisomeren von RV122C und RV212C brachte ein Derivat hervor, CS09 (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), welches selektive Inhibition von parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen aufwies, ohne humanes Cathepsin L zu hemmen. Neben leishmanizider Aktivit{\"a}t weisen sowohl RV122C und RV212C als auch CS09 keine Toxizit{\"a}t an den eingesetzten Zelllinien auf. Daher erfolgte die Fokussierung auf Untersuchungen in Leishmania major zur detaillierten Aufkl{\"a}rung zellul{\"a}rer Effekte in vitro und in vivo. Der ausgel{\"o}ste Zelltot wurde als Apoptose-{\"a}hnlich charakterisiert, welcher durch unvollst{\"a}ndige Verdaunung in Lysosom-{\"a}hnlichen Vakuolen hervorgerufen wurde. In-vivo-Untersuchungen im Mausmodell zeigten, dass es das Ziel sein muss, Inhibitoren mit Selektivit{\"a}t insbesondere f{\"u}r die Cathepsin-B-{\"a}hnliche LmajcatB zu entwickeln. Ausgehend von CS09 als neue Leitstuktur wurden verschiedene Variationen zur Strukturoptimierung vorgenommen, um im Anschluss Struktur-Wirkungs-Beziehungen ableiten zu k{\"o}nnen. Die Synthese erfolgte mittels Fragmentkupplung der zuvor stereoselektiv dargestellten Aziridin-Bausteine und der durch Standard-Peptidkupplungsreagenzien erhaltenen Aminos{\"a}ure/Peptidbausteine. Die N-Acylierung wurde mittels des Kupplungsreagenzes PPA optimiert. Schließlich wurden die Verbindungen an den Cystein-Proteasen Cathepsin L, Cathepsin B, Cathepsin K, Cathepsin S, LmCPB2.8, LmajcatB, Rhodesain, Cruzain und Falcipain-2 auf ihre inhibitorische Aktivit{\"a}t getestet. Weiterhin wurden die Verbindungen im Rahmen der interdisziplin{\"a}ren Zusammenarbeit innerhalb des Sonderforschungsbereichs 630 auf ihre antiparasit{\"a}re Aktivit{\"a}t an Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien sowie auf ihre Cytotoxizit{\"a}t an der Makrophagenzelllinie J774.1 getestet. Vertreter dieser Serie erwiesen sich, ebenso wie CS09, als selektive Inhibitoren parasit{\"a}rer, Cathepsin-L-{\"a}hnlicher Proteasen (LmCPB2.8, Rhodesain, Cruzain) und der Cathepsin-B-{\"a}hnlichen Protease (LmajcatB). Sehr gute Hemmung der Cathepsin-L-{\"a}hnlichen Protease LmCPB2.8 riefen Stereo- und Konstitutionsisomere von CS09 hervor, als auch Derivate, bei denen der Leucinrest gegen andere lipophile Reste mit {\"a}hnlichem oder gr{\"o}ßerem sterischen Anspruch substituiert ist. Die beste Inhibition des Cathepsin-B-{\"a}hnlichen Enzyms erfolgte durch Konstitutionsisomere von CS09 und durch Aziridinylpeptide, deren Prolinrest gegen einen Ornithin- oder einen Argininrest ersetzt wurde. Besonders hervor sticht CS25 (Boc-(S)-Ile-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), sich auszeichnend durch selektive Inhibition der LmajcatB (neben Cathepsin S) bei sehr guter leishmanizider Aktivit{\"a}t. Auch zeigen einige Vertreter selektive Hemmung von Rhodesain und/oder Cruzain. Mithilfe eines synthetisierten Aziridinylpeptids, welches bromierte Benzylesterreste tr{\"a}gt und sehr gute Hemmeigenschaften an parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen aufweist (CS38), sollte die Kristallisation mit Rhodesain erfolgen, um die erste R{\"o}ntgenstruktur eines Enzym-Aziridin-Inhibitor-Komplexes zu erhalten. Dieses Ziel konnte jedoch nicht realisiert werden. Aufgrund fehlender R{\"o}ntgenstrukturen von Enzym-Inhibitor-Komplexen ist die Bindung der synthetisierten Inhibitoren noch immer spekulativ. Dockingstudien an Cruzain schlagen verschiedene Bindemodi vor, bei denen zwei von drei lipophilen Resten die hydrophoben S2- und S1´-Bindungstaschen adressieren. Die Mehrzahl der Aziridin-basierten Verbindungen konnte als leishmanizide und/oder trypanozide Verbindungen identifiziert werden. Mithilfe eines Biotin-markierten Derivats von RV122C (CS39) konnte durch active-site labeling nachgewiesen werden, dass Cystein-Proteasen von L.-major-Promastigoten die Targets des Inhibitors sind. Active-site-labeling und Untersuchungen durch Fluoreszenzaktivit{\"a}tsassays mit L.-major-Promastigotenlysaten machten deutlich, dass bei Einsatz von RV122C und RV212C Cathepsin-B-{\"a}hnliche Proteasen beeinflusst werden. CS09 wies einen anderen Wirkmechanismus - {\"a}hnlich dem von E-64 - auf, wie Fluoreszenzaktivit{\"a}tsassays zeigten. Hinsichtlich der Aufkl{\"a}rung dieser zellul{\"a}ren Effekte und zur Identifizierung weiterer m{\"o}glicher Targets wurde ein Fluoreszenzfarbstoff-markierter Aziridin-Inhibitor (CS40) dargestellt. CS40 wies hervorragende Hemmeigenschaften an den isolierten Enzymen auf, war jedoch f{\"u}r In-vitro-Untersuchungen ungeeignet, da weder leishmanizide noch trypanozide Aktivit{\"a}t vorlagen. Durch antiplasmodiale Wirkung ist CS40 lediglich zu In-vitro-Studien an Plasmodien einsetzbar. F{\"u}r In-vitro-Studien wurde zur Aufkl{\"a}rung des Wirkmechanismus der Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren der literaturbekannte, f{\"u}r Cathepsin-L-{\"a}hnliche Enzyme selektive, Epoxid-basierte Standardinhibitor CLIK-148 als Vergleichssubstanz dargestellt. Zum Beweis der Inaktivit{\"a}t des Diastereomers von CLIK-148 mit (R,R)-konfiguriertem Epoxidring wurde zudem das Derivat CS41 synthetisiert. Die Synthese hierzu erfolgte zun{\"a}chst {\"u}ber die stereoselektive Darstellung der trans-konfigurierten Diethyloxiran-2,3-dicarboxylate, die nach Verseifung der Ethylesterfunktionen mittels Peptidkupplungsreagezien mit den entsprechenden Aminen gekuppelt wurden. Zur Ableitung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Michael-Akzeptor-basierten Verbindungen wurde die Leitstruktur 16a durch Variation der Konfigurationen sowie durch Substitution der Trityl-Schutzgruppe der Glutaminseitenkette durch sterisch weniger anspruchsvolle Schutzgruppen ver{\"a}ndert. Die Synthese erfolgte ausgehend von der Darstellung des entsprechenden Dipeptids mit Methylesterschutzgruppen. Ausgehend davon wurden die Methylesterreste entweder mit DIBAL zum entsprechenden Aldehyd reduziert oder aus Gr{\"u}nden der Praktikabilit{\"a}t zum entsprechenden Alkohol reduziert, um anschließend in einer Swern-Oxidation den Aldehyd zu liefern. Die Aldehyde wurden im finalen Schritt in einer Masamune-Reaktion mit Triethylphosphonoacetat zu den vinylogen Dipeptidestern umgesetzt. Die Stereoisomere CS42 und CS43 mit Tritylresten an der Glutaminseitenkette sind unspezifische, starke Inhibitoren humaner und parasit{\"a}rer Enzyme. In vitro zeigten sie starke Hemmung des Parasiten-Wachstums als auch Cytotoxizit{\"a}t an Makrophagen. Die Verbindungen ohne Tritylrest (CS44, CS45) erwiesen sich weder als Proteaseinhibitoren, noch in vitro als wirksam. Ferner wurden mit den synthetisierten Verbindungen in interdisziplin{\"a}ren Kooperationen weitere biologische Testungen durchgef{\"u}hrt. In Selektivit{\"a}tsstudien an den Aspartat-Proteasen Plasmepsin II und IV erwiesen sich die getesteten trans-konfigurierten Aziridin-basierten Inhibitoren als inaktiv, w{\"a}hrend die Leitstruktur der Michael-Akzeptor-basierten Inhibitoren 16a sowie deren Distereomer CS42 (= 16b) als Inhibitoren von Plasmepsin IV identifiziert werden konnten. Weder in Testungen an Plasmodium berghei infizierten humanen Hepatomzellen in Leberstadien, noch im Blut-Hirn-Schrankenmodell einer Trypanosoma-brucei-gambiense-Infektion sowie im In-vitro-Screening an Trichomonas vaginalis zeigten die jeweils getesteten Verbindungen Aktivit{\"a}t. Allein die Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Cystein-Protease-Inhibitoren wiesen Wirksamkeit bez{\"u}glich des Wachstums von Schistosoma mansoni auf. In einem visuellen Ph{\"a}notyp-Screening inhibierte eine Vielzahl der getesteten Verbidungen das Wachstum der jungen Form (Schistosomula), im zweiten Schritts des In-vitro-Screenings zeigte sich jedoch keine Verbindung aktiv an der adulten Form (Schistosomen) des Parasiten.},
subject = {Proteaseinhibitor},
language = {de}
}