@phdthesis{Siegl2009,
  author    = {Siegl, Alexander},
  title     = {Einzelzell-basierte Methoden zur Charakterisierung Schwamm-assoziierter Bakterien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37443},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Schw{\"a}mme (Phylum Porifera) sind der {\"a}lteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die H{\"a}lfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexit{\"a}t des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schw{\"a}mmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, f{\"u}r das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellul{\"a}ren Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-{\"a}hnlichen intrazellul{\"a}ren Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abh{\"a}ngige, als auch kultivierungs-unabh{\"a}ngige Versuchsans{\"a}tze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. W{\"a}hrend auf dem ‚dilution-to-extinction'-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur f{\"u}hrten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications') umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazit{\"a}ten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabh{\"a}ngigen Methode eine spezifische Verkn{\"u}pfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schw{\"a}mmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gew{\"a}hrte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekund{\"a}rmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms f{\"u}hrte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information {\"u}ber diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen {\"u}ber den poribakteriellen Prim{\"a}r- und Sekund{\"a}rstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und best{\"a}tigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenit{\"a}t innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von m{\"o}glichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis f{\"u}r eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schw{\"a}mmen vorzufinden sind. Dieser Studie gew{\"a}hrte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterf{\"u}hrende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.},
  subject      = {Genomik},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Fieseler2005,
  author    = {Fieseler, Lars},
  title     = {Entdeckung des neuen Candidatus Phylums Poribacteria},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13283},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Marine Schw{\"a}mme (Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60\% von assoziierten Mikroorganismen gebildet werden kann. Dieses mikrobielle Konsortium ist phylogenetisch komplex, die monophyletischen Abstammungslinien sind hochgradig wirtsspezifisch und bisher konnte kein Vertreter dieser Mikroflora kultiviert werden. In seiner Zusammensetzung unterscheidet sich dieses Konsortium sowohl von der Mikroflora mariner Sedimente, als auch vom marinen Bakterioplankton. Durch 16S rRNA Sequenzanalysen und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) konnte w{\"a}hrend dieser Arbeit das neue Candidatus Phylum Poribacteria kultivierungsunabh{\"a}ngig identifiziert werden. Poribacteria bilden definitionsgem{\"a}ß ein unabh{\"a}ngiges Candidatus Phylum, da sie weniger als 75\% Sequenzhomologie innerhalb der 16S rRNA zu anderen prokaryontischen Phyla zeigen. Sie sind verwandt mit Planctomycetes. Der Name „Poribacteria" wurde gew{\"a}hlt, da diese Organismen spezifisch mit marinen Porifera assoziiert zu sein scheinen. Bisher konnten Poribacteria in Porifera der Ordnungen Verongida, Haplosclerida und Lithistida nachgewiesen werden, w{\"a}hrend sie in den Ordnungen Poecilosclerida, Agelasida, Halichondrida und Hadromerida nicht nachweisbar waren. Im marinen Sediment und im Bakterioplankton wurden Poribacteria ebenfalls nicht detektiert. Durch FISH Analysen wurde deutlich, dass Poribacteria in A. aerophoba (Verongida) eine abundante Fraktion der assoziierten Mikroflora bilden. Da Vertreter des mikrobiellen Konsortiums mariner Schw{\"a}mme bisher nicht kultiviert werden konnten, wurde das „Metagenom" dieser Mikroorganismen durch die ex situ Isolierung hoch molekularer DNA direkt kloniert. Eine Charakterisierung von Metagenomen erlaubt unabh{\"a}ngig von der Kultivierbarkeit der entsprechenden Organismen direkte Einblicke in deren Genotyp und liefert so eine erste Verbindung zwischen phylogenetischer Diversit{\"a}t und physiologischen Eigenschaften. F{\"u}r die Erstellung der Metagenombank wurde mikrobielle Biomasse aus A. aerophoba vom Mesohyl getrennt und lysiert und die gereinigte DNA in Fosmid Vektoren in E. coli kloniert. Die resultierende Metagenombank APAE02 umfasst ca. 1,1 Gb hoch molekularer prokaryontischer genomischer DNA. Eine Bestimmung der in dieser Metagenombank archivierten mikrobiellen Diversit{\"a}t lieferte zus{\"a}tzlich zu bekannten 16S rRNA kodierenden Loci aus Cyanobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria und Gammaproteobacteria einen 16S rRNA kodierenden poribakteriellen Fosmidklon. Die Annotation der flankierenden genomischen Regionen des 16S rRNA Gens f{\"u}hrte zur Detektion eines unterbrochenen rrn Operons, eines wahrscheinlich neuen Transporters, einer neuen Molybd{\"a}n enthaltenen Oxidoreduktase und orthologer „open reading frames" (ORFs) aus Rhodopirellula baltica (Planctomycetes) in Poribacteria. Die Charakterisierung dieses 38,7 kb DNA Fragmentes stellt die Basis f{\"u}r weitere genomische Untersuchungen an Poribacteria dar. Metagenombanken repr{\"a}sentieren eine reichhaltige Quelle zum Nachweis neuer Enzyme oder Biosyntheseoperons. Somit konnten in der Metagenombank APAE02 neuartige Typ I Polyketidsynthasen (PKS) nachgewiesen werden. Phylogenetische Analysen der Ketosynthasedom{\"a}ne zeigten, dass diese Systeme nicht herk{\"o}mmlichen Typ I cis-AT bzw. trans-AT (Acyltransferase) PKS Systemen zugeordnet werden k{\"o}nnen. Die kodierenden Bereiche der PKS Systeme sind mit nur ca. 10 kb relativ klein. Im Gegensatz zu der Organisation sich wiederholender multipler Module herk{\"o}mmlicher PKS Typ I Systeme bestehen sie nur aus einem einzigen Modul und k{\"o}nnten vermutlich bei der Synthese von Fetts{\"a}uren beteiligt sein. Die Struktur und Funktion der Produkte ist bisher unbekannt. Generell ist durch in silico Analysen eine Abbildung des „funktionellen Repertoires" unkultivierter Mikroorganismen m{\"o}glich. Es w{\"a}re denkbar, dass durch weitere Studien fundierte Einblicke in den Genpool der Poribacteria und anderer Organismen des mikrobiellen Konsortiums aus Poriferen er{\"o}ffnet werden, um metabolische Eigenschaften zu rekonstruieren und die Mechanismen zur Interaktion mit dem Wirt verstehen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Schw{\"a}mme},
  language  = {de}
}