@phdthesis{Schenkhoff2007,
  author    = {Schenkhoff, Felix Stephan},
  title     = {Herstellung und Charakterisierung multifunktioneller Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen Fas-Liganden und des membranst{\"a}ndigen CD40-Liganden},
  isbn      = {xxx},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25978},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {TNF-Liganden liegen prim{\"a}r in membranst{\"a}ndiger Form mit trimerer Struktur vor und die meisten von ihnen k{\"o}nnen sekund{\"a}r durch Metalloproteasen in l{\"o}sliche trimere Liganden prozessiert werden. W{\"a}hrend membranst{\"a}ndige Formen der TNF-Liganden ihre korrespondierenden Rezeptoren aktivieren k{\"o}nnen, sind die l{\"o}slichen Varianten einzelner TNF-Liganden unterschiedlich aktiv beziehungsweise inaktiv an den korrespondierenden Rezeptoren, obwohl sie ebenfalls zur Bindung in der Lage sind. Dies konnte bereits in Studien f{\"u}r TNF und TRAIL gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen l{\"o}slichen Varianten und der membranst{\"a}ndigen Form des Liganden betreffen sowohl die Rezeptorselektivit{\"a}t als auch den Aktivierungsgrad am Rezeptor bis hin zu v{\"o}lliger Inaktivit{\"a}t der l{\"o}slichen Form. Unterschiede finden sich jedoch nicht nur hinsichtlich der Aktivit{\"a}t, sondern auch in der Interaktion des Liganden mit dem Rezeptor. F{\"u}r die membranst{\"a}ndige und die l{\"o}sliche Form von FasL konnten Unterschiede in der Notwendigkeit intrazellul{\"a}rer Signalmolek{\"u}le bei der Ausbildung Ligand-induzierter Rezeptorsignalcluster gezeigt werden. F{\"u}r die l{\"o}sliche und membranst{\"a}ndige Form des CD40L werden eine unterschiedliche Rezeptorinternalisierung und eine unterschiedliche Rekrutierung von TRAF-Molek{\"u}len angenommen. Bisherige Arbeiten zur Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion st{\"u}tzen sich meist auf l{\"o}sliche Varianten von TNF-Liganden, die durch artifizielle Multimerisierung oder Antik{\"o}rper-induzierte Quervernetzung sekund{\"a}r aktiviert werden m{\"u}ssen. Um f{\"u}r die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion in Zukunft realit{\"a}tsn{\"a}here Bedingungen zu schaffen, sollten im Rahmen dieser Arbeit multifunktionelle Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen FasL und CD40L hergestellt und charakterisiert werden. Die Fusionsproteine wurden im Rahmen der Klonierung so konstruiert, dass von der aminoterminalen Seite beginnend eine GST-Dom{\"a}ne, ein Flag-Tag, ein YFP-Tag und abschließend die vollst{\"a}ndige membranst{\"a}ndige Form des Liganden (FasL oder CD40L) aneinander gef{\"u}gt wurden. In FACS-Analysen konnte sowohl die Funktion des YFP-Tag als auch die korrekte Expression des Liganden an der Zelloberfl{\"a}che durch spezifische Antik{\"o}rperf{\"a}rbung nachgewiesen werden. Die funktionelle Aktivit{\"a}t der Liganden wurde durch IL-8-Induktion gezeigt, die eine Aktivierung des NF\&\#61547;B-Signalweges durch die GST-Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen FasL und des membranst{\"a}ndigen CD40L beweist. Im Rahmen von Immunopr{\"a}zipitationen wurde die M{\"o}glichkeit der Detektion der Fusionsproteine {\"u}ber ihr Flag-Tag getestet. F{\"u}r das in GST-pull-down-Assays genauer untersuchte membranst{\"a}ndige GST-Flag-YFP-CD40L-Fusionsprotein gelang eine Koimmunopr{\"a}zipitation mit dem im Rezeptorkomplex gebundenen TRAF2. F{\"u}r dieses in der Signaltransduktion des CD40 entscheidende Molek{\"u}l konnte seine transiente Interaktion mit dem Rezeptorsignalkomplex sowie eine Ver{\"a}nderung in der Assoziation an den Rezeptor durch TNF-abh{\"a}ngige TRAF1-Induktion gezeigt werden. Im Zusammenhang der mit der Rezeptoraktivierung oftmals gleichgesetzten Bildung von Rezeptorsignalclustern durch den entsprechenden TNF-Liganden war die Beobachtung interessant, dass das Konstrukt GST-Flag-YFP-CD40L im Gegensatz zum analog konstruierten GST-Flag-YFP-FasL nicht in der Lage war, Signalcluster des korrespondierenden Rezeptors zu erzeugen, aber dennoch f{\"a}hig war, eine Rezeptoraktivierung zu bewirken. Hinsichtlich der Untersuchung von Unterschieden in der Rezeptor-Ligand-Interaktion von l{\"o}slichen und membranst{\"a}ndigen Formen sind f{\"u}r FasL und CD40L noch viele Fragen offen, die beispielsweise auch die Stabilit{\"a}t von Rezeptorsignalclustern betreffen. Die in dieser Arbeit erzeugten und charakterisierten multifunktionellen Fusionsproteine sollten helfen, neue Erkenntnisse bez{\"u}glich der molekularen Grundlagen der Rezeptor-Ligand-Interaktion zu erzielen.},
  subject      = {Tumor-Necrose-Faktor},
  language  = {de}
}