@phdthesis{Scheurer2022, author = {Scheurer, Mario Joachim Johannes}, title = {Inhibitoren des NF-kappaB pathways zur in vitro Blockade der Inflammation und proapoptotischen Sensitivierung des oralen Plattenepithelkarzinoms f{\"u}r den prospektiven Einsatz in der Tumortherapie}, doi = {10.25972/OPUS-27152}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-271521}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {Entz{\"u}ndliche Prozesse stellen einen zentralen Aspekt der Karzinogenese dar und k{\"o}nnen sowohl zur Induktion als auch zum Progress von Tumoren beitragen. Der NF-kB-Signalweg ist einer der wichtigsten Signaltransduktionswege der In- flammation und Tumorpromotion, was ihn zur plausiblen Zielstruktur f{\"u}r die pros- pektive klinische Tumortherapie machen k{\"o}nnte. In der vorliegenden Arbeit wur- den die Eigenschaften von vier unterschiedlich targetierenden NF-kB-pathway- Inhibitoren - Cortisol, MLN4924, QNZ und TPCA1 - auf die Inflammation, Zell- proliferation und proapoptotische Sensitivierung am in vitro Modell des HNSCC untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Auswahl des Inhi- bitors bzw. seines targets entscheidend f{\"u}r den wirkungsvollen Einsatz dieser Wirkstoffgruppe in der antiproliferativen Therapie des HNSCC zu sein scheint. Beispielsweise vermittelte MLN4924 die Freisetzung von IL-8. Cortisol bewirkte die Resistenz der FasL-induzierten Apoptose von HNSCC-Zellen. QNZ wirkte in einigen Zelllinien antiproliferativ und sensitivierend f{\"u}r den FasL-induzierten Zell- tod, beeinflusste jedoch in diesem Zusammenhang kontraproduktiv die IL-8-Sek- retion. Dies disqualifizierte diese Wirkstoffe f{\"u}r die Anwendung in der Therapie von Kopf-Hals-Tumoren. Dahingegen qualifizierte sich TPCA-1 aufgrund folgen- der Eigenschaften als geeigneter Wirkstoff f{\"u}r den prospektiven klinischen Ein- satz: 1) TPCA-1 wirkte antiproliferativ, 2) hemmte die TNF-a-induzierte Inflammation, 3) regulierte die IL-8-Expression herab, 4) wirkte sensitivierend f{\"u}r den TNF-a-induzierten Zelltod, 5) interferierte kaum mit der FasL-vermittelten Apoptose und 6) induzierte Apoptose.}, subject = {Plattenepithelcarcinom}, language = {de} } @phdthesis{Weber2020, author = {Weber, Judith}, title = {Immunhistochemische Analysen zur Expression von cellular FLICE (FADD-like-IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein (cFLIP) in epithelialen und melanozyt{\"a}ren Tumoren der Haut}, doi = {10.25972/OPUS-20991}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-209918}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Die Resistenz von Tumorzellen gegen{\"u}ber Apoptose stellt einen zentralen Baustein in der Pathogenese von Tumorerkrankungen dar. cFLIP inhibiert rezeptornah die Todesrezeptor-vermittelte Apoptose und spielt somit eine bedeutende Rolle als Regulator der Apoptose. Eine verst{\"a}rkte Expression von cFLIP kann folglich hinweisend auf eine Fehlregulation der Apoptose bei der Entstehung und Progression von Tumoren sein. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von cFLIP in kutanen epithelialen und melanozyt{\"a}ren Tumoren mit formalinfixierten und paraffinierten Gewebeproben untersucht. Bei der zun{\"a}chst durchgef{\"u}hrten Charakterisierung der k{\"a}uflich erh{\"a}ltlichen monoklonalen cFLIP-Antik{\"o}rper mittels cFLIP-{\"u}berexprimierenden HaCaT-Keratinozyten wurde {\"u}berraschenderweise die fehlende Spezifit{\"a}t eines Antik{\"o}rpers (KlonEPR8438(2)) nachgewiesen, was zur Folge hatte, dass der Hersteller die Produktion nach Mitteilung der Befunde eingestellt hat. Daher wurden die weiteren Untersuchungen unter Verwendung des Antik{\"o}rper-Klons G11, der sowohl im Western Blot als auch immunhistochemisch die beiden cFLIP-Splicevarianten cFLIPL und cFLIPS spezifisch nachweist, durchgef{\"u}hrt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass cFLIP in epithelialen Hauttumoren in erheblichem Maß exprimiert wird. In jeweils 40\% der untersuchten aktinischen Keratosen und Morbi Bowen konnte cFLIP nachgewiesen werden. Im Vergleich dazu zeigte sich in den fortgeschrittenen Formen epithelialer Hauttumoren eine deutlich h{\"o}here Expressionsrate. Eine Expression wiesen zudem 100\% der untersuchten Keratoakanthome und 95\% der Plattenepithelkarzinome (mit {\"u}berwiegend gutem Differenzierungsgrad) auf. Dementsprechend war es nicht verwunderlich, dass alle untersuchten Metastasen von Plattenepithelkarzinomen cFLIP {\"u}berexprimierten. Die Analyse melanozyt{\"a}rer L{\"a}sionen ergab, dass cFLIP in melanozyt{\"a}ren N{\"a}vi wie auch superfiziell spreitenden Melanomen, Lentigo-maligna-Melanomen und akral lentigin{\"o}sen Melanomen nur in einer sehr geringen Anzahl der untersuchten Pr{\"a}parate {\"u}berexprimiert wurde. Erstaunlicherweise konnte jedoch in 65\% der nodul{\"a}ren Melanome sowie in 60\% der Melanommetastasen cFLIP nachgewiesen werden. Bez{\"u}glich der Expression von cFLIP im Prim{\"a}rtumor sowie der Metastase desselben Patienten konnte kein eindeutiger Trend festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die fr{\"u}he Hemmung des extrinsischen Apoptoseweges durch das antiapoptotische Protein cFLIP an der Entstehung, dem Wachstum und m{\"o}glicherweise der Metastasierung epithelialer Hauttumore beteiligt sein d{\"u}rfte. Die auffallend hohe Expressionsrate im nodul{\"a}ren Melanom sowie den untersuchten Melanommetastasen k{\"o}nnte einen zuk{\"u}nftigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen.}, subject = {Melanom}, language = {de} } @phdthesis{DeDonno2020, author = {De Donno, Francesco}, title = {Tyrosinkinaseinhibitoren in der Therapie des oralen Plattenepithelkarzinoms - In vitro Evaluation zur Wirksamkeit von Afatinib, Volasertib und Nintedanib in Kombination mit Cisplatin und SMAC-Mimetics}, doi = {10.25972/OPUS-21157}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-211574}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Mit einer weltweiten Inzidenz von etwa 600.000 Neuerkrankten pro Jahr geh{\"o}rt das orale Plattenepithelkarzinom zu den sechs h{\"a}ufigsten malignen Tumorerkrankungen des Menschen. Zur Behandlung operabler Tumoren der Stadien III-IVb hat sich hingegen die multimodale Therapie mit prim{\"a}r operativem Vorgehen, gegebenenfalls mit nachfolgender adjuvanter Radiatio beziehungsweise Radiochemotherapie, etabliert. Beim Vorhandensein von Fernmetastasen hingegen ist das Therapiekonzept als palliativ einzustufen. W{\"a}hrend sich f{\"u}r die adjuvante, kurativ intendierte Radiochemotherapie die Verwendung von Cisplatin oder cisplatinhaltiger Wirkstoffe etabliert hat, stellen seit einigen Jahren selektive Wirkstoffe wie Nivolumab und Cetuximab eine Alternative zur Cisplatin-Anwendung im palliativen Setting dar. F{\"u}r die medikament{\"o}se Therapie des fortgeschrittenen oralen Plattenepithelkarzinoms scheinen daher neue rationale Therapieans{\"a}tze notwendig zu sein. Besonders ein hohes Maß an Toxizit{\"a}t sowie die individuelle Resistenzbildung verm{\"o}gen den Therapieerfolg der herk{\"o}mmlichen Chemotherapie zu kompromittieren. Spezifisch wirksame sogenannte "targeted agents" binden RTK und blockieren somit die nachgeschaltete Signalkaskade. In der vorliegenden Studie kam es zur Anwendung der TKI Afatinib, Volasertib und Nintedanib in alleiniger Anwendung sowie Kombinationstherapie mit Cisplatin und dem Smac-mimetic LCL-161. Die Analyse der Wirksamkeit oben genannter Stoffe erfolgte durch eine In-vitro-Evaluation an f{\"u}nf Zelllinien des humanen Plattenepithelkarzinoms der Kopf- und Halsregion. Nach semiquantitativem Expressionsnachweis der Zielstrukturen erfolgte die Stimulation der Zellen mittels spezifischer Verd{\"u}nnungsreihen in Mono- und Kombinationstherapie. Folgend wurden auf der Basis von Zellzahlanalysen, Kristallviolettassays und der Erstellung von Dosis-Wirkungskurven zelllinienspezifische IC50- beziehungsweise IC20-Werte ermittelt, statistisch ausgewertet und miteinander verglichen. Die Anwendung von Afatinib in Monotherapie zeigte in der vorliegenden Studie keine signifikant erh{\"o}hte Zytoreduktion im Vergleich zur alleinigen Anwendung von Cisplatin. Auch ein Zusatz von Cisplatin zur Anwendung ergab keinen erwarteten synergistischen Effekt. Die Anwendung von Nintedanib in Monotherapie zeigte in der Analyse keine signifikanten Vorteile gegen{\"u}ber einer alleinigen Cisplatinanwendung. Auf der Basis der Ergebnisse der vorausgegangenen Expressionsanalysen scheint der FGFR-2 eine {\"u}bergeordnete Rolle zu spielen, da hier partiell von einer verst{\"a}rkten Wirksamkeit auszugehen ist. Weiterhin scheint gegen{\"u}ber selektiven Angiogeneseinhibitoren kein Vorteil f{\"u}r Nintedanib zu bestehen. Betrachtet man die Kombinationsanwendung von Nintedanib mit Cisplatin so fallen sowohl synergistische wie auch partiell antagonistische Effekte im Vergleich zur Cisplatin-Monotherapie auf. Diese k{\"o}nnen durch die heterogene Expression der Zielstrukturen allein nicht erkl{\"a}rt werden, sodass hier weiterf{\"u}hrende Untersuchungen sinnvoll w{\"a}ren. Bei der Anwendung von Volasertib konnte f{\"u}r alle Zelllinien eine sehr deutliche Zytoreduktion erzielt werden, was durch generell erh{\"o}hte Expressionsraten erkl{\"a}rbar scheint. Sie manifestierte sich zudem in deutlich erniedrigten mittleren inhibitorischen Konzentrationen der Monotherapie gegen{\"u}ber einer alleinigen Cisplatin-Anwendung. Betrachtet man die Kombinationsanwendung von Volasertib mit Cisplatin imponierten f{\"u}r alle Zelllinien erstaunlicherweise sogar schlechtere Ansprechraten verglichen mit der Volasertib-Monotherapie. Hier k{\"o}nnte man von einer inhibierenden Wechselwirkung der Wirkstoffe ausgehen. Diese Tatsache macht weiterf{\"u}hrende Untersuchung zur Anwendung von Volasertib in Monotherapie attraktiver als die jeweilige Kombinationsanwendung. Die Kombinationsanwendungen von LCL-161 mit Afatinib beziehungsweise Volasertib wiesen keine signifikant erh{\"o}hten zytoreduktiven Effekte auf. Hingegen waren die Untersuchungsergebnisse der Kombinationsanwendung des verwendeten Smac-Analogons und Nintedanib bemerkenswert. In vier von f{\"u}nf Zelllinien sorgte ein LCL-161-Zusatz f{\"u}r eine signifikant erh{\"o}hte Zytoreduktion. Eine zus{\"a}tzlich zur Angiogeneseinhibition durch Nintedanib induzierte Apoptoseinduktion in Kombination mit der Apoptosesensibilisierung durch LCL-161 k{\"o}nnte eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung dieser Beobachtung darstellen. Aufgrund der sehr heterogenen Ergebnisse dieser Studie mit partiell synergistischen aber auch antagonistischen Effekten l{\"a}sst sich schlussfolgern, dass alle drei verwendeten TKI aktuell keine vielversprechende Alternative zu der herk{\"o}mmlichen Chemotherapie darstellen. Diese Heterogenit{\"a}t verdeutlicht auch, dass die Suche nach individuellen, zielgerichteten medikament{\"o}sen Therapieans{\"a}tzen essenziell bleibt. Hierbei k{\"o}nnten Smac-Analoge ein vielversprechendes Feld weiterf{\"u}hrender experimenteller und klinischer Studien er{\"o}ffnen.}, subject = {Tyrosinkinaseinhibitoren}, language = {de} } @phdthesis{Glaeser2017, author = {Gl{\"a}ser, Katharina}, title = {Einfluss hochfrequenter Felder des Mobilfunks auf das blutbildende System in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-145733}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Elektromagnetische Felder (EMF) sind in der Umwelt des Menschen allgegenw{\"a}rtig. Unter Verwendung unterschiedlicher Frequenzen bilden sie die Grundlage zahlreicher Technologien und begegnen uns im Alltag in einer Vielzahl von Anwendungen. Eine sehr wichtige Anwendung von EMF ist die mobile Kommunikation. Die hierf{\"u}r verwendeten Frequenzen liegen im hochfrequenten Bereich und variieren mit dem Mobilfunkstandard. Weit verbreitet ist die GSM- und UMTS-Modulation der zweiten (2G) und dritten Generation (3G). Zum neuesten Mobilfunkstandard z{\"a}hlt LTE (4G). Aus statistischen Daten geht hervor, dass derzeit weltweit mehr als sieben Milliarden Mobilfunk-Endger{\"a}te existieren. Die weitverbreitete und stetig ansteigende Verwendung dieser Technologien verdeutlicht, dass viele Menschen, darunter auch zunehmend Kinder und Jugendliche, regelm{\"a}ßig einer Exposition gegen{\"u}ber EMF ausgesetzt sind. Die wichtigste Expositionsquelle stellt dabei das Mobiltelefon dar, da sich in diesem Szenario die Quelle sehr nah am menschlichen K{\"o}rper befindet. In der Vergangenheit wurden zahlreiche in-vitro- und in-vivo-Untersuchungen sowie epidemiologische Studien durchgef{\"u}hrt, um potentielle, nicht-thermische Effekte von Mobilfunkstrahlung auf biologische Systeme beurteilen zu k{\"o}nnen. Ein vollst{\"a}ndiger Konsens konnte auf der Basis der erhaltenen Ergebnisse jedoch nicht erzielt werden, sodass weiterhin Bedenken zum sch{\"a}dlichen Potential dieser nichtionisierenden Strahlung bestehen. Insbesondere wurden Fragestellungen zu Langzeiteffekten sowie zu Effekten, die speziell bei Kindern eine besondere Rolle spielen, bisher nicht ausreichend adressiert. Kinder k{\"o}nnen empfindlicher auf Umwelteinfl{\"u}sse reagieren und sind im Vergleich zu Erwachsenen teilweise h{\"o}her gegen{\"u}ber EMF exponiert. Dies gilt vor allem f{\"u}r Kopfregionen, in denen sich das aktive, f{\"u}r die H{\"a}matopoese verantwortliche Knochenmark befindet. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, den Einfluss von Mobilfunkstrahlung auf das humane blutbildende System zu untersuchen. Im Fokus standen dabei humane h{\"a}matopoetische Stammzellen, die mit Frequenzen der Mobilfunkstandards GSM (900 MHz), UMTS (1.950 MHz) und LTE (2.535 MHz) jeweils {\"u}ber einen kurzen (4 h) und einen langen (20 h) Zeitraum und mit unterschiedlichen Intensit{\"a}ten (0 W/kg, 0,5 W/kg, 1 W/kg, 2 W/kg und 4 W/kg) exponiert wurden. Vergleichende Experimente erfolgten mit Zellen der Promyelozyten-Zelllinie HL-60. M{\"o}gliche Effekte wurden mit den Endpunkten Apoptose, oxidativer Stress, Zellzyklus, DNA-Schaden und -Reparatur sowie Differenzierung und Epigenetik in Form von Histonacetylierung bewertet. In keinem der genannten Endpunkte konnten klare Effekte durch Mobilfunkstrahlung ausgemacht werden, weder f{\"u}r die h{\"a}matopoetischen Stammzellen, noch f{\"u}r die Zelllinie HL-60. Die einzige Ver{\"a}nderung wurde bei der Quantifizierung von DNA-Sch{\"a}den beobachtet. Hier zeigte sich nach der Kurzzeitexposition der Stammzellen mit der Modulation GSM eine kleine, aber statistisch signifikante Abnahme der DNA-Sch{\"a}den verglichen mit der Scheinexposition. Diese Beobachtung ließ sich in weiteren Replikaten jedoch nicht reproduzieren und wurde daher als nicht biologisch relevant eingestuft. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch Mobilfunkstrahlung mit Frequenzen der verbreiteten Modulationen GSM, UMTS und LTE sowie SAR-Werten, die unterhalb und oberhalb des empfohlenen Sicherheitsstandards liegen und typischerweise bei Handytelefonaten auftreten, keine Effekte in Zellen des blutbildenden Systems unter den gegebenen Versuchsbedingungen induziert wurden. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Weiterhin wurden zum ersten Mal humane h{\"a}matopoetische Stammzellen f{\"u}r derartige Untersuchungen eingesetzt. Dies hat insofern eine besondere Bedeutung, als h{\"a}matopoetische Stammzellen aufgrund ihrer multipotenten Eigenschaften eine breitere Analyse mit Hinblick auf die Kanzerogenese und auf das Immunsystem erm{\"o}glichen. Um {\"u}ber die Mobilfunk-Untersuchungen hinaus die h{\"a}matopoetischen Stammzellen besser charakterisieren zu k{\"o}nnen, sowie die Sensitivit{\"a}t von Blutzellen mit unterschiedlichem Differenzierungsstatus zu analysieren, wurden sie anderen Zellen des blutbildenden Systems (undifferenzierte und differenzierte HL-60-Zellen und TK6-Zellen) gegen{\"u}bergestellt. Eine Behandlung der verschiedenen Zelltypen mit mutagenen Substanzen zeigte, dass sich die h{\"a}matopoetischen Stammzellen in den meisten der untersuchten Endpunkte von den Zelllinien unterschieden. Deutliche Abweichungen zeigten sich beim oxidativen Stress, der DNA-Reparatur und der Histonacetylierung; kein Unterschied konnte dagegen bei den DNA-Sch{\"a}den beobachtet werden. Eine erste Interpretation der erhaltenen Ergebnisse ist auf der Grundlage der unterschiedlichen Eigenschaften von Zellen mit abweichendem Differenzierungsstatus m{\"o}glich. Um jedoch eine eindeutige Aussage treffen zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssten noch weitere Untersuchungen durchgef{\"u}hrt werden.}, subject = {Mobilfunk}, language = {de} } @phdthesis{Wiese2015, author = {Wiese, Katrin Evelyn}, title = {Sensing supraphysiological levels of MYC : mechanisms of MIZ1-dependent MYC-induced Apoptosis in Mammary Epithelial Cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-132532}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Deregulated MYC expression contributes to cellular transformation as well as progression and maintenance of human tumours. Interestingly, in the absence of additional genetic alterations, potentially oncogenic levels of MYC sensitise cells to a variety of apoptotic stimuli. Hence, MYC-induced apoptosis has long been recognised as a major barrier against cancer development. However, it is largely unknown how cells discriminate physiological from supraphysiological levels of MYC in order to execute an appropriate biological response. The experiments described in this thesis demonstrate that induction of apoptosis in mammary epithelial cells depends on the repressive actions of MYC/MIZ1 complexes. Analysis of gene expression profiles and ChIP-sequencing experiments reveals that high levels of MYC are required to invade low-affinity binding sites and repress target genes of the serum response factor SRF. These genes are involved in cytoskeletal dynamics as well as cell adhesion processes and are likely needed to transmit survival signals to the AKT kinase. Restoration of SRF activity rescues MIZ1- dependent gene repression and increases AKT phosphorylation and downstream function. Collectively, these results indicate that association with MIZ1 leads to an expansion of MYC's transcriptional response that allows sensing of oncogenic levels, which points towards a tumour-suppressive role for the MYC/MIZ1 complex in epithelial cells.}, subject = {Myc}, language = {en} } @phdthesis{Karl2015, author = {Karl, Ingolf}, title = {Die Bedeutung von TRAF2 bei TRAIL-induzierter Apoptose und Nekroptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-114506}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Die vorliegende Arbeit behandelt TRAIL-induzierte Apoptose und Nekroptose in verschiedenen Zelllinien. Im Speziellen wurden die verschiedenen Funktionen des TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2) untersucht. Hierzu wurde ein transienter Knockdown etabliert und dessen Wirkung auf die Suszeptibilit{\"a}t der Zellen gegen{\"u}ber dem Zytokin TRAIL untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von TRAF2 nicht nur zur Sensitivierung f{\"u}r Apoptose f{\"u}hrt, sondern auch in Nekroptose-kompetenten Zellen zu einer Verst{\"a}rkung der durch Caspaseinhibition mittels zVAD-fmk nach TRAIL-Stimulation induzierten Nekroptose f{\"u}hrt. Mittels des Zytokins Fc-TWEAK wurde Fn14-vermittelt TRAF2 aus dem Zytosol in ein Triton X100-unl{\"o}sliches Kompartiment rekrutiert und dadurch physiologisch depletiert. Dies f{\"u}hrte zwar kaum zu gesteigerter TRAIL-abh{\"a}ngiger Apoptose, sensitivierte jedoch analog zum TRAF2-Knockdown RIP3-exprimierende Zellen f{\"u}r Nekroptose. Durch Vergleich RIP3-negativer (HeLa-Leervektor) mit RIP3-exprimierenden Zellen (HeLa RIP3, HT29, HaCaT) konnte die Essentialit{\"a}t von RIP3 f{\"u}r die Nekroptose herausgestellt werden und Einsatz des RIP1-Kinase-Inhibitors Necrostatin-1 sowie des MLKL-Inhibitors Necrosulfonamide belegte die Beteiligung der Nekroptosomkomponenten RIP1 und MLKL. Antagonismus putativen autokrinen TNFs bewies, dass es sich bei dem durch Fc-TWEAK verst{\"a}rkten Zelltod um einen direkten TRAIL-Effekt handelte und Inhibition kanonischen NFkBs durch IKK2-Inhibitor TPCA-1, dass die TRAF2-Knockdown-vermittelte Sensitivierung gegen{\"u}ber TRAIL nicht auf ver{\"a}ndertes NFkB-Signalling zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Einsatz des SMAC-Mimetikums BV6 rekapitulierte zudem stark das im TRAF2-Knockdown Gesehene und unterstrich die Bedeutung der cIAPs. Immunpr{\"a}zipitation von Caspase 8 unter nekroptotischen Bedingungen zeigte bei TRAF2-Knockdown eine Depletion von TRAF2 und cIAP1/2 sowie RIP1 und RIP3 aus dem Komplex mit Caspase 8. Insgesamt wird deutlich, dass TRAF2 einerseits antiapoptotisch wirkt als K48-Ubiquitinligase, die die Halbwertszeit aktiver Caspase 8-Komplexe determiniert und andererseits eine antinekroptotische Funktion hat, da es durch Rekrutierung von cIAP1/2 an RIP1 die TRAIL-induzierte Nekroptose verhindert, wenn die Caspasen inhibiert sind.}, subject = {Nekrose}, language = {de} } @phdthesis{Klingler2014, author = {Klingler, Barbara}, title = {Mechanismen der Todesrezeptorinduzierten JNK-Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113940}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Fas (Apo-1/CD95) ist ein Mitglied der TNF (Tumor Necrosis Factor)-Familie, dass {\"u}ber die rezeptoreigene Todesdom{\"a}ne Caspase 8-vermittelt Apoptose induzieren kann. Dies geschieht entweder auf direktem Wege durch Aktivierung von Caspase 3 oder durch die zus{\"a}tzliche, f{\"u}r den Untergang der Zellen essentiellen Stimulation des intrinsischen mitochondrialen Signalwegs. Abh{\"a}ngig von der jeweiligen Art der Apoptoseinduktion werden Zellen somit in Typ I oder Typ II unterteilt. Durch das Vorhandensein von antiapoptotischen Proteinen wie unter anderem Bcl-xL kann in Letzterem negativ regulierend auf den Signalweg eingegriffen werden (siehe Abb. 3). W{\"a}hrend der Aktivierung des Fas-Signalweges kommt es zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen JNK, p38-MAPK und ERK; dies alleine ist jedoch nicht ausreichend f{\"u}r die Induktion des Zelltodes und findet ebenfalls in apoptoseresistenten Zellen statt. Weiterhin wurde bei der Regulation entz{\"u}ndlicher Prozesse eine Beteiligung von Fas beschrieben18. Bedingt durch die hohe Dichte an Fas und seinem Liganden FasL auf T-Zellen nimmt es durch Apoptoseinduktion auf T-Zellen selbst oder deren Zielzellen indirekt auf verschiedene Formen entz{\"u}ndlicher oder immunregulatorischer Prozesse wie beispielsweise die Transplantatabstoßung Einfluss. Seit vielen Jahren ist zudem bekannt, dass durch die Aktivierung des Fas-Signalweges auch nichtapoptotische Signalwege induziert werden k{\"o}nnen. Beispielhaft hierf{\"u}r steht der NF-B-Signalweg, welcher letztendlich zur Transkription antiapoptotischer Zielgene f{\"u}hrt. Auch hierbei kommt es Caspase 8-vermittelt zur Phosphorylierung von JNK, p38-MAPK und ERK, weiterhin scheint eine Aktivierung dieses Signalweges in Zusammenhang mit einer erh{\"o}hten Produktion von Interleukin 8 zu stehen49. Im Rahmen dieser Arbeit hat sich nun gezeigt, dass die Aktivierung von Fas sowohl durch die Aktivierung von Caspase 8 als auch durch unabh{\"a}ngige Mechanismen zur Aktivierung von JNK f{\"u}hrt. Hierbei wurde durch Stimulation der apoptosesensiblen T-Zelllinie Jurkat mit dem vorvernetzten FasL die Phosphorylierung von JNK bei nativen Zellen ebenso wie mit dem Caspaseinhibitor zVAD vorbehandelnden Zellen nachgewiesen. Des Weiteren konnte in den wenig apoptosesensitiven KB-Zellen sowie in den transfizierten und somit apoptoseresistenten Colo 357 Bcl-xL Zellen ein caspaseabh{\"a}ngiger, jedoch apoptoseunabh{\"a}ngiger Signalweg zur Aktivierung von JNK nachgewiesen werden. Dieses Ph{\"a}nomen scheint vom Zelltyp abh{\"a}ngig zu sein. Die Stimulation der Colo 357 Bcl-xL Zellen f{\"u}hrte nach Vorbehandlung mit CHX, das eine Todesrezeptor-vermittelte, verst{\"a}rkte Caspase 8-Aktivierung bewirkt, zur Aktivierung von JNK, w{\"a}hrend im simultan durchgef{\"u}hrten Zytotoxizit{\"a}tsessay das {\"U}berleben der Zellen best{\"a}tigt werden konnte. Bei Zugabe des Caspaseinhibitors zVAD konnte in den Colo 357 Bcl-xL Zellen kein phosphoryliertes JNK nachgewiesen werden, w{\"a}hrend in den KB-Zellen eine Aktivierung von JNK bei reduzierter Konzentration von zVAD mit jedoch bestehendem Apoptoseschutz, graduell stattfand. Zuletzt wurde der Einfluss der JNK-Aktivierung auf die Interleukin 8 Produktion untersucht. Hierzu wurde die Interleukin 8 Produktion bei Colo 357 Bcl-xL Zellen unter Stimulation mit FasL gemessen und mit der Produktion nach Vorbehandlung mit zVAD verglichen. Hierbei zeigte sich eine unver{\"a}nderte Produktion von Interleukin 8, was einen JNK-unabh{\"a}ngigen Weg postuliert, da JNK, wie im Vorversuch gezeigt, in dieser Zelllinie durch zVAD inhibiert wird. Unter Zugabe des JNK-spezifischen Inhibitors JNKII kommt es jedoch zu einer deutlichen, aber Konzentrations-abh{\"a}ngigen Suppression der Interleukin 8 Produktion, was in direktem Widerspruch zu dem vorab bestehenden Ergebnis steht. M{\"o}glicherweise f{\"u}hrt eine erh{\"o}hte Konzentration von JNKII zu einer Hemmung zus{\"a}tzlicher Signalwege wie beispielsweise der des NF-B-Signalweges, was indirekt zu einer Beeinflussung der Interleukin 8-Produktion f{\"u}hrt. Weiterhin k{\"o}nnte eine obligat gemeinsame Aktivierung des JNK und des NF-B-Signalweges zur Interleukin 8 Produktion notwendig sein.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Scheuerlein2014, author = {Scheuerlein, Gabriele Marianne}, title = {C/EBPβ und seine proapoptotische Wirkung in murinen T-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113429}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Der Transkriptionsfaktor C/EBPβ besitzt sehr vielgestaltige Funktionen und ist an Wachstums-und Differenzierungsvorg{\"a}ngen verschiedener Gewebe beteiligt. So f{\"o}rdert es in T-Lymphozyten {\"u}ber Transaktivierung des Il4-Promotors und Repression der TH1-Zytokine IL-2 und IFN-γ die Bildung eines TH2-Ph{\"a}notyps [Berberich-Siebelt et al. 2000]. Durch Herabregulation von c-Myc bewirkt es einen Zellzyklusarrest in G1 und vermehrte Differenzierung der Zellen auch {\"u}ber eine reziproke Steigerung von Differenzierungsfaktoren wie Mad4 [Berberich-Siebelt et al. 2006]. In einer den G1-Arrest nachweisenden Zellzyklusanalyse von mit C/EBPβ transduzierten EL-4 Zellen zeigte sich daneben ein kleiner Sub-G1-Peak, der auf eine apoptotische Zellpopulation hinweist [Berberich-Siebelt et al. 2006]. Aufgabe dieser Arbeit war es, den m{\"o}glichen Zusammenhang zwischen der Aktivierung von C/EBPβ und Ausl{\"o}sung von Apoptose in EL-4 Zellen hinsichtlich seiner Spezifit{\"a}t und dabei favorisierter Signalwege zu untersuchen. Gegenstand der Untersuchungen waren mit dem C/EBPβ-ERTM-Konstrukt alleine und in Kombination mit dominant-negativen Mutanten der Caspase-3 und der Caspase-9 transduzierte EL-4 Kulturzellen. Durch Einbringen der Caspasemutanten sollte eine kompetitive Hemmung der entsprechenden endogenen Caspasen bewirkt werden. Methodisch erfolgten Apoptosenachweise mittels durchflusszytometrischer Analysen von mit Annexin V-PE und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) gef{\"a}rbten EL-4 Zellen sowie die Detektion von gespaltener PARP (Poly-ADP-Ribose-Polymerase), einem Substrat der Caspase-3 im Western Blot. Des Weiteren erfolgten mittels Ribonuklease-Protektionsanalysen Untersuchungen der RNA-Expression von Zytokinen, Caspasen und von Mitgliedern der Myc- und der Bcl-2-Proteinfamilien, um das Verhalten der Zellen unter Hemmung von Apoptosewegen bzw. Caspasen bei Aktivierung von C/EBPβ n{\"a}her betrachten zu k{\"o}nnen. In Annexin V-PE- und 7-AAD-F{\"a}rbungen sowie durch Nachweis der spezifischen Spaltung von PARP konnte gezeigt werden, dass C/EBPβ Zelluntergang und Apoptose f{\"o}rdert. Diese war durch den Pancaspaseinhibitor Z-VAD fmk hemmbar, was, wie auch die PARP-Spaltung, auf einen caspaseabh{\"a}ngigen Signalweg hinweist. Hemmung der Caspase-3 durch Transduktion der Zellen mit einer Caspase-3-Mutante besaß kaum Einfluss auf die durch C/EBPβ ver{\"a}nderte Zytokinexpression und die Repression von c-Myc, doch erschien eine vermehrte Hochregulation des Differenzierungsfaktors Mad4, der endogenen Caspase3- und der Caspase11-RNA. Die Steigerung von Caspase-3 unter Aktivierung von C/EBPβ fand sich auch auf Proteinebene. Allerdings konnte eine Hemmung der Caspase-3 bei den untersuchten EL-4 Zellen die durch C/EBPβ vermittelte Apoptose nicht verhindern, was auf andere Apoptosewege oder kompensatorischer Effekte verwies. Durch Beeinflussung des intrinsischen Signalweges mit Hemmung der Caspase-9 zeigten sich ebenfalls kaum Auswirkungen auf die Zytokinexpression der untersuchten Zellen. Hier fanden sich Hochregulationen sowohl der pro- als auch antiapoptotischen Mitglieder der Bcl-2-Familie. Funktionell konnte auch eine Hemmung von Caspase-9 die Zellen nicht vor der Apoptose durch Aktivierung von C/EBPβ bewahren. So konnte hier gezeigt werden, dass Aktivierung von C/EBPβ in den untersuchten EL-4 Zellen Apoptose f{\"o}rdern kann, dies {\"u}ber eine Aktivierung der Caspasekaskade zu geschehen scheint und mit einer Steigerung endogener Caspase-3-Expression einhergeht. Aus den Untersuchungen dieser Arbeit konnte eine Favorisierung eines bestimmten Apoptosesignalweges nicht abgeleitet werden, da eine Hemmung des intrinsischen Weges die Zellen nicht vor dem Zelltod sch{\"u}tzen konnte. Insgesamt l{\"a}sst sich aber, obwohl nicht alle Details gekl{\"a}rt werden konnten, festhalten, dass C/EBPβLAP in T-Zellen neben Proliferationshemmung und Differenzierungsinduktion auch f{\"u}r Caspase vermittelten Zelltod verantwortlich ist.}, subject = {Transkriptionsfaktor info}, language = {de} } @phdthesis{Kruempel2013, author = {Kr{\"u}mpel, Christian}, title = {Die Rolle des Multidrug Resistance Associated Protein-1 bei der Tumornekrosefaktor-α vermittelten Apoptose in Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-93681}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die endotheliale Dysfunktion stellt eine der Hauptursachen f{\"u}r die Entstehung von Atherosklerose an humanen Gef{\"a}ßw{\"a}nden dar und ist somit auch wesentlich an der Entstehung von kardiovaskul{\"a}ren Erkrankungen beteiligt. Das proinflammatorische Zytokin Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) gilt als einer der Hauptinduktoren der endothelialen Dysfunktion. Da bei der Endothelzellapoptose unter TNF-α diverse rezeptorvermittelte oxidative Prozesse innerhalb der Zelle ablaufen, sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, inwiefern das Multidrug Resistance Associated Protein-1 (MRP-1) bei diesen oxidativen Prozessen und bei der Modulation der TNF-α-Signalkaskade involviert ist.}, subject = {Tumor-Nekrose-Faktor}, language = {de} } @phdthesis{Niederlechner2013, author = {Niederlechner, Stefanie}, title = {Assessment of the basic molecular mechanisms underlying L-glutamine's cytoprotective effects after intestinal injury}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77399}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Critical illness like sepsis, shock, and intestinal bowel disease are one of the leading causes of morbidity and mortality in the US and around the world. At present, studies to define new therapeutic interventions that can protect tissues and cells against injury and attenuate inflammation are fields of intense investigation. While research over the past decade has clearly identified GLN as a vital stress substrate facilitating cellular survival following injury, the initiation steps in GLN's cytoprotective molecular mechanism still remain elusive. Previously published work suggested that stabilization of ECM proteins and activation of ECM receptor osmosignaling may play a central role in the orchestration of many cellular pathways following stress. Thus, I hypothesized that preservation of ECM protein and EGFR levels as well as ECM receptor signaling play key roles in the molecular mechanisms underlying GLN's protection against thermal injury in the intestine. I was able to confirm via Western blotting and by using silencing RNA against FN, Ntn-1, EGFR, and their negative controls, that GLN-mediated preservation of FN, Ntn-1, and EGFR levels is critical in GLN's protection against hyperthermia in IEC-6 cells. By using a selective FN-Integrin interaction inhibitor GRGDSP, its negative control peptide GRGESP, and Src-kinase inhibitor PP2, I showed that FN-Integrin signaling and Src-kinase activation are essential in GLN-mediated protection in the intestine. This applied to EGFR signaling as demonstrated using the EGFR tyrosine kinase inhibitor AG1478. In addition to GRGDSP and AG1478, ERK1/2 inhibitors PD98059 and UO126 as well as the p38MAPK inhibitor SB203580 revealed that GLN is protective by activating ERK1/2 and dephosphorylating p38MAPK via FN-Integrin and EGFR signaling. However, GLN-mediated PI3-K/Akt/Hsp70 activation seems to occur independently of FN-Integrin and EGFR signaling as indicated by Western blots as well as experiments using the PI3-K inhibitor LY294002, GRGDSP, and AG1478. The results showed that GLN activates cell survival signaling pathways via integrins as well as EGFRs after hyperthermia. Moreover, I found that GLN-mediated preservation of FN expression after HS is regulated via PI3-K signaling. Whether GLN-mediated PI3-K signaling happens simultaneously to FN-Integrin and EGFR signaling or whether PI3-K signaling coordinates FN-Integrin and EGFR signaling needs to be investigated in future studies. Further, experiments with PD98059 and GRGDSP revealed that ERK1/2 assists in mediating transactivation of HSF-1 following HS. This leads to increases in Hsp70 expression via FN-Integrin signaling, which is known to attenuate apoptosis after thermal injury. Fluorescence microscopy results indicated that HS and GLN regulate cell are size changes and the morphology of F-actin via FN-Integrin signaling. Experiments using GRGDSP and GRGESP showed that GLN enhances cellular survival via FN-Integrin signaling in a manner that does not require increased intracellular GLN concentrations (as quantified using LC-MS/MS). In summary, my thesis work gives new and potentially clinically relevant mechanistic insights into GLN-mediated molecular cell survival pathways. These results warrant clinical translation to assess if clinical outcome of critically ill patients suffering from gastrointestinal diseases can be improved by GLN treatment and/or by targeting the molecular pathways found in my studies.}, subject = {Glutamin}, language = {en} } @phdthesis{Schlegelmilch2012, author = {Schlegelmilch, Katrin}, title = {Molecular function of WISP1/CCN4 in the musculoskeletal system with special reference to apoptosis and cell survival}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73430}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.}, subject = {Knorpelzelle}, language = {en} } @phdthesis{Lang2012, author = {Lang, Isabell}, title = {Molekulare Mechanismen der CD95-Aktivierung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73339}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Die Stimulation des CD95-Todesrezeptors durch seinen nat{\"u}rlichen membranst{\"a}ndigen Li-ganden CD95L f{\"u}hrt zur kontextabh{\"a}ngigen Aktivierung von sowohl apoptotischen als auch nicht-apoptotischen Signalwegen. Durch Proteolyse wird aus dem membranst{\"a}ndigen CD95L l{\"o}slicher trimerer CD95L freigesetzt. Die Bindung von l{\"o}slichem trimerem CD95L an CD95 ist nicht ausreichend, um die CD95-Signaltransduktion effizient zu stimulieren. Die F{\"a}higkeit von l{\"o}slichen CD95L-Trimeren CD95-vermittelte Signalwege robust zu aktivieren kann jedoch durch Oligomerisierung und artifizielle Immobilisierung an eine Oberfl{\"a}che drastisch gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde zun{\"a}chst best{\"a}tigt, dass nur oligomere CD95L-Varianten, die z.B. durch Antik{\"o}rpervernetzung von N-terminal getaggten rekombinanten CD95L-Varianten oder durch eine gentechnisch erzwungene Hexamerisierung von CD95L-Molek{\"u}len erhalten wur-den, in der Lage sind, effizient apoptotische und nicht-apoptotische Signalwege zu aktivieren. Ferner zeigte sich dann, dass die Bindung von l{\"o}slichen CD95L-Trimeren nicht ausreichend ist, um die Translokation von CD95-Molek{\"u}len in detergenzunl{\"o}sliche „Lipid Raft"- Membrandom{\"a}nen zu stimulieren. Die „Lipid Raft"-Translokation ist ein zentrales Ereignis bei der CD95-Aktivierung und vor allem f{\"u}r die Induktion der Apoptose bedeutsam. Dabei ist ein selbstverst{\"a}rkender Prozess aus Caspase-8-Aktivierung und „Lipid Raft"-Assoziation des CD95 von Bedeutung. Um die Interaktion von CD95 und CD95L mit Hilfe von hoch sensitiven zellul{\"a}ren Bindungs-studien analysieren zu k{\"o}nnen, wurden in dieser Arbeit desweiteren CD95L-Fusionsproteine entwickelt und hergestellt, an welche N-terminal eine Gaussia princeps Luziferase (GpL)- Reporterdom{\"a}ne gekoppelt ist. So konnte mit den GpL-CD95L-Fusionsproteinen gezeigt werden, dass die Oligomerisierung von CD95L-Trimeren keinen Effekt auf die Ligandenbele-gung des CD95 hat. Dies spricht daf{\"u}r, dass die h{\"o}here spezifische Aktivit{\"a}t von oligomeri-sierten CD95L-Trimeren nicht auf einer Avidit{\"a}ts-vermittelten Zunahme der apparenten Affi-nit{\"a}t beruht, sondern dies deutet darauf hin, dass die sekund{\"a}re Aggregation von sich initial bildenden trimeren CD95L-CD95-Komplexen eine entscheidende Rolle in der CD95-Aktivierung spielt. Durch Scatchard-Analysen zeigte sich ferner, dass trimerer CD95L mit mindestens zwei zellul{\"a}ren Bindungsstellen unterschiedlicher Affinit{\"a}t interagiert. Bindungs-studien mit l{\"o}slichen monomeren und trimeren GpL-CD95-Rezeptoren an membranst{\"a}ndigen CD95L, als auch Inhibitionsstudien ergaben, dass trimerer CD95 weitaus besser an CD95L bindet. Dies legt nahe, dass es sich bei den zuvor beobachteten hoch- und niederaffinen Bindungsstellen f{\"u}r CD95L um monomere bzw. pr{\"a}-assemblierte CD95-Molek{\"u}le handelt. Die GpL-CD95L-Fusionsproteine wurden auch genutzt, um die CD95-Translokation in „Lipid Rafts" zu analysieren. So wurde trimerer GpL-CD95L als „Tracer" zur Markierung von inaktiven CD95-Molek{\"u}len eingesetzt. Nach Aktivierung der {\"u}brigen freien CD95-Molek{\"u}le mit hoch aktivem hexameren Fc-CD95L konnte eine Zunahme der inaktiven GpL-CD95L-markierten Rezeptoren in „Lipid Rafts" beobachtet werden. Offensichtlich stimulieren also aktivierte CD95-Molek{\"u}le in „trans" die Ko-Translokation inaktiver CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts". Dies best{\"a}tigte sich auch in Experimenten mit Transfektanten, die einen chim{\"a}ren CD40-CD95-Rezeptor exprimieren. Letzterer ist nach Stimulation mit CD40L in der Lage, intrazellu-l{\"a}re CD95-vermittelte Signalwege zu aktivieren. Die Aktivierung von CD95-assoziierten Sig-nalwegen durch Stimulation von endogenem CD95 in CD40-CD95-Transfektanten resultierte nun in der Ko-Translokation von unstimulierten CD40-CD95-Rezeptoren in „Lipid Rafts". Vice versa zeigte sich die Ko-Translokation von endogenem CD95 nach spezifischer Aktivierung des chim{\"a}ren CD40-CD95-Rezeptors. Schlussendlich erwiesen sich eine funktionsf{\"a}hige Todesdom{\"a}ne und die Aktivierung der Caspase-8 als essentiell f{\"u}r die „Lipid Raft"-Assoziation von aktivierten CD95-Molek{\"u}len und auch f{\"u}r die durch diese Rezeptorspezies induzierte Ko-Translokation von inaktiven Rezeptoren in „Lipid Rafts".}, subject = {Fas-Ligand}, language = {de} } @phdthesis{Karunakaran2012, author = {Karunakaran, Karthika}, title = {Mechanisms of apoptosis regulation in human cells infected with Simkania negevensis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72098}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Chlamydiales are obligate intracellular gram-negative bacteria that have gained high medical relevance. These important human pathogens cause diverse diseases including trachoma and wide spread sexually transmitted diseases. Chlamydia establishes membrane bound inclusions in the host cell and loots the host for nutritional requirements. Infections are usually recognized by the host immune system and eliminated systematically, by triggering apoptosis. However, the pathogen Chlamydia has evolved various strategies to prevent the detection as well as protect the invaded cell against apoptosis or any other form of cell death. The evolutionary conservation of cell death regulation has not been investigated in the order Chlamydiales, which also includes Chlamydia-like organisms with a broader host spectrum. The present study was aimed at investigating the apoptotic response of human cells infected with the Chlamydia-like organism Simkania negevensis (Sn). Simkania infected cells exhibited strong resistance to apoptosis induced by intrinsic stress or by the activation of cell death receptors. Apoptotic signaling was blocked upstream of mitochondria since Bax translocation, Bax and Bak oligomerisation and cytochrome c release were absent in these cells. Caspases were differentially regulated upon Sn infection. Caspase-3 and -9 were not activated upon Sn infection and apoptosis induction; whereas caspases-8 was activated in Sn infected cells even without apoptosis induction. This indicates that, Sn utilizes death receptor association independent caspase activation for thriving in the host environment. Infected cells turned on pro-survival pathways like cellular Inhibitor of Apoptosis Proteins (IAP-1/2 and XIAP) and the Akt/PI3K pathway. Sn infection also 20 activated the pro-survival transcription factor NF-кB. Blocking any of these survival pathways sensitized the infected host cell towards apoptosis induction, demonstrating their role in infection-induced apoptosis resistance. The NF-кB mutant cells also showed reduced infectivity of Sn, which indicated an essential role of NF-кB in Sn infection. It was interesting to observe that, Acanthamoeba castellanii, a natural host of Sn, survived maintaining its trophozoite forms after infection with Sn upon starvation. The metacaspases, responsible for encystment could be regulated by Sn upon infection. This suggests an early level of gene regulation indicating how the pathogen evolved its ability to inhibit apoptosis in higher organisms. The resistance to apoptosis pathways subverted in Sn-infected cells was similar but not identical to those modulated by Chlamydia. Together, the data supports the hypothesis of evolutionary conserved signaling pathways to apoptosis resistance as common denominators in the order Chlamydiales.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{Philippi2011, author = {Philippi, Nicole}, title = {Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Apoptose der Leberzellen ist abh{\"a}ngig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellul{\"a}ren Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener {\"a}ußerer Einfl{\"u}sse und nat{\"u}rlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzust{\"a}nde anzunehmen. Die verschiedenartigen Einfl{\"u}sse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzust{\"a}nde. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzust{\"a}nde, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst ver{\"a}ndert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellul{\"a}ren Netzwerkes und seiner verschiedenen Zust{\"a}nde dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabh{\"a}ngig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer {\"U}bereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-M{\"o}glichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso ber{\"u}cksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsm{\"o}glichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazellul{\"a}re Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten.}, subject = {Systembiologie}, language = {de} } @phdthesis{Schaffstein2010, author = {Schaffstein, Stella}, title = {Molekulare Mechanismen der nicht-apoptotischen Signaltransduktion des Todesliganden TRAIL (Apo-2 Ligand)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55943}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn {\"u}ber seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, w{\"a}hrend normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Ausl{\"o}ser der Apoptose zus{\"a}tzlich die F{\"a}higkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierf{\"u}r wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabh{\"a}ngig vom apoptotischen Zelltod aber abh{\"a}ngig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entz{\"u}ndlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegen{\"u}ber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Torlopp2010, author = {Torlopp, Angela}, title = {Die Rolle von FGF in der fr{\"u}hen Kardiogenese und Proepikardiogenese im H{\"u}hnerembryo}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47695}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im H{\"u}hnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolek{\"u}len und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargef{\"a}ßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein {\"a}hnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt f{\"u}r die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivit{\"a}t. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro f{\"u}hrt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erh{\"o}hten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, f{\"u}r das Wachstum und {\"U}berleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identit{\"a}t involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum f{\"u}hrte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine fr{\"u}he differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zur{\"u}ckgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines fr{\"u}hen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abh{\"a}ngigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyalurons{\"a}ure, welches eine essentielle Komponente der extrazellul{\"a}ren Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im prim{\"a}ren Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt.}, subject = {Huhn}, language = {de} } @phdthesis{Langer2009, author = {Langer, Manuel}, title = {Analyse der Instabilit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des Anti-Apoptose-Proteins A1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erf{\"u}llt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilit{\"a}t und anti-apoptotische Funktion von A1 wird {\"u}ber den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt f{\"u}r diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminos{\"a}uren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilit{\"a}t und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gew{\"a}hlt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, w{\"a}hrend eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht m{\"o}glich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in St{\"a}rke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es m{\"u}ssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein f{\"u}r den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterst{\"u}tzen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilit{\"a}t als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anh{\"a}ngt und das Protein damit f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Leicht2009, author = {Leicht, Wolfgang}, title = {Wirkung von A20 auf die durch oxidiertes low density lipoprotein induzierte Apoptose bei Endothelzellen am Beispiel boviner Endothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-43691}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {A20 reduziert Apoptose in Endothelzellen verursacht durch oxidiertes low density lipoprotein}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Boehme2009, author = {B{\"o}hme, Linda}, title = {Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazellul{\"a}re Bakterien, die f{\"u}r ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abh{\"a}ngig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu k{\"o}nnen. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zellul{\"a}re Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidins{\"a}ure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern k{\"o}nnen. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der fr{\"u}hen bakteriellen Proteinsynthese abh{\"a}ngig und f{\"u}r die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellul{\"a}ren Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unver{\"a}ndert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zellul{\"a}re Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopr{\"a}zipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren geh{\"o}renden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen ver{\"a}ndert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Ver{\"a}nderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukle{\"a}re Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zellul{\"a}re Antwort auf dsRNA signifikant ver{\"a}ndern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen.}, subject = {Chlamydia trachomatis}, language = {en} } @phdthesis{Dogan2009, author = {Dogan, Taner}, title = {Role of IAPs in modulating C-RAF stability and cell motility}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39827}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {The data of this thesis show an unexpected role of XIAP and c-IAPs in the turnover of C-RAF protein, thereby modulating the MAPK signaling pathway and cell migration}, subject = {IAP}, language = {en} } @phdthesis{Berg2008, author = {Berg, Daniela}, title = {Entwicklung von TRAIL-Fusionsproteinen und ihre Wirkung auf Myelomzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27430}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {1. Zusammenfassung L{\"o}sliche humane TRAIL-Varianten (hTRAIL), die nur die "TNF homology domain" (THD) beinhalten, binden sowohl den TRAILR1 aus auch den TRAILR2, stimulieren jedoch nur den TRAILR1. Nach sekund{\"a}rem Quervernetzen des Liganden wird dann aber auch der TRAILR2 effektiv aktiviert. Entsprechende murine TRAIL-Varianten (mTRAIL) dagegen zeigen nur eine schwache Rezeptorbindung und sind selbst nach sekund{\"a}rem Quervernetzen nur wenig aktiv. Interessanterweise kann ein Fusionsprotein aus der THD von mTRAIL und der Trimerisierungsdom{\"a}ne von Tenascin-C (TNC), das wie mTRAIL selbst auch als Trimer vorligt, effizient an TRAIL-Rezeptoren binden und nach sekund{\"a}rem Quervernetzen den TRAILR2 gut stimulieren. Weiterhin kann eine mTRAIL-Variante, die neben der THD auch die Stammregion des Molek{\"u}ls enth{\"a}lt, die die THD von der Transmembrandom{\"a}ne trennt, nach sekund{\"a}rem Quervernetzen Apoptose induzieren, jedoch nicht so effektiv wie das TNC-mTRAILFusionsprotein. Die spezifische Bioaktivit{\"a}t der humanen TRAIL-Varianten wird gleichfalls, wenn auch weniger stark, durch Fusion mit der Tenascin-C-Trimerisierungsdom{\"a}ne gesteigert. Die Fixierung des N-Terminus der THD, die hier durch die TNCDom{\"a}ne sonst jedoch durch die Stamm- oder Transmembrandom{\"a}ne gew{\"a}hrleistet wird, k{\"o}nnte demnach f{\"u}r mTRAIL f{\"u}r eine gute Rezeptorbindung und effektive Apoptoseinduktion n{\"o}tig sein. Dies deutet auf eine bisher nicht erkannte Rolle der Stammregion f{\"u}r die Aktivit{\"a}t dieser Liganden hin und bietet die M{\"o}glichkeit, rekombinante l{\"o}sliche Liganden der TNF-Familie mit erh{\"o}hter Aktivit{\"a}t zu generieren. Die TRAIL-induzierte Apoptose kann f{\"u}r die Behandlung von Tumorzellen n{\"u}tzlich sein. Es wurde jedoch k{\"u}rzlich gezeigt, dass TRAIL neben Apoptose auch proinflammatorische, d. h. potentiell tumorf{\"o}rdernde Signalwege, insbesondere in apoptoseresistenten Zellen induzieren kann. Im Folgenden sollte untersucht werden, inwiefern TRAIL solche Signalwege in Myelomzellen stimuliert. Oligomerisiertes TRAIL kann bei allen analysierten Zelllinien Caspasen aktivieren und Apoptose induzieren. Werden die Zelllinien mit dem pan-Caspaseinhibitor ZVAD behandelt, kann die Caspase- Aktivierung bei allen Zellen blockiert werden, die Apoptoseinduktion jedoch nur bei zwei Zelllinien. Im Gegensatz dazu sch{\"u}tzt ZVAD drei andere Myelomzelllinien nur partiell vor der TRAIL-induzierten Apoptose. Dies zeigt, dass TRAIL in Myelomzellen auch caspaseunabh{\"a}ngigen Zelltod induzieren kann. TRAIL induziert in den Myelomzellen auch proinflammatorische Signalwege wie den NF\&\#1082;B-, den JNK-, den p38- und den p42/44-Signalweg. Die Stimulation des JNK- und des p38-Signalwegs erwies sich hierbei in zelltypspezifischer Weise caspaseabh{\"a}ngig, die Aktivierung des NF\&\#1082;B- und p42/44-Signalwegs immer als caspaseunabh{\"a}ngig. Zusammenfassend geht aus diesen Ergebnissen hervor, dass zur Behandlung des multiplen Myeloms, TRAIL in Kombination mit anti-inflammatorisch wirkenden Mitteln eingesetzt werden sollte, insbesondere um m{\"o}gliche proinflammatorische Nebenwirkungen durch TRAIL zu minimieren.}, subject = {TRAIL}, language = {de} } @phdthesis{Rothhammer2008, author = {Rothhammer, Veit}, title = {Wachstumsverhalten und Expansionskapazit{\"a}t humaner mesenchymaler Stammzellen aus Pankreas und Knochenmark}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29149}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Prim{\"a}re Nestin-positive adulte Stamm-/Vorl{\"a}uferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Ph{\"a}notypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Prim{\"a}rzellen in Kultur begr{\"u}ndet, das in der vorliegenden Arbeit ausf{\"u}hrlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und f{\"u}hrt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorl{\"a}uferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen k{\"o}nnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile {\"U}berex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 f{\"o}rdernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-{\"u}berexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und {\"U}berlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zell{\"a}hnlichen Ph{\"a}notypen differenzierbarer Vorl{\"a}uferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur L{\"o}sung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie f{\"u}r den Diabetes mellitus leisten.}, subject = {Adulte Stammzelle}, language = {de} } @phdthesis{Schenkhoff2007, author = {Schenkhoff, Felix Stephan}, title = {Herstellung und Charakterisierung multifunktioneller Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen Fas-Liganden und des membranst{\"a}ndigen CD40-Liganden}, isbn = {xxx}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25978}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {TNF-Liganden liegen prim{\"a}r in membranst{\"a}ndiger Form mit trimerer Struktur vor und die meisten von ihnen k{\"o}nnen sekund{\"a}r durch Metalloproteasen in l{\"o}sliche trimere Liganden prozessiert werden. W{\"a}hrend membranst{\"a}ndige Formen der TNF-Liganden ihre korrespondierenden Rezeptoren aktivieren k{\"o}nnen, sind die l{\"o}slichen Varianten einzelner TNF-Liganden unterschiedlich aktiv beziehungsweise inaktiv an den korrespondierenden Rezeptoren, obwohl sie ebenfalls zur Bindung in der Lage sind. Dies konnte bereits in Studien f{\"u}r TNF und TRAIL gezeigt werden. Die Unterschiede zwischen l{\"o}slichen Varianten und der membranst{\"a}ndigen Form des Liganden betreffen sowohl die Rezeptorselektivit{\"a}t als auch den Aktivierungsgrad am Rezeptor bis hin zu v{\"o}lliger Inaktivit{\"a}t der l{\"o}slichen Form. Unterschiede finden sich jedoch nicht nur hinsichtlich der Aktivit{\"a}t, sondern auch in der Interaktion des Liganden mit dem Rezeptor. F{\"u}r die membranst{\"a}ndige und die l{\"o}sliche Form von FasL konnten Unterschiede in der Notwendigkeit intrazellul{\"a}rer Signalmolek{\"u}le bei der Ausbildung Ligand-induzierter Rezeptorsignalcluster gezeigt werden. F{\"u}r die l{\"o}sliche und membranst{\"a}ndige Form des CD40L werden eine unterschiedliche Rezeptorinternalisierung und eine unterschiedliche Rekrutierung von TRAF-Molek{\"u}len angenommen. Bisherige Arbeiten zur Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion st{\"u}tzen sich meist auf l{\"o}sliche Varianten von TNF-Liganden, die durch artifizielle Multimerisierung oder Antik{\"o}rper-induzierte Quervernetzung sekund{\"a}r aktiviert werden m{\"u}ssen. Um f{\"u}r die Untersuchung der Rezeptor-Ligand-Interaktion in Zukunft realit{\"a}tsn{\"a}here Bedingungen zu schaffen, sollten im Rahmen dieser Arbeit multifunktionelle Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen FasL und CD40L hergestellt und charakterisiert werden. Die Fusionsproteine wurden im Rahmen der Klonierung so konstruiert, dass von der aminoterminalen Seite beginnend eine GST-Dom{\"a}ne, ein Flag-Tag, ein YFP-Tag und abschließend die vollst{\"a}ndige membranst{\"a}ndige Form des Liganden (FasL oder CD40L) aneinander gef{\"u}gt wurden. In FACS-Analysen konnte sowohl die Funktion des YFP-Tag als auch die korrekte Expression des Liganden an der Zelloberfl{\"a}che durch spezifische Antik{\"o}rperf{\"a}rbung nachgewiesen werden. Die funktionelle Aktivit{\"a}t der Liganden wurde durch IL-8-Induktion gezeigt, die eine Aktivierung des NF\&\#61547;B-Signalweges durch die GST-Fusionsproteine des membranst{\"a}ndigen FasL und des membranst{\"a}ndigen CD40L beweist. Im Rahmen von Immunopr{\"a}zipitationen wurde die M{\"o}glichkeit der Detektion der Fusionsproteine {\"u}ber ihr Flag-Tag getestet. F{\"u}r das in GST-pull-down-Assays genauer untersuchte membranst{\"a}ndige GST-Flag-YFP-CD40L-Fusionsprotein gelang eine Koimmunopr{\"a}zipitation mit dem im Rezeptorkomplex gebundenen TRAF2. F{\"u}r dieses in der Signaltransduktion des CD40 entscheidende Molek{\"u}l konnte seine transiente Interaktion mit dem Rezeptorsignalkomplex sowie eine Ver{\"a}nderung in der Assoziation an den Rezeptor durch TNF-abh{\"a}ngige TRAF1-Induktion gezeigt werden. Im Zusammenhang der mit der Rezeptoraktivierung oftmals gleichgesetzten Bildung von Rezeptorsignalclustern durch den entsprechenden TNF-Liganden war die Beobachtung interessant, dass das Konstrukt GST-Flag-YFP-CD40L im Gegensatz zum analog konstruierten GST-Flag-YFP-FasL nicht in der Lage war, Signalcluster des korrespondierenden Rezeptors zu erzeugen, aber dennoch f{\"a}hig war, eine Rezeptoraktivierung zu bewirken. Hinsichtlich der Untersuchung von Unterschieden in der Rezeptor-Ligand-Interaktion von l{\"o}slichen und membranst{\"a}ndigen Formen sind f{\"u}r FasL und CD40L noch viele Fragen offen, die beispielsweise auch die Stabilit{\"a}t von Rezeptorsignalclustern betreffen. Die in dieser Arbeit erzeugten und charakterisierten multifunktionellen Fusionsproteine sollten helfen, neue Erkenntnisse bez{\"u}glich der molekularen Grundlagen der Rezeptor-Ligand-Interaktion zu erzielen.}, subject = {Tumor-Necrose-Faktor}, language = {de} } @phdthesis{Graf2007, author = {Graf, Tilmann}, title = {Differentielle Effekte einer PPARgamma-Aktivierung mit Pioglitazon in der Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 in vitro und in vivo}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23497}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Der intrazellul{\"a}re Hormonrezeptor PPARgamma spielt eine Rolle in vielen Differenzierungsprozessen. Zudem konnte in multiplen malignen Tumoren verschiedenen Ursprungsgewebe gezeigt werden, dass sowohl Proliferation als auch Apoptose beeinflusst werden k{\"o}nnen und so eine neuartige antiproliferative Therapieoption bestehen k{\"o}nnte. Im Barrettadenokarzinom des distalen {\"O}sophagus, einer malignen Neoplasie auf dem Boden von Magens{\"a}ure- und D{\"u}nndarmsekretreflux, sind diese Zusammenh{\"a}nge bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie sollte eine Untersuchung von Proliferation und Apoptose des Barrettadenokarzinoms unter dem Einfluss von einer PPARgamma-Aktivierung durch den synthetischen Agonisten Pioglitazon sein. Dazu wurden in vitro Zelllinien von Barrettadenokarzinomen und von Plattenepithelkarzinomen sowie humane Barrettgewebeproben auf Expression von PPARgamma untersucht. Zudem wurde nach Stimulation mit Pioglitazon die Wirkung auf Proliferation und Apoptose gemessen. Nach Generierung von soliden Tumoren in immundepletierten balb/c nu/nu M{\"a}usen wurden diese mit Pioglitazon-haltigem Actos® stimuliert und das Tumorwachstum mit einer Kontrollgruppe verglichen. Zudem wurden nach Explantation der Tumore histologisch Apoptose- und Proliferationsverhalten bestimmt. Wir konnten zeigen, dass PPARgamma in humaner Barrettmukosa und in der humanen Barrettadenokarzinomzelllinie OE33 {\"u}berexprimiert ist. PPARgamma-Aktivierung inhibiert das Wachstum von OE33-Barrett-Adenokarzinomzellen in vitro durch eine Induktion von Apoptose, w{\"a}hrend das Wachstum von transplantierten Tumoren, die von OE33-Zellen abgeleitet wurden, in vivo durch systemische PPARgamma-Aktivierung auf dem Boden einer gesteigerten Proliferation und einer Hemmung der Apoptose verst{\"a}rkt wurde. Diese Ergebnisse charakterisieren PPARgamma als einen potentiellen molekularen Mediator, der in die Entwicklung eines Barrettepithels mit Metaplasie aus normalem Plattenepithel in dem gastro-{\"o}sophagealen {\"U}bergang involviert ist.}, language = {de} } @phdthesis{Nichiporuk2007, author = {Nichiporuk, Ekaterina}, title = {p33ING1b und p29ING4 Tumorsuppressorproteine beim Nierenzellkarzinom : Analyse T-Zell-vermittelter Tumorimmunantworten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24376}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Tumorsuppressorproteine p33ING1b und p29ING4 (Inhibitor of Growth, ING) verhindern normalerweise die Entwicklung bestimmter Tumorarten, indem sie einen Transkriptionskomplex mit dem Tumorsuppressorgen p53 bilden. Die ING1b und ING4 Gene sind nach der Demonstration hoher Expressionswerte in verschiedenen Tumoren in den Mittelpunkt der Tumorforschung ger{\"u}ckt. Zudem hat die Immunogenit{\"a}t des p33ING1b Proteins in Patientinnen mit einem Mammakarzinom ihre potentielle Bedeutung f{\"u}r die Diagnose und eine auf dem Prinzip der Vakzinierung basierende Behandlung demonstriert. H{\"a}ufig wird das Nierenzellkarzinom von einer großen Anzahl mononukle{\"a}rer Zellen einschließlich T-Lymphozyten, NK-Zellen und Makrophagen infiltriert. Dabei wurde f{\"u}r fr{\"u}he Tumorstadien in der vorliegenden Arbeit eine erh{\"o}hte Serumkonzentration an IL-2 und dessen Rezeptor (IL-2R) gezeigt, die auf eine erh{\"o}hte T-Zellproliferation und Aktivierung der Immunantwort im Tumorpatienten hindeutet. Eine verst{\"a}rkte Expression von Zytokinen wie IFN-\&\#947; und TNF-\&\#945; neben IL-2 im Serum weist, wie nachgewiesen, auf eine verst{\"a}rkte Aktivierung von Th1 und zytotoxischen Tc1 Zellen im Tumorpatienten hin. Im Tumorgewebe selber akkumulieren T-Zellen in den Anfangsstadien des Nierenzellkarzinoms. Dies l{\"a}sst eine lokale Tumorimmunantwort vermuten. Im peripheren Blut von Patienten sp{\"a}ter Stadien weisen die Ergebnisse dieser Arbeit jedoch auf eine stadienabh{\"a}ngige Abschw{\"a}chung der gegen den Tumor gerichteten Th1-Antwort und eine St{\"a}rkung der Th2/Treg-Antwort mit supprimierender Auswirkung auf die Tumor-Immunabwehr hin. In fortgeschrittenen Tumorstadien bedeutet dies eine zunehmend inaktive Tumorimmunantwort. Intratumoral {\"u}berwogen sowohl IL-10 positive CD4+ und CD8+ als auch IL-2 positive CD8+ T-Zellen, von denen immunsuppressive Effekte auf die Tumorimmunantwort vermutet werden. M{\"o}glicherweise entsteht durch eine Verschiebung im Zellverh{\"a}ltnis von zytotoxischen und T-Helferzellen gegen{\"u}ber supprimierenden und regulatorischen Zellen ein Selektionsvorteil f{\"u}r das weitere Tumorwachstum. So w{\"a}re eine zytotoxische Immunantwort gegen den Tumor zunehmend ineffektiv. Immunologische Therapieans{\"a}tze stellen wegen der M{\"o}glichkeit eines selektiven Angriffs auf Tumorzellen ein attraktives Konzept dar. Diese Arbeit zeigt, dass etwa 40\% der untersuchten Patienten fr{\"u}her wie auch sp{\"a}ter Stadien eine signifikante {\"U}berexpression des ING1b Gens und {\"u}ber 30\% eine signifikante {\"U}berexpression des ING4 Gens aufwiesen. Eine zytotoxische CD8+ sowie CD4+ T-Zell-Tumorimmunantwort gegen diese im Tumor selektiv {\"u}berexprimierten Proteine k{\"o}nnte sich somit als ein attraktives Therapieziel erweisen. In der in begrenztem Umfang, da nicht thematischer Schwerpunkt der Arbeit, durchgef{\"u}hrten HLA-Analyse zeigte sich f{\"u}r die untersuchten HLA-A, -B und -C sowie HLA-DRA und -DRB Antigene im untersuchten Patientenkollektiv eine heterogene Genexpression. Der f{\"u}r verschiedenen Tumoren beschriebene Verlust von HLA Klasse I Molek{\"u}len auf der Tumorzelloberfl{\"a}che stellt offensichtlich keine Allgemeing{\"u}ltigkeit dar. Beim Nierenzellkarzinom ist diese Beobachtung nach der eigenen Datenlage nicht unbedingt mit einem oft diskutierten Escape-Mechanismus gleichzusetzen. Dagegen zeigten s{\"a}mtliche Patienten fr{\"u}her Stadien und 75\% fortgeschrittener Tumoren eine signifikant herabregulierte HLA-G Expression auf. Die Bedeutung des HLA-G Molek{\"u}ls f{\"u}r das Nierenzellkarzinom bleibt unklar, f{\"u}r andere Tumorentit{\"a}ten wird es derzeit kontrovers diskutiert. Dessen {\"U}berexpression k{\"o}nnte sich als ein Selektionsvorteil f{\"u}r den Tumor herausstellen. Die Tatsache, dass sowohl im Tumor als auch im peripheren Blut p29ING4-positive T-Zellen nachweisbar sind, und dass diese Zellen in fortgeschrittenen Tumorstadien abnehmen, wurde in dieser Arbeit eindr{\"u}cklich gezeigt. Dabei war der Anteil p29ING4-positiver CD4+ T-Zellen in fr{\"u}hen Tumoren gr{\"o}ßer als der spezifischer CD8+ T-Zellen. Dabei k{\"o}nnte es sich vermutlich um CD4+ T-Helferzellen und CD8+ zytotoxische T-Zellen handeln. Die Sequenz p29ING4 aa 149-158 bewirkte eine IL-2-Antwort and war f{\"u}r eine verst{\"a}rkte Expression des IFN-\&\#947; in PBLs von Patienten fr{\"u}her Stadien bedeutsam. Sie l{\"o}ste dazu nur eine geringe IL-10-Antwort aus. Dies deutet auf eine stimulierende Rolle dieses p29ING4 Epitops f{\"u}r die Induktion einer zytotoxischen Tc1- aber auch einer Th1-vermittelten T-Zellantwort in den PBLs der Tumorpatienten hin. Schlussfolgernd w{\"a}re die therapeutische Effizienz des identifizierten p29ING4 Epitops f{\"u}r eine Immuntherapie klinisch zu {\"u}berpr{\"u}fen. M{\"o}glicherweise stellt eine auf p29ING4-basierte Immuntherapie in Kombination mit CTLs, die durch eine begleitende Zytokintherapie (z.B. INF-\&\#945; und IL-2) aktiviert werden, bei Patienten mit p29ING4-{\"u}berexprimierenden Nierentumoren ein wirksames immunologisches Therapiekonzept f{\"u}r die Zukunft dar.}, subject = {Nierenzellkarzinom}, language = {de} } @phdthesis{Wicovsky2007, author = {Wicovsky, Andreas}, title = {Die Rolle von TRAF1 und JNK bei der TNF-vermittelten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23689}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {TNF (Tumor Nekrose Faktor) vermittelt seine biologischen Funktionen durch Interaktionen mit TNFR1 (TNFRezeptor 1) und TNFR2 (TNFRezeptor 2). In fr{\"u}heren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass der TNFR2 sowohl durch die Induktion von membrangebundenem TNF als auch durch die proteasomale Degradation von TRAF2 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 2) die TNFR1-vermittelte Apoptose verst{\"a}rken kann. Des Weiteren war bekannt, dass TRAF1 (TNFRezeptor-assozierter Faktor 1), ein anderes Mitglied der TRAF-Familie, mit TRAF2 Heterotrimere bilden kann und zudem nach TNF-induzierter NFkappaB- (nuclear factor kappaB) Aktivierung verst{\"a}rkt exprimiert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmals gezeigt werden, dass TRAF1 in beide TNFR-Signalkomplexe rekrutiert wird und darin in einem TRAF2/TRAF1-Heterotrimer TRAF2 funktionell ersetzen kann. Dar{\"u}ber hinaus verhindert TRAF1 die Rekrutierung von TRAF2 in lipid rafts sowie dessen anschließende proteasomale Degradation. Auf diese Weise kann TRAF1 die TNFR2-abh{\"a}ngige Verst{\"a}rkung der TNFR1-induzierten Apoptose verhindern. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die TNF-vermittelte Aktivierung der JNK (c-Jun N-terminale Kinase), dessen Regulation durch ROS (reactive oxygen species), Caspasen (Cysteinyl-Aspartat-spezifische Proteasen) sowie NFkappaB-induzierte Faktoren untersucht. TNF induziert in den meisten Zellen zun{\"a}chst nach zehn bis 30 Minuten eine transiente JNK-Aktivierung, woraufhin bei NFkB-inhibierten Zellen eine zweite andauernde JNK-Aktivierung folgt. Die meisten in der Literatur beschriebenen Studien gehen dabei von einem ROS-abh{\"a}ngigen, Caspase-unabh{\"a}ngigen Mechanismus der persistierenden JNK-Aktivierung aus. Des Weiteren wurde in den vor allem bei embryonale Mausfibroblasten durchgef{\"u}hrten Untersuchungen davon ausgegangen, dass bestimmte NFkappaB-induzierte Radikalf{\"a}nger die andauernde Aktivierung der JNK verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass in den humanen Zelllinien KB, Jurkat und HaCaT die andauernde Aktivierung der JNK, im Gegensatz zur transienten JNK-Aktivierung, Caspase-abh{\"a}ngig verl{\"a}uft. Es ergab sich {\"u}berdies, dass die inhibierende Wirkung des NFkB-Signalweges auf die persistierende JNK-Aktivierung in diesen Zelllinien in erster Linie auf die indirekte Verhinderung der Apoptose durch die Induktion von antiapoptotischen Proteinen wie Flip-L (FLICE-inhibitory protein long) und IAPs (inhibitor of apoptosis) zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist, als auf die direkte Expression von Radikalf{\"a}ngern. Zudem wurde in den untersuchten Zelllinien die Caspase-vermittelte Spaltung von MEKK-1 (MAP/ERK kinase kinase-1) und p21WAF/Cip 1 nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass die Spaltprodukte eine JNK-stimulierende Wirkung haben. Dennoch m{\"u}ssen k{\"u}nftige Studien zeigen, ob die Spaltung von p21WAF/Cip 1 und MEKK-1 in Fragmente mit JNK-stimulierender Aktivit{\"a}t oder andere Caspasesubstrate f{\"u}r die Caspase-vermittelte andauernde Aktivierung der JNK verantwortlich sind.}, language = {de} } @phdthesis{Wang2006, author = {Wang, Dapeng}, title = {The mechanism of glucocorticoid induced murine thymocyte and peripheral T cell apoptosis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17317}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Glucocordicoide sind kleine lipophile Verbindungen, die viele biologische Effekte verursachen, wenn sie an den intrazellul{\"a}ren Glukokortikoidrezeptor (GR) binden. Dieser wandert wiederum in den Nucleus, um dort direkt oder indirekt die Transkription der Gene zu regulieren. Glukokortikoide sind der Grundstein in der Behandlung f{\"u}r eine Anzahl von h{\"a}matologischen b{\"o}sartigen Erkrankungen, wie Leuk{\"a}mie, Lymphome und Myelome. In der Literatur wird beschrieben, dass Glukokortikoide {\"u}ber die Vermittlung von Apoptose wirken.die Wirkung. Trotz der enormen Fortschritte im Verst{\"a}ndnis des regulierten Zelltodes, ist der genaue Mechanismus, den Glukokortikoide bei der Apoptose vermitteln, unbekannt. Die Daten, die bis jetzt erzielt wurden, deuten stark darauf hin, dass Gentransaktivierung durch den GR f{\"u}r den Beginn der durch Glukokortikoide verursachten Thymozytenapoptose verantwortlich ist. Außerdem wurde gezeigt, dass das multikatalytische Proteasom, einige Mitglieder der BCL2-Familie, {\"A}nderungen im Kalziumfluss sowie Caspasen eine wichtige Rolle in der Durchf{\"u}hrungsphase des durch Glukokortikoide vermittelten Zelltodes spielen Jedoch ist die genaue Reihenfolge dieses Prozesses bisher nicht bekannt. Ein Hauptschwierigkeit der gegenw{\"a}rtigen Diskussion entsteht aus der Tatsache, dass unterschiedliche Zellarten, wie Thymozyten, reife T-Zellen und Lymphomzellen verglichen werden, ohne ihre unterschiedlichen Eigenschaften und Genexpressionsprofile zu beachten. Obwohl angenommen wird, dass Glukokortikoide Apoptose {\"u}ber einen konservierten Mechanismus, wird dies nicht durch irgendwelche Daten unterst{\"u}tzt. In anderen Worten, es ist m{\"o}glich, dass Apoptose in Thymozyten, reifen T-Zellen und Lymphomzellen {\"u}ber unterschiedliche Signalwege vermittelt wid. Wir fragten uns daher, ob ein einzelner durch Glukokoritkoide eingeleiteter Signaltransduktionsweg daf{\"u}r verantwortlich ist, dass Apoptose in allen T-Lamphozytenarten eingeleitet wird, oder ob noch andere Signalwege existieren. Daher verglichen wir die Rolle des Proteasomes, verschiedener Caspasen, des lysosomalen Kompartements und anderer Faktoren in der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose in Mausthymozyten und pepripheren T-Zellen sowie T-ALL Lymphomzellen. Unsere Entdeckungen zeigen, dass die Anfangsphase der durch Glukokortikoide induzierten Apoptose unabh{\"a}ngig von der Differenzierungsstadien der Zelle ist. Apoptose wird sowohl in Thymozyten als auch in reifen T-Zellen durch den GR vermittelt und ist von der Gentranskription abh{\"a}ngig. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Durchf{\"u}hrungsphase erheblich in ihren Anforderungen f{\"u}r eine Anzahl von Signaltransduktionskomponenten zwischen Thymozyten und peripheren T-Zellen. W{\"a}hrend in Thymozyten das Proteasom, die Caspasen 3, 8 und 9 sowie Cathepsin B eine wichtige Rolle in durch Glukokortikoide induzierten Zelltod spielen, sind diese Faktoren f{\"u}r die Induktion des Zell-Todes in peripheren T- Zellen entbehrlich. Im Gegensatz dazu scheinen {\"A}nderungen in der Expression und intrazellul{\"a}ren Lokalisation von Mitgliedern der Bcl-2 Familie nicht zum durch Glukokortikoide induzierten Zellltod beitzutragen, egal um welchen Zelltyp es sich handelt. Wir haben beobachtet, dass eine Behandlung von Thymozyten mit Glukokortikoiden zu einer Aktivierung der lysosomalen Protease Cathepsin B f{\"u}hrt. Dies ist ein essentieller Schritt zur Einleitung von Apoptose durch Glukortikoide und zeigt zum ersten Mal, dass der lysosomale Amplifikationsloop in diesen Prozess involviert ist. Die Analyse des durch Glukokortikoide induzierten Zelltodes in verschiedenen T-ALL Zelllinien deutet darauf hin, dass die durch Glukokortikoide induzierten Signalwege in Thymozyten und allen Lymphonzelllinien aber nicht in peripheren T Zellen {\"u}bereinstimmen. Da die hoch-dosierte Glukokortikoidbehandlung eine wichtige Rolle in der Behandlung von hematologischen b{\"o}sartigen Erkrankungen spielt, k{\"o}nnen unsere Beobachtungen eine Grundlage f{\"u}r eine neue Anti-Krebs-Stragie bilden, die darauf ausgelegt ist, spezifisch Tumorzellen zu eliminieren aber reife T-Zellen unber{\"u}hrt lassen.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} } @phdthesis{Knoeferle2006, author = {Kn{\"o}ferle, Johanna Maria}, title = {Die Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose und die Reaktivierung von HIV in chronisch-infizierten Zellen durch bakterielle CpG-ODN-Sequenzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22984}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Der erste Teil der vorliegenden Arbeit befasste sich mit der Wirkung von Antioxidantien auf die Apoptose. Dabei sollte vor allem die Abh{\"a}ngigkeit der Apoptosereaktion von der verwendeten Zellinie gepr{\"u}ft werden. Zwei verschiedene Zellmodelle kamen zum Einsatz, A3.01 T-Zelllymphoblasten und E6-1 Jurkat-Zellen. Als Antioxidantien wurden das nat{\"u}rlich vorkommende N-Acetylzystein und das synthetische Antioxidans BHA ausgew{\"a}hlt. Die Zellen wurden mit CD95L stimuliert, und mit den entsprechenden Antioxidantien behandelt. Nach der Inkubation wurden sie mit AnnexinV und 7AAD gef{\"a}rbt. Annexin V bindet an Phosphatidylserin, 7AAD an den Nukleus. Die Zellen wurden im Durchflusszytomter analysiert. Zellen, die nur Annexin V positiv waren, wurden als apoptotisch gez{\"a}hlt, w{\"a}hrend Zellen die f{\"u}r AnnexinV und 7AAD positiv waren (also einen Membranst{\"o}rungen aufwiesen) als nekrotisch betrachtet wurden. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten l{\"a}sst sich schließen, dass die Apoptose in verschiedenen Zelllinien {\"u}ber unterschiedliche Signalwege vermittelt wird. A3.01 Zellen waren bereits f{\"u}r die Existenz eines nekrose-{\"a}hnlichen Zelltodes unter Caspaseinhibition bekannt. BHA konnte diesen nekrose-{\"a}hnlichen Zelltod verhindern. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass BHA nach Apoptoseinduktion ohne Caspaseinhibitoren eine st{\"a}rkere Apoptose induziert als ein CD95-Ligand alleine. Dieselbe Reaktion konnte bei peripheren Blutmonozyten (PBMC) beobachtet werden. Bei E6-1 Jurkat-Zellen, die nach Inhibition der Caspase keinen nekrotischen Zelltod erleiden, kam es nach der Behandlung mit BHA und CD95 zu einer Abnahme der Apoptose. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass die verwendeten Zellinien unterschiedlichen Zelltypen angeh{\"o}ren: A3.01 Zellen und PBMC k{\"o}nnten den Typ 1 Zellen zugeordnet werden, die f{\"u}r die Durchf{\"u}hrung der Apoptose auf Caspasen angewiesen sind, E6-1 Zellen k{\"o}nnten Typ 2 Zellen verk{\"o}rpern, die zus{\"a}tzlich noch auf mitochondriale Stimulation angewiesen sind, um apoptotisch zu werden. Diese mitochondriale Stimulation k{\"o}nnte durch BHA verhindert werden und so bei E6-1 Jurkat-Zellen Apoptose verhindern. NAC hingegen zeigte in der vorliegenden Arbeit einen anti-apoptotischen Effekt sowohl bei der A3.01 Zelllinie, als auch bei E6-1 Jurkat-Zellen. Hieraus k{\"o}nnte geschlussfolgert werden, dass NAC bereits zu einem fr{\"u}heren Zeitpunkt in den Ablauf der Apoptose eingreift. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Reaktivierung von HIV in der chronisch-infizierten T-Zelllinie ACH-2 durch bakterielle CpG-Sequenzen. Auch hier wurden die Zellen mithilfe der Durchflußzytometrie analysiert. Die HIV-Replikationsrate wurde quantitativ mit einem p24-Antik{\"o}rper gemessen. Es wurde gezeigt, dass CpG-Motive in dieser Zellinie in vitro eine Reaktivierung der HIV-Replikation bewirken. Dieser Effekt wurde nicht durch die PTO-Modifikation der CpG-ODN hervorgerufen, sondern war spezifisch f{\"u}r die CpG-Sequenzen. Eine Behandlung mit ODNs ohne CpG-Sequenzen f{\"u}hrte nicht zu einer Induktion der HIV-Replikation in ACH-2-Zellen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die verwendeten Cpg-Sequenzen die latent-infizierte T-Zellinie ACH-2 nicht aktivieren, sondern nur die Virusreplikation anstoßen. Versuche mit humanen nicht-infizierten PBMCs zeigten, dass CD3-positive Zellen, {\"a}hnlich wie ACH-2-Zellen, durch CpG-ODNs nicht aktiviert werden, CD3-negative PBMCs dagegen konnten durch die Behandlung mit CpG-ODNs aktiviert werden. Die Reaktivierung von HIV konnte durch die Inhibition verschiedener Transkriptionsfaktoren nicht wesentlich beeinflusst werden. Die NFkB-Inhibtoren CAPE und SN50 und der ERK-MAP-Kinase-Inhibtor UO126 verhinderten die durch CpG-ODNs induzierte HIV-Replikation in ACH-2 Zellen nicht. Unter dem Einfluss von CAPE wurde sogar ein geringf{\"u}giger Anstieg der Virusreplikation beobachtet. Dieser Effekt ist wahrscheinlich aber durch die intrinsische Aktivit{\"a}t von CAPE erkl{\"a}rbar. Die Frage nach den distalen Faktoren in den aktivierten Signalwegen muss also unbeantwortet bleiben. K{\"o}nnten die in dieser Arbeit in vitro beobachteten spezifischen Effekte der CpG-ODNs in vivo bei HIV-positiven Patienten ausgel{\"o}st werden, so w{\"a}re das ein Schritt mehr in Richtung der vollst{\"a}ndigen Eliminierung des Virus aus dem infizierten Organismus. Durch diese Methode k{\"o}nnten die Virusreservoirs in ruhenden T-Zellen, Makrophagen und dentritischen Zellen reaktiviert werden und w{\"a}ren so einer effizienten Therapie mit HAART zug{\"a}nglich. Als n{\"a}chster Schritt in diesem Bereich der Forschung sollten deswegen Versuche zu der Wirkung von CpG-Sequenzen auf chronisch-infizierte Zellen HIV-positiver Patienten unternommen werden, um die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ex vivo zu untersuchen.}, language = {de} } @phdthesis{Thakar2006, author = {Thakar, Juilee}, title = {Computational models for the study of responses to infections}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17266}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {In diesem Jahrhundert haben neue experimentelle Techniken und Computer-Verfahren enorme Mengen an Information erzeugt, die bereits viele biologische R{\"a}tsel enth{\"u}llt haben. Doch die Komplexit{\"a}t biologischer Systeme wirft immer weitere neue Fragen auf. Um ein System zu verstehen, bestand der Hauptansatz bis jetzt darin, es in Komponenten zu zerlegen, die untersucht werden k{\"o}nnen. Ein neues Paradigma verkn{\"u}pft die einzelnen Informationsteile, um sie auf globaler Ebene verstehen zu k{\"o}nnen. In der vorgelegten Doktorarbeit habe ich deshalb versucht, infekti{\"o}se Krankheiten mit globalen Methoden („Systembiologie") bioinformatisch zu untersuchen. Im ersten Teil wird der Apoptose-Signalweg analysiert. Apoptose (Programmierter Zelltod) wird bei verschiedenen Infektionen, zum Beispiel bei Viruserkrankungen, als Abwehrmaßnahme eingesetzt. Die Interaktionen zwischen Proteinen, die ‚death' Dom{\"a}nen beinhalten, wurden untersucht, um folgende Fragen zu kl{\"a}ren: i) wie wird die Spezifit{\"a}t der Interaktionen erzielt? -sie wird durch Adapter erreicht, ii) wie werden Proliferation/ {\"U}berlebenssignale w{\"a}hrend der Aktivierung der Apoptose eingeleitet? - wir fanden Hinweise f{\"u}r eine entscheidende Rolle des RIP Proteins (Rezeptor-Interagierende Serine/Threonine-Proteinkinase 1). Das Modell erlaubte uns, die Interaktions-Oberfl{\"a}chen von RIP vorherzusagen. Der Signalweg wurde anschließend auf globaler Ebene mit Simulationen f{\"u}r verschiedene Zeitpunkte analysiert, um die Evolution der Aktivatoren und Inhibitoren des Signalwegs und seine Struktur besser zu verstehen. Weiterhin wird die Signalverarbeitung f{\"u}r Apoptosis-Signalwege in der Maus detailliert modelliert, um den Konzentrationsverlauf der Effektor-Kaspasen vorherzusagen. Weitere experimentelle Messungen von Kaspase-3 und die {\"U}berlebenskurven von Zellen best{\"a}tigen das Modell. Der zweite Teil der Resultate konzentriert sich auf das Phagosom, eine Organelle, die eine entscheidende Rolle bei der Eliminierung von Krankheitserregern spielt. Dies wird am Beispiel von M. tuberculosis veranschaulicht. Die Fragestellung wird wiederum in zwei Aspekten behandelt: i) Um die Prozesse, die durch M. tuberculosis inhibiert werden zu verstehen, haben wir uns auf das Phospholipid-Netzwerk konzentriert, das bei der Unterdr{\"u}ckung oder Aktivierung der Aktin-Polymerisation eine große Rolle spielt. Wir haben f{\"u}r diese Netzwerkanalyse eine Simulation f{\"u}r verschiedene Zeitpunkte {\"a}hnlich wie in Teil eins angewandt. ii) Es wird vermutet, dass Aktin-Polymere bei der Fusion des Phagosoms mit dem Lysosom eine Rolle spielen. Um diese Hypothese zu untersuchen, wurde ein in silico Modell von uns entwickelt. Wir fanden heraus, dass in der Anwesenheit von Aktin-Polymeren die Suchzeit f{\"u}r das Lysosom um das F{\"u}nffache reduziert wurde. Weiterhin wurden die Effekte der L{\"a}nge der Aktin-Polymere, die Gr{\"o}ße der Lysosomen sowie der Phagosomen und etliche andere Modellparameter analysiert. Nach der Untersuchung eines Signalwegs und einer Organelle f{\"u}hrte der n{\"a}chste Schritt zur Untersuchung eines komplexen biologischen Systems der Infektabwehr. Dies wurde am Beispiel der Wirt-Pathogen Interaktion bei Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica dargestellt. Die geringe Menge verf{\"u}gbarer quantitativer Daten war der ausschlaggebende Faktor bei unserer Modellwahl. F{\"u}r die dynamische Simulation wurde ein selbst entwickeltes Bool'sches Modell verwendet. Die Ergebnisse sagen wichtige Faktoren bei der Pathologie von Bordetellen hervor, besonders die Bedeutung der Th1 assoziierten Antworten und dagegen nicht der Th2 assoziierten Antworten f{\"u}r die Eliminierung des Pathogens. Einige der quantitativen Vorhersagen wurden durch Experimente wie die Untersuchung des Verlaufs einer Infektion in verschiedenen Mutanten und Wildtyp-M{\"a}usen {\"u}berpr{\"u}ft. Die begrenzte Verf{\"u}gbarkeit kinetischer Daten war der kritische Faktor bei der Auswahl der computer-gest{\"u}tzten Modelle. Der Erfolg unserer Modelle konnte durch den Vergleich mit experimentellen Beobachtungen belegt werden. Die vergleichenden Modelle in Kapitel 6 und 9 k{\"o}nnen zur Untersuchung neuer Wirt-Pathogen Interaktionen verwendet werden. Beispielsweise f{\"u}hrt in Kapitel 6 die Analyse von Inhibitoren und inhibitorischer Signalwege aus drei Organismen zur Identifikation wichtiger regulatorischer Zentren in komplexen Organismen und in Kapitel 9 erm{\"o}glicht die Identifikation von drei Phasen in B. bronchiseptica und der Inhibition von IFN-\&\#947; durch den Faktor TTSS die Untersuchung {\"a}hnlicher Phasen und die Inhibition von IFN-\&\#947; in B. pertussis. Eine weitere wichtige Bedeutung bekommen diese Modelle durch die m{\"o}gliche Identifikation neuer, essentieller Komponenten in Wirt-Pathogen Interaktionen. In silico Modelle der Effekte von Deletionen zeigen solche Komponenten auf, die anschließend durch experimentelle Mutationen weiter untersucht werden k{\"o}nnen.}, subject = {Bordetella pertussis}, language = {en} } @phdthesis{Herold2005, author = {Herold, Marco}, title = {Der C-Terminus des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1 reguliert Stabilit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des Proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14459}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Die Stimulation von Lymphozyten durch alleinige Quervernetzung ihrer Antigenrezeptoren f{\"u}hrt in Abh{\"a}ngigkeit von der Signalst{\"a}rke zur Induktion von Apoptose. Dieser Prozess spielt im Rahmen der negativen Selektion von B-Zellen eine wichtige Rolle und kann am Beispiel von WEHI 231 Zellen, einer murinen Lymphomzelllinie modellhaft nachempfunden werden. Die Quervernetzung des B-Zellrezeptors (BZR) in WEHI 231 Zellen f{\"u}hrt in Abh{\"a}ngigkeit von der Prozessierung der mitochondrialen Caspase 9 zu Apoptose. Dies kann durch {\"U}berexpression des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1 verhindert werden. Interessanterweise besitzt A1 im Gegensatz zu Fast allen anderen Bcl-2 Proteinen keinen C-terminalen Bereich, der das Protein in intrazellul{\"a}re Membranen wie Mitochondrien und Endoplasmatisches Retikulum verankert. Ob und gegebenenfalls welche Bedeutung das C-terminale Ende f{\"u}r das Protein und dessen Funktion hat wurde in dieser Arbeit untersucht. Eine C-terminale Deletionsmutante wies im Vergleich zum Wildtyp eine h{\"o}here Proteinstabilit{\"a}t auf. Die Fusion der letzten 35 Aminos{\"a}uren von A1 an eine enzymatisch inaktive Form von Caspase 3 f{\"u}hrte zu einem sehr instabilen chim{\"a}ren Protein. Somit scheint der C-Terminus von A1 sowohl notwendig als auch hinreichend f{\"u}r die kurze Halbwertszeit des Proteins zu sein. Die meisten kurzlebigen Proteine werden {\"u}ber den proteasomalen Signalweg degradiert. Dies scheint auch f{\"u}r A1 zu gelten, da seine Halbwertszeit durch den Einsatz eines Proteasomeninhibitors verl{\"a}ngert wurde. In Koexpressionsstudien konnte zudem eine Ubiquitylierung von A1 beobachtet werden, welche bei der stabileren A1 Mutante stark reduziert war. A1 ist jedoch nicht immer instabil. In Anwesenheit des „BH3-only" Proteins Bim, das A1 direkt binden kann, wird die Halbwertszeit von A1 enorm erh{\"o}ht. Die antiapoptotische Funktion von A1 scheint sich jedoch nicht nur auf die Neutralisation durch bloße Bindung zu beschr{\"a}nken, da die Deletionsmutante trotz vergleichbarer Interaktion mit Bim einen sehr viel geringeren Schutz gegen Etoposid vermittelter Apoptose verlieh. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass das antiapoptotische Bcl-2 Familienmitglied A1 eine sehr kurze Halbwertszeit besitzt und das der C-Terminus nicht nur die Stabilit{\"a}t sondern auch die antiapoptotische Schutzfunktion f{\"u}r das Protein vermittelt.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Geis2005, author = {Geis, Steffen}, title = {Die Rolle des Signalmolek{\"u}ls Ca 2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17032}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurde das Thema "Die Rolle des Signalmolek{\"u}ls Ca2+ in der Signaltransduktion der SC-1-induzierten Apoptose" anhand von immunhisto-chemischen, proteinbiochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Methoden erarbeitet. Die SC-1-induzierte Apoptose stellt einen neuen intrinsischen, „death domain"-unabh{\"a}ngigen Signalweg in der Vermittlung des programmierten Zelltodes dar, der {\"u}ber die Bindung dieses Antik{\"o}rpers an CD55SC-1 ausgel{\"o}st wird. Dem Signalmolek{\"u}l Ca2+ galt besonderes Interesse bei der Charakterisierung der durch SC-1 ausgel{\"o}sten Signaltransduktion. Nach Aktivierung von CD55SC-1 durch SC-1 steigt das intrazellul{\"a}re Ca2+ um Faktor 2,7 an, stabilisiert sich danach auf dem 1,5fachen Ausgangsniveau. Dies hat keinerlei Einfluss auf die Ausf{\"u}hrung des Apoptoseprogramms, ist aber maßgeblich in das Expressionsverhalten involviert. Der Ca2+ - Einstrom ist somit nicht direkt in die Ausf{\"u}hrung der Apoptose beteiligt, durch die Hochregulation der Expression des Apoptoserezeptors verst{\"a}rkt es jedoch die Wahrscheinlichkeit der Tumorzelle, den programmierten Zelltod zu vollziehen, da durch die verst{\"a}rkte Expression dieses Apoptose-induzierenden Rezeptors auch die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere SC-1-Antik{\"o}rper binden k{\"o}nnen. Da die Quervernetzung mehrerer Rezeptoren mittels des SC-1-Antik{\"o}rpers in der Apoptoseinduktion von N{\"o}ten ist, stellt diese durch Ca2+ getriggerte {\"U}berexpression von CD55SC-1 einen essentiellen Bestandteil in der Exekution dieses Selbstmordprogrammes dar. Dieses Ergebnis gibt einen interessanten Einblick in den Signalweg der durch SC-1 induzierten Apoptose. Weiterf{\"u}hrende Experimente sind notwendig, um genauere Erkenntnisse dieser einzigartigen Form einer gewebespezifischen Apoptose zu erlangen.}, language = {de} } @phdthesis{Mackert2005, author = {Mackert, Katrin}, title = {Untersuchungen zur Apoptose durch das Kontakthapten NiCl 2 in humanen Nabelschnurendothelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16511}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Ziel unserer Untersuchungen war es, herauszufinden, ob das Kontakthapten und Umweltgift Nickelchlorid im Vergleich zum etablierten Apoptoseinduktor TNF programmierten Zelltod in Endothelzellen ausl{\"o}sen kann. In Gegenwart des Proteinsyntheseinhibitors Cycloheximid sowie des Transkritionsinhibitors Actinomycin D zeigte sich eine dosisabh{\"a}ngige Zunahme der Apotposerate, die offenbar eine Inhibition proteinsyntheseabh{\"a}ngiger und somit vor Apoptose sch{\"u}tzender Mechanismen erfordert. Die Synthese dieser zytoprotektiven Proteine ist von einer Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB abh{\"a}ngig, wie es auch nach Exposition mit Nickel beobachtet wird. Zur Untersuchung der Mechanismen der NiCl-vermittelten Apoptose setzten wir weiterhin den Caspaseinhibitor Z-VADfmk ein; dieser blockierte die NiCl/CHX-vermittelte DNA-Fragmentation und Apoptose vollst{\"a}ndig. Im Rahmen physiologischer wie auch pathophysiologischer Vorg{\"a}nge werden Endothelzellen oxidativem Streß in Form reaktiver Sauerstoffradikale ausgesetzt, die zu einer Heraufregulation von Fas und seines Liganden FasL, welche einen bedeutende Rolle bei der Initiierung des programmierten Zelltods spielen, f{\"u}hren. Nickel bewirkt {\"a}hnlich wie freie Sauerstoffradikale eine Heraufregulation beider Parameter, erfordert hierf{\"u}r aber die Gegenwart von CHX. Weiterhin wurde der Einfluß der Mitogen-aktivierbaren (MAP-)-Kinase p38 auf die NiCl-vermittelte DNA-Fragmentation studiert. P38 wird nach Exposition mit Nickel, {\"a}hnlich wie nach Stimulation mit TNF, aktiviert; eine Hemmung dieser Kinase mit dem pharmakologischen Inhibitor SB 202190 steigert die Nickelchlorid-induzierte Apoptoserate. Zusammenfassend belegt diese Studie, daß Nickel, welches als Kontaktallergen, als Umweltgift sowie als Bestandteil mancher Prothesematerialien im Kontext der Biokompatibilit{\"a}t medizinisch relevant sein kann, {\"u}ber weitgehend noch undefinierte Signalwege DNA-Fragmentation und Apoptose von prim{\"a}ren humanen Endothelzellen vermittelt.}, language = {de} } @phdthesis{Wirth2005, author = {Wirth, Joachim}, title = {Intrazellul{\"a}re Mechanismen bei der durch den monomeren humanen IgM-Antik{\"o}rper PAM-1 induzierten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17256}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Der humane monoklonale IgM-Antik{\"o}rper PAM-1 induziert in seiner monomeren Form sowohl in vivo als auch in vitro Apoptose an Magenkarzinomzellen. Er bindet hierbei an den post-transskriptionell modifizierten Rezeptor CFR-1, der auf nahezu allen epithelialen Karzinomzellen und deren Vorl{\"a}uferl{\"a}sionen exprimiert wird. In dieser Arbeit werden die intrazellul{\"a}ren Mechanismen nach PAM-1/CFR-1-Bin- dung anhand von Protein(de)phosphorylierungen und deren selektiver Hemmung n{\"a}her charakterisiert. Die hierbei detektierten Protein(de)phosphorylierungen sind somit m{\"o}glicherweise essentielle Bestandteile der durch PAM-1 ausgel{\"o}sten Apoptose.}, language = {de} } @phdthesis{Keppler2005, author = {Keppler, Marc Thomas}, title = {Molekulare Analyse von pro- und antiapoptotischen Effektormolek{\"u}len bei der SC-1-vermittelten Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17246}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, language = {de} } @phdthesis{Lorenz2004, author = {Lorenz, Judith}, title = {Immunhistochemische und zellbiologische Analyse humaner monoklonaler Antik{\"o}rper gegen kolorektale Karzinome}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11532}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Drei verschiedene mit Hilfe der humanen Hybridomatechnologie aus einem Rektumkarzinompatienten isolierte humane monoklonale Antik{\"o}rper wurden immunhistochemisch und mit Hilfe zellbiologischer Tests untersucht. Die Ergebnisse der Immunperoxidasef{\"a}rbung geben erste Hinweise auf die Art und Verteilung der von den Antik{\"o}rpern erkannten Antigene. HH 98/81-33-154 und HH 99/71-81-149 f{\"a}rben nur wenige kolorektale Karzinome sowie einige Tumoren verschiedenen histologischen Ursprungs an und zeigen keine Reaktion mit normalen adulten oder fetalen Geweben. HH 101/99-14 reagiert dagegen außer mit zahlreichen Dickdarmkarzinomen auch mit einigen fetalen Geweben, was auf die Expression des spezifischen Antigens w{\"a}hrend der Fetalperiode schließen l{\"a}ßt. Neben den Kreuzreaktionen mit verschiedenen zentralnerv{\"o}sen Strukturen adulter Normalgewebe, die im Hinblick auf paraneoplastische neurologische Krankheitsbilder von Interesse sind, zeigt der Antik{\"o}rper weiterhin eine Affinit{\"a}t zu dr{\"u}sig differenzierten Tumoren. Im MTT-Assay auf Zellen der Kolonkarzinomzellinie CACO-2 bewirkte unverd{\"u}nnter Zellkultur{\"u}berstand der Antik{\"o}rper HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 eine starke Proliferationshemmung. Dieser Effekt konnte sowohl nach 24- als auch nach 48st{\"u}ndiger Inkubation, nicht jedoch mit verd{\"u}nntem {\"U}berstand nachgewiesen werden. Mit {\"U}berstand von HH 99/71-81-149 war hingegen nur eine schwache Hemmung mitochondrialer Dehydrogenasen zu verzeichnen. Zellen der Linien HT-29, COLO 206F sowie COLO 320 zeigten sich hingegen resistent gegen die antik{\"o}rpervermittelte Wachstumshemmung. Mit Hilfe des Cell Death Detection ELISAPLUS{\`O} konnte weiterhin belegt werden, daß HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 nicht nur das Wachstum von Tumorzellen hemmen, sondern {\"u}berdies auf der Zellinie CACO-2 Apoptose induzieren. In beiden funktionellen Tests {\"u}berstieg die gemessene Aktivit{\"a}t des niedriger konzentrierten HH 98/81-33-154 die von HH 101/99-14. Die relativ geringe Anzahl von Kreuzreaktionen mit gesundem Gewebe sowie die apoptoseinduzierende Aktivit{\"a}t von HH 98/81-33-154 und HH 101/99-14 unterstreichen die Eignung der Antik{\"o}rper als potentielle Immuntherapeutika f{\"u}r die adjuvante Behandlung des kolorektalen Karzinoms, einer weltweit zu den h{\"a}ufigsten Krebsarten z{\"a}hlenden Tumorerkrankung.}, language = {de} } @phdthesis{Weber2004, author = {Weber, Florian}, title = {Screening der apoptoseinduzierenden Interaktionen von Nephrotoxinen unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung von Ochratoxin A}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9821}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80\% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt haupts{\"a}chlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im t{\"a}glichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl m{\"o}glicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivit{\"a}t und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten anges{\"a}t wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung best{\"a}tigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von hom{\"o}ostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abh{\"a}ngig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. f{\"u}r H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, w{\"a}hrend NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten {\"u}berwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabh{\"a}nigig.}, language = {de} } @phdthesis{Czisch2004, author = {Czisch, Michael}, title = {Die Rolle von Bcl-2 bei der UV- und TRAIL-induzierten Keratinozytenapoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10903}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgel{\"o}sten Apoptosewege n{\"a}her. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung l{\"o}sen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich sp{\"a}ter ein, n{\"a}mlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die {\"U}berexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabh{\"a}ngig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verz{\"o}gert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen k{\"o}nnen sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen gesch{\"u}tzt.}, language = {de} } @phdthesis{Embaye2004, author = {Embaye, Ulrike}, title = {Expression des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in Zellen des Hodgkin-Lymphoms und des großzelligen anaplastischen Lymphoms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13211}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war es, zum einen Unterschiede in der NF-kappaB-Zusammensetzung zwischen HD- und LCAL-Zelllinien und zum anderen anhand der NF-kappaB-Verteilung das in der Literatur beschriebene Verhalten der jeweiligen Zellen bez{\"u}glich Proliferation und Apoptose zu analysieren. In beiden untersuchten Zelllinien wurden die NF-kappaB-Faktoren p50 und p65 konstitutiv nukle{\"a}r exprimiert. In den HD-Zelllinien fand sich zus{\"a}tzlich konstitutives c-Rel, in den LCAL-Zelllinien dagegen konstitutives RelB. Diese vier Faktoren zeigten auch in den jeweiligen Zellen konstitutive Bindungsaktivit{\"a}t. Die NF-kappaB-Faktoren k{\"o}nnen als Marker f{\"u}r verschiedene Entwicklungsstufen h{\"a}matopoetischer Zellen dienen. Die konstitutiven nukle{\"a}ren NF-kappaB-Faktoren p50 und c-Rel in HD-Zellen wiesen auf B-Zell-typische Eigenschaften hin. Allerdings spricht das in der HD-Zelle HDLM-2 {\"u}berwiegend im Zytoplasma lokalisierte c-Rel f{\"u}r T-Zell-typische Eigenschaften. In LCAL-Zellen dagegen lassen die konstitutiven nukle{\"a}ren NF-kappaB-Faktoren p50 und RelB einen T-Lymphozyten als Ursprungszelle erkennen. Die konstitutive NF-kappaB-Aktivit{\"a}t in HD-Zelllinien konnte im Vergleich mit den Ergebnissen anderer Forschergruppen best{\"a}tigt werden. Im Gegensatz zu den Arbeiten in der Literatur konnten bei den LCAL-Zellen konstitutiv aktive p65/p50-Heterodimere als auch RelB/p50-Heterodimere nachgewiesen werden. Obwohl p65 in den meisten menschlichen Zellen induziert wird, wurde p65 in beiden Zelllinien konstitutiv nukle{\"a}r exprimiert. Dies k{\"o}nnte ein Indiz f{\"u}r ein dereguliertes NF-kappaB-System in beiden Zelllinien sein und damit m{\"o}glicherweise die entkoppelte Funktion bez{\"u}glich Apoptose und Proliferation erkl{\"a}ren. Nach Stimulation des Oberfl{\"a}chenrezeptors CD30 mit dem agonistischen monoklonalen Antik{\"o}rper M44 konnte in der vorliegenden Arbeit keine NF-kappaB-Induktion festgestellt werden. Nach PMA-Ionomycin-Stimulation fiel in LCAL-Zellen die Aktivit{\"a}t des p65/p50-Komplexes nach vier Stunden ab, in HDLM-2-Zellen nahm sie nach vier Stunden und in KMH-2-Zellen nach einer Stunde zu. Die Komplexe mit den Faktoren RelB in LCAL-Zellen und c-Rel in HD-Zellen hatten eine unver{\"a}nderte Bindungsaktivit{\"a}t. Die CD30-Stimulation f{\"u}hrte in HD-Zellen zur Proliferation. F{\"u}r KMH-2 sind die Aussagen in der Literatur allerdings widerspr{\"u}chlich: teilweise zeigte sie keine Auswirkung, teilweise kam es zur Proliferation. Wird die konstitutive NF-kappaB-Aktivit{\"a}t in HD-Zellen gehemmt, reagieren die Zellen mit Apoptose. Der p65-Faktor ist bekannt f{\"u}r seine Apoptose-hemmende Eigenschaft. Die zunehmende p65/p50-Aktivit{\"a}t in HD-Zellen k{\"o}nnte die Zellen zur Proliferation anregen. Außerdem kam es ausschließlich in HD-Zellen zur Expression von c-Rel. Dieser Faktor ist in einigen Zellen ebenfalls f{\"u}r das {\"U}berleben notwendig. In LCAL-Zellen folgt der CD30- Aktivierung die Apoptose. In diesen Zellen nimmt die p65-Bindungsaktivit{\"a}t ab, was darauf hinweist, dass sie der Apoptose ausgesetzt sind. RelB wird nur in LCAL-Zellen exprimiert. RelB besitzt eine Doppelrolle: als Komplex mit p50 oder p52 ist er ein positiver Transaktivator, als Komplex mit p65 beeinflusst er die KappaB-abh{\"a}ngige Genexpression negativ. Die starke Konzentration von RelB im Zytoplasma und im Zellkern und die trotz steigender p65-Expression abnehmende p65-Aktivit{\"a}t k{\"o}nnte ein Hinweis auf das inaktivierte p65 und damit eine weitere Erkl{\"a}rung f{\"u}r die Apoptose der LCAL-Zellen sein.}, language = {de} } @phdthesis{Vukicevic2004, author = {Vukicevic, Vladimir}, title = {Mechanisms of apoptosis modulation and their contribution to genomic instability in tumor cells}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10605}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {The concept of programmed cell death has been increasingly considered from various aspects since early 1970's. Primarily, knowledge of apoptosis referred to morphological changes in which chromatin is condensed and increasingly fragmented, revealed as small structure in the nucleus. The membrane shrinks and the cell becomes dense as can be seen by flow cytometry. Interestingly, similar modes of cell deletion were observed in nematodes indicating that apoptosis is a highly conserved machinery. Three Caeonorhabditis elegans gene products are found to have high homology with mammalian apoptotic genes: CED-9 inhibits apoptosis and is related to bcl-2; CED-3 and CED-4 promote apoptosis and are related to caspase 9 and APAF-1. Apoptosis is not accidental death, but a highly controlled and medically important molecular process. More general terms such as 'physiological' or 'regulated' cell death cover different morphologies and sequences. Programmed suicide of cells that were subjected to toxic exogenous and endogenous stimuli plays a key role in understanding cancer development and its treatment. Apoptosis involves sequences of events that may overlap and play contradictory or antagonistic roles in cell death. Generally, the ability to trigger apoptotic processes in cancer cells would benefit an organism by keeping homeostasis intact. Programmed cell death is a regularly present mechanism, for instance, in lymphocyte recruitment in the thymus where immature lymphocytes may recognize host antigens. Therefore, such lymphocytes become apoptotic and are removed by macrophages. Removal prevents possible autoimmune diseases. Unlike apoptosis, necrosis is a passive process of cell death recognizable by membrane morphological changes and accompanied by leakage of intracellular material into intercellular space that may cause inflammation in the organism. Signals that may initiate apoptosis are generally classified into two groups: signals that launch extrinsic apoptotic pathways starting with aggregation of death receptors and intrinsic apoptotic pathways starting with disruption of intracellular homeostasis such as the release of mitochondrial factors or DNA degradation. Early in the process, apoptotic signals may lead to a broad range of signaling mechanisms such as DNA repair and assessment of DNA damage (check points). Thus, failure in any of these steps can cause a defective apoptotic response that plays a decisive role in both tumorigenesis and drug resistance in tumor treatment. More distinctly, the capability of cancer cells to go into apoptosis prevents further neoplastic changes. Generally, the purpose of this study is to investigate the balance between formation of genomic damage and induction of apoptosis under genotoxic stress. After genotoxic insult there are different possibilities for the fate of a cell (Figure 1). The genomic integrity is analyzed at cellular checkpoints, usually leading to a delay in cell cycle progression if DNA was damaged. Mutations in genes such as p53 and p21 change the cellular response to genotoxic stress and may alter the balance between apoptosis and genomic damage. However, p53 is usually mutated or not expressed in 70\% of human tumors. Alterations in p53 states that reflect distinct apoptotic response upon induction of DNA damage were examined. In this study, three cell lines with distinct p53 states were used: TK6 harboring wild-type p53, WTK1 with mutated p53 and NH32 with knocked out p53. In the present work we applied different approaches to investigate the correlation between DNA damage and apoptotic responsiveness in cancer cell lines with different p53 states or in hormone responsive cell lines with over expressed bcl-2 gene. We were focused on effects caused by temporary down regulation of the p53 and Bcl-2 activity in human lymphoblastoid cell lines. In addition, we investigated the impact of estradiol-induced proliferation on apoptosis and DNA damage in stably transfected cells with bcl-2gene.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{Hassel2003, author = {Hassel, Jessica C.}, title = {Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {{\"U}berexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus f{\"u}hrt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung f{\"u}hrt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden k{\"o}nnen, scheinen somit {\"u}ber entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion verf{\"u}gen zu m{\"u}ssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu geh{\"o}ren die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk, deren extrazellul{\"a}rer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellul{\"a}rer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abh{\"a}ngigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen f{\"u}hrt zu IL-3 unabh{\"a}ngigem Wachstum und zu Langzeit{\"u}berleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeit{\"u}berleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeit{\"u}berleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer h{\"o}heren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verk{\"u}rzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß f{\"u}r die Ausl{\"o}sung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, w{\"a}hrend f{\"u}r eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und f{\"u}r Langzeit{\"u}berleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf f{\"u}r die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine f{\"u}hrt, w{\"a}hrend der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß f{\"u}r die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber m{\"o}glicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verst{\"a}rken. F{\"u}r die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das f{\"u}r ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schw{\"a}chere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, w{\"a}hrend der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 f{\"u}hren. Da diese Mutante kein Langzeit{\"u}berleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend f{\"u}r Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeit{\"u}berleben zu sichern. Expression der Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk in murinen Melanozyten f{\"u}hrt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivit{\"a}t von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, w{\"a}hrend STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivit{\"a}t aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein {\"a}hnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen f{\"u}hrt (Wellbrock, unver{\"o}ffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend f{\"u}r die Antiapoptose von Melanomen zu sein.}, language = {de} } @phdthesis{Stocker2003, author = {Stocker, Hartmut}, title = {Untersuchungen zum Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12052}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Der Pathomechanismus des T-Helferzellverlusts bei der HIV-Infektion ist bisher ungekl{\"a}rt. Diese Arbeit zeigt, dass prim{\"a}re, HIV-uninfizierte CD4+ Zellen in Kontakt mit HIV-infizierten Zellen zugrundegehen. Zur Aufkl{\"a}rung des Mechanismus dieses Zelltodes wurden einzelne Schritte der Zellfusion zwischen infizierten und uninfizierten Zellen mit Antik{\"o}rpern und Peptiden blockiert, und die Auswirkung dieser Blockade auf den Zelltod bestimmt. Dabei zeigte sich dass die Blockade jedes Schritts der Fusion von nicht-infizierten und infizierten Zellen den Zelltod der uninfizierten Zellen verhindert. Weiter wurde gezeigt, dass im Verlauf des Zelluntergangs Apoptose auftritt, diese aber f{\"u}r den Zellverlust keine notwendige Voraussetzung ist.}, language = {de} } @phdthesis{Kudlich2003, author = {Kudlich, Theodor}, title = {Verst{\"a}rkung Butyrat induzierter Apoptose in kolorektalen Karzinomzellen durch Aspirin und Tumor Nekrose Faktor alpha}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7164}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Epidemiologische Studien weisen auf einen protektiven Einfluß einer ballaststoffreichen Ern{\"a}hrung gegen{\"u}ber der Entstehung eines kolorektalen Karzinoms hin. Die kurzkettige Fetts{\"a}ure Butyrat ist ein wichtiges Produkt bakterieller Fermentation von Ballaststoffen bzw. von unverdaubaren Kohlenhydraten im Kolon. Butyrat hat paradoxe Effekte auf Epithelzellen des Kolons: Haupternergietr{\"a}ger und Wachstumsstimulator normaler Mukosa einerseits, Proliferationshemmer und Apoptoseinduktor kolorektaler Karzinomzellen in vitro andererseits. Auch f{\"u}r NSAID wie Aspirin belegen epidemiologische Studien einen chemoprotektiven Effekt gegen{\"u}ber dem Kolonkarzinom. F{\"u}r das Zytokin TNFalpha werden einerseits apoptoseinduzierende Effekte f{\"u}r kolorektale Karzinomzellen in vitro beschrieben, jedoch gelten einige Kolonkarzinomzellinien als resistent gegen TNFalpha. Andererseits besitzt TNFalpha auch proinflammatorische und antiapoptotische Wirkung {\"u}ber Aktivierung des nukle{\"a}ren Faktors kappa B (NF-kappaB). In der vorliegenden Arbeit wurden die Einfl{\"u}sse sowohl von Aspirin als auch von TNFalpha auf die durch Butyrat induzierte Apoptose an humanen kolorektalen Karzinomzellinien untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein durchflußzytometrischer Annexin V - Propidiumjodid - Assay etabliert. Mit Hilfe dieses Assays konnte gezeigt werden, daß der Apoptose induzierende Effekt sich sowohl durch eine Kombination mit Aspirin als auch durch eine Kombination mit TNFalpha im Sinne einer additiven Wirkung steigern l{\"a}ßt. Der Einfluß von Butyrat auf die antiapoptotische Wirkung von TNFalpha {\"u}ber Modulation von NF-kappaB wurde in einem Electophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) untersucht. Die Verst{\"a}rkung der Butyrat-induzierten Apoptose durch eine Kombination mit TNFalpha ist mit einer Hemmung der TNFalpha induzierten Aktivierung von NF-kappaB assoziiert. In einem RNase Protection Assay war auf mRNA-Ebene keine Beeinflussung der NF-kappaB abh{\"a}ngigen antiapoptotischer Faktoren (TRAF-1 und -2, c-IAP1 und 2 und XIAP) durch Butyrat nachweisbar. Die Verst{\"a}rkung der Apoptose durch TNFalpha zeigt, daß Butyrat in seiner protektiven Wirkung in der Lage ist, neben einer direkten Beeinflussung der Kolonozyten auch auf k{\"o}rpereigene Signalwege zu wirken. Die Untersuchungen dieser Arbeit leisten einen Beitrag zur weiteren Kl{\"a}rung der molekularen Grundlagen der Butyratwirkung auf Kolonepithelzellen. Evtl. besteht in Zukunft die M{\"o}glichkeit, Butyrat als adjuvantes Therapeutikum bei Pr{\"a}vention und Therapie kolorektaler Karzinome zu verwenden.}, language = {de} } @phdthesis{Kreth2003, author = {Kreth, Florian}, title = {Modulation apoptose- und zellzyklusregulierender Faktoren in Kolonkarzinomzellen durch Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8320}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Epidemiologische Studien zeigen, daß eine regelm{\"a}ßige Einnahme von Acetylsalicyls{\"a}ure und eine ballaststoffreiche Ern{\"a}hrung die Inzidenz und Mortalit{\"a}t des kolorektalen Karzinoms senken. Ein Großteil der protektiven Ballaststoffeffekte wird der kurzkettigen Fetts{\"a}ure Butyrat zugeschrieben, die durch bakterielle Fermentation von nicht-resorbierbaren Kohlenhydraten im Kolon entsteht. Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure modulieren eine Reihe von Faktoren, die den Zellzyklus und Apoptose regulieren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Acetylsalicyls{\"a}ure und Butyrat in Kombination den Zellzyklusinhibitor p21 in Kolonkarzinomzellen synergistisch induzieren.}, language = {de} } @phdthesis{Wurzer2003, author = {Wurzer, Walter}, title = {Die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-KappaB in Influenza-A-Virus infizierten Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5901}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Die Aktivierung von Transkriptionsfaktors NF-kB ist ein Charakteristikum viraler Infektionen, einschließlich der Infektion durch Influenza-A-Viren (Hiscott J. et al., 2001). Da die Expression vieler proinflammatorischer und antiviraler Zytokine, wie IFNb oder TNF-a durch NF-kB kontrolliert wird, hat sich ein Konzept entwickelt, welches besagt, dass NF-kB und sein {\"u}bergeordneter Aktivator IKK wichtige Bestandteile der angeborenen, antiviralen Immunit{\"a}t im Kontext einer Infektion mit RNA-Viren sind (Chu WM. Et al., 1999). Im Gegensatz zu dieser weithin akzeptierten Ansicht, wurde in der hier vorliegenden Arbeit gezeigt, dass die Aktivierung von NF-kB f{\"u}r eine effiziente Influenzareplikation von großer Wichtigkeit ist. Auf einer molekularen Ebene wurde dies durch die NF-kB-abh{\"a}ngige virale Aktivierung des proapoptotischen Faktors TRAIL gezeigt, welcher die Virusvermehrung sowohl auto- als auch parakrin erh{\"o}ht. Somit kann man sagen, dass NF-kB im Kontext einer Influenza-A-Virusinfektion sowohl proapoptotisch als auch proviral wirkt. Die Induktion der Apoptose ist ein weiteres, charakteristisches Merkmal, das man im Zusammenhang mit Virusinfektionen beobachten kann. Da die Rolle der Apoptose w{\"a}hrend einer Influenza-A-Virusinfektion noch unklar war, wurde diese Frage adressiert. Dabei wurde versucht mit einem wichtigen, virus-induzierten Apoptose-Effektor, n{\"a}mlich Kaspase-3 zu interferieren. {\"U}berraschenderweise wurde die Influenzavermehrung in Anwesenheit eines Kaspase-3-Inhibitors stark negativ beeinflusst. Im Einklang mit diesem Befund konnte gezeigt werden, dass die Virustiter in Zellen, in denen XIAP {\"u}berexprimiert wurde, r{\"u}ckl{\"a}ufig waren. Gegengleich f{\"u}hrte {\"U}berexpression von Prokaspase-3 zu einem Titeranstieg. Mechanistisch scheint der Blockade der Virusvermehrung eine Retention der viralen RNP-Komplexe im Zellkern zu Grunde zu liegen, die die Bildung von reifen Viruspartikel verhindert. Die Erkl{\"a}rung d{\"u}rfte in der Aktivit{\"a}t von Kaspase-3 zu finden sein, die an dem Abbau von Kernporenkomplexproteinen in apoptotischen Zellen beteiligt ist und was in Folge die freie Diffusion viraler RNPs erm{\"o}glichen d{\"u}rfte. Abschließend entwickelte sich aufgrund der vorliegenden Arbeit eine neue Hypothese {\"u}ber die Rolle des IKK-NF-kB-Signalweges, seinen Einfluss auf die Apoptoseregulation in Influenza-infizierten Zellen und der Auswirkung auf das Virus.}, subject = {Nuklearfaktor Kappa B}, language = {de} } @phdthesis{Kilic2002, author = {Kilic, Mehtap}, title = {Formation of caspase activating complexes and activation of caspase-12 during apoptosis in AKR-2B mouse fibroblasts}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7190}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Der Zelltod kann in Dichte-arretierten AKR-2B Mausfibroblasten durch Entzug des Serums oder Behandlung mit Anisomycin induziert werden. Der Zelltod zeigt zwar die f{\"u}r die Apoptose typischen morphologischen Ver{\"a}nderungen der Zelle wie Zellfragmentierung und Chromatinkondensation jedoch fehlen andere apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder {\"A}nderung des Membranpotentials der Mitochondria. W{\"a}hrend der Apoptose wurde eine beachtliche DEVDase Aktivit{\"a}t nach- gewiesen, die einem einzelnen Enzym zugeordnet werden konnte. Dieses Enzym hatte typische Eigenschaften von Effektor-Caspasen, wie die der Caspase-3, besaß jedoch einen ungew{\"o}hnlich hohen KM Wert von 100 µM, und die Molmasse der großen Untereinheit betrug 19 kDa anstelle der erwarteten 17 kDa. Mit Hilfe des rekombinanten mCaspase-3 Proteins wurde dieses Enzym in der vorliegenden Untersuchung als Caspase-3 identifiziert. Die N-terminale Sequenzierung des mCaspase-3 Proteins ergab, daß sich die Spaltstelle seiner Prodom{\"a}ne von der des humanen homologen Proteins unterschied (Asp-9 von Asp-28). Somit betrug die Molmasse der großen Untereinheit der aktiven Caspase-3 19 kDa. Dar{\"u}berhinaus stimmte der KM-Wert der rekombinanter mCaspase-3 von ~100 µM mit der {\"u}berein, die in Zellextrakten bestimmt wurde. Die Affinit{\"a}tmarkierung in Kombination mit einer 2D-Gelelektrophorese best{\"a}tigte, daß tats{\"a}chlich Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase in AKR-2B-Zellen w{\"a}hrend der Apoptose aktiviert wird. Im Folgenden wurde untersucht, welcher Signalwege in AKR-2B-Zellen, denen Serum aus dem N{\"a}hrmedia entzogen wurden war oder die mit Anisomycin behandelt worden waren, zur Aktivierung der Caspase-3 f{\"u}hrt. Da eine Beteiligunug des Rezeptor-vermittelte Signalweges bereits zuvor ausgeschlossen worden war,wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob der mitochondrial vermittelte Signalweg bei der Aktivierung von Caspase-3 ein Rolle spielt. Gelfiltrations- experimente ergaben, daß Caspase-3 als freies Enzym und nur in geringen Mengen innerhalb unterschiedlich große Komplexe der Molmassen 600 kDa und 250 kDa eluiert wird. Obwohl die apparenten Molmassen der Caspase-3-haltigen Komplexe mit k{\"u}rzlich ver{\"o}ffentlichten Daten {\"u}bereinstimmten, enthielten sie weder Apaf-1 noch Caspase-9. Dies deutet daraufhin, daß der mitochondrial-vermittelte Signalweg ebenfalls nicht an der Caspase-3 Aktivierung beteiligt ist. Dar{\"u}berhinaus wurde ein neuer Caspase-6 enthaltender Komplex (450 kDa) nach Serumentzug in AKR-2B-Zellen gefunden, der sich deutlich von Caspase-3 haltigen Komplexen unterscheidet. Caspase-3 ist f{\"u}r die meisten morphologische Ver{\"a}nderungen w{\"a}hrend der Apoptose verantwortlich. Wahrend der Apoptose in der AKR-2B-Zellen zwar Caspase-3 als Haupt-Effektor-Caspase identifiziert worden war, jedoch keine intranukleosomale Fragmentierung nachgeweisen werden konnen, da bei wurde die intrazellul{\"a}re Lokalisation der Caspase-3 untersucht. Durch {\"U}berexpression eines Caspase-3-GFP Fusionskonstruktes in AKR-2B Zellen wurde die Procaspase-3 im Cytoplasma lokalisiert, w{\"a}hrend die aktive Caspase-3 vorwiegend in membranumh{\"u}llten Vesikeln und zum Teil im Cytoplasma aktiviert wurde. Ebenfalls wurde eine m{\"o}gliche Beteiligung von Caspase-12 und eine ER-Streß vermittelte Signalleitung an der Apoptose in AKR-2B-Zellen untersucht. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß Caspase-12 im Fall von Serumentzug oder Behandlung mit Anisomycin zeitgleich mit Caspase-3 aktiviert wurde, was zur Bildung von zwei Spaltprodukte der Molmassen 47 kDa und 35 kDa f{\"u}hrte. Gelfiltrationsexperimente ergaben, daß Caspase-12 als freies Enzym w{\"a}hrend der Apoptose auftritt. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde in allen Publikationen beschrieben, daß Caspase-12 in Folge von ER-Streß aktiviert wird. Nach Serumentzug oder Zugabe von Anisomycin zu AKR-2B-Zellen wurde jedoch kein Anstieg der Synthese des Chaperon-Proteins Grp78, einem Marker f{\"u}r ER-Streß, beobachtet. Dies zeigt, daß beide Behandlungen nicht zur ER-Streß f{\"u}hren. Im Gegensatz dazu erzeugten bekannte Indikatoren von ER Streß wie Thapsigargin und A23187 (ionophor) ER-Streß in AKR-2B-Zellen, was zu unspezifischem Abbau der Caspase-12 f{\"u}hrte. Darum ist es unwahrscheinlich, daß in AKR-2B- Zellen Caspase-12 bei ER-Streß aktiviert wird. Zusammenfassend zeigten diese Daten, daß Caspase-12 in AKR-2B-Zellen {\"u}ber Signalwegen aktiviert wird, die ER stress un- abh{\"a}ngig sind und zeigen daß Caspase-3 bei der Aktivierung von Caspase-12 beteiligt ist somit liefern die vorliegenden Untersuchungen einen Hinweis darauf daß neben den klassischen Signalwege weitere Signalwege existieren, die zur Apoptose f{\"u}hrten.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{SchulzeLuehrmann2002, author = {Schulze-L{\"u}hrmann, Jan}, title = {Die H{\"a}matopoetische Progenitor Kinase (HPK) 1 und NFAT-Transkriptionsfaktoren unterst{\"u}tzen die Apoptose von T-Lymphozyten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3074}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Expression der H{\"a}matopoetischen Progenitor Kinase 1 (HPK1), einem Mitglied der Familie der „Germinal Centre" Kinasen, ist im adulten Organismus auf die Zellen des h{\"a}matopoetischen Systems beschr{\"a}nkt. Die HPK1 wurde urspr{\"u}nglich als ein Aktivator des JNK-Signal{\"u}bertragungsweges beschrieben [Hu et al., 1996; Kiefer et al., 1996], und k{\"u}rzlich wurde eine transiente Aktivierung der HPK1 nach TZR-Stimulation nachgewiesen. Auch wurde eine Assoziation der HPK1 mit dem Linker aktivierter T-Zellen (LAT) und den Adaptorproteinen Nck, Crk, Gads, Grb2, Grap, CrkL sowie SLP-76 gezeigt. F{\"u}r die Aktivierung der nach TZR-Stimulation in den Lipid-Rafts lokalisierten HPK1 sind sowohl Lck als auch ZAP-70 notwendig [Liou et al., 2000; Liu et al., 2000a; Ling et al., 2001]. Diese Daten legen eine m{\"o}gliche Funktion von HPK1 bei der TZR-vermittelten Signal{\"u}bertragung nahe. Trotzdem konnte bisher eine physiologische Rolle der HPK1 im Rahmen der Immunrezeptor-Signal{\"u}bertragung nicht nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wird dargestellt, dass eine wichtige Funktion der HPK1 in T-Zellen nach TZR-Stimulation, die durch die F{\"o}rderung des Aktivierungs-induzierten Zelltodes (AICD) vermittelt wird, in der Kontrolle der Termination der Immunantwort und damit Hom{\"o}ostase des Immunsystems besteht. Dies wurde durch retrovirale {\"U}berexpression der wildtypischen (wt) HPK1 in murinen CD4+ T-Zellen nachgewiesen, in denen die HPK1 zu einem Anstieg der spontanen und antiCD3-vermittelten Apoptose sowie zu einer gesteigerten Expression des Fas-Liganden (FasL oder auch CD95L) f{\"u}hrte. Die Expression einer HPK1-„antisense" (AS)-RNA in CD4+ T-Zellen bewirkte dagegen eine schwache, jedoch signifikant nachweisbare Hemmung der Apoptose und FasL-Expression. Die Apoptose-Hemmung durch die HPK1-AS-RNA war besonders stark in H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen ausgepr{\"a}gt, in denen die {\"U}berexpression der wt HPK1 den durch reaktive Sauerstoffmetabolite (ROS) induzierten Zelltod verst{\"a}rkte. Aus diesen Daten folgt, dass die HPK1 die T-Zell-Apoptose reguliert. In H2O2-stimulierten EL-4 T-Zellen f{\"u}hrt die HPK1-Expression zu einer verst{\"a}rkten und anhaltenden Aktivierung der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK), die wahrscheinlich an der HPK1-vermittelten Apoptoseinduktion beteiligt ist. Unter den gleichen Bedingungen konnte eine schnelle Spaltung der HPK1 beobachtet werden. Die {\"U}berexpression der N- oder C-terminalen Spaltprodukte in CD4+ T-Zellen f{\"u}hrte - wie die der Gesamt-HPK1 - zu einem Anstieg des AICD. In {\"U}bereinstimmung mit publizierten Daten konnten wir eine Hemmung der NFkB-Aktivit{\"a}t durch das C-terminale HPK1-Peptid nachweisen, das die IkBalpha-Degradation inhibiert. Die erzielten Ergebnisse f{\"u}hrten uns in ihrer Gesamtheit zu folgendem Modell: w{\"a}hrend der Initiationsphase der T-Zell-Stimulierung werden nach schneller, transienter HPK1-Aktivierung pro- und anti-apoptotische Signale durch den JNK- und NFkB-Signal{\"u}bertragungsweg vermittelt. Durch die Akkumulation der C-terminalen HPK1-Spaltprodukte kommt es sp{\"a}ter zur Inhibierung der NFkB-Aktivit{\"a}t und damit zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den {\"U}berlebens- und Apoptose-stimulierenden Signalen zugunsten des AICD. Allerdings gibt es sicherlich weitere Faktoren und Signalwege, die an der HPK1-vermittelten Kontrolle der T-Zell-Apoptose beteiligt sind und von deren Untersuchung ein detaillierteres Verst{\"a}ndnis der HPK1-Physiologie erwartet wird. Die Nukle{\"a}ren Faktoren aktivierter T-Zellen (NFAT´s) geh{\"o}ren zu einer Familie von Transkriptionsfaktoren, denen eine konservierte, ca. 300 Aminos{\"a}uren (aa) große DNA-Bindedom{\"a}ne und eine Calcineurin-Bindedom{\"a}ne gemeinsam ist. NFATc (auch NFATc1 oder NFAT2 genannt) und NFATp (NFATc2 oder NFAT1) werden in peripheren T-Zellen stark exprimiert und kontrollieren deren Effektorfunktionen u.a. {\"u}ber die Expression von IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IFNgamma und weiterer Lymphokine. Weitere von den NFAT´s kontrollierte Gene sind p21WAF1, der CD40L und der CD95L. Somit scheinen die NFAT´s bei der Zellzyklus-Kontrolle und beim AICD von T-Lymphozyten eine wichtige Rolle zu spielen. Daten unseres Labors zeigten, dass die T-Zell-Aktivierung zu einer massiven Induktion der kurzen Isoform A von NFATc innerhalb von 3-4 h f{\"u}hrt [Chuvpilo et al., 1999b], noch vor dem Start des AICD. Dies ließ vermuten, dass sich die biologische Funktion von NFATc/A durch das Fehlen des C-terminalen Peptids von ca. 245 aa, das in allen anderen NFAT-Proteinen einschließlich der l{\"a}ngeren Isoform NFATc/C vorhanden ist, unterscheidet. Deshalb sollte in der vorliegenden Arbeit die Induktion und Funktion von NFATc/A in murinen T-Lymphozyten untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektion prim{\"a}rer CD4+ T-Lymphozyten mit NFATc/A-exprimierenden rekombinanten Retroviren, im Gegensatz zu der mit NFATc/C- oder NFATp-exprimierenden Retroviren, den AICD unbeeinflusst l{\"a}sst. Dies deutet darauf hin, dass es durch die massive NFATc/A-Synthese nach Effektor-T-Zell-Aktivierung zur Induktion von Effektor-Funktionen kommt, ohne dass dabei die T-Zell-Apoptose beschleunigt wird. Im Gegensatz dazu {\"u}ben die langen NFAT-Faktoren wie NFATc/C und NFATp eine pro-apoptotische Wirkung aus.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {de} } @phdthesis{Rummel2002, author = {Rummel, Christoph}, title = {Durchflußzytometrische Analysen zur spenderspezifischen Toleranzinduktion nach kombinierter orthotoper Leber/D{\"u}nndarmtransplantation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4286}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Trotz der Entwicklung neuer und selektiver Immunsuppressiva, bleibt die Transplantation des D{\"u}nndarms auch weiterhin bei einer F{\"u}nfjahres{\"u}berlebensrate von 35\% ein risikoreiches Verfahren, welches nur bei einem kleinen Patientenspektrum derzeit indiziert ist. Die Erkenntnis, daß eine cotransplantierte Leber die {\"U}berlebensrate nach D{\"u}nndarmtransplantation wesentlich verbessert, zeigt die immunologische Sonderstellung der Leber auf und verweist auf ihren protektiven Effekt, den sie auf s{\"a}mtliche Organtransplantate des gleichen Spenders aus{\"u}bt. Dies konnte sowohl tierexperimentell (Rasmussen, 1995; Meyer, 2000) als auch im Rahmen der humanen Leber/D{\"u}nndarmtransplantation nachvollzogen werden (Intestinal Transplant Registry). Dabei sind diese toleranzinduzierenden Mechanismen der Leber selbst, aber auch im gesamten Immunsystem des Empf{\"a}ngers, bisher nur unvollst{\"a}ndig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es mit Hilfe der Durchflußzytometrie die Zellmigration immunologisch kompetenter Zellen nach Leber/D{\"u}nndarmtransplantation zu analysieren, welche m{\"o}glicherweise Grundlage f{\"u}r die spenderspezifische Toleranz sind. Insbesondere f{\"u}hrten wir Analysen in der transplantierten Leber selbst, aber auch in mesenterialen Lymphknoten und der Milz des Empf{\"a}ngers durch. Die Ergebnisse sollten mit gewonnenen Erkenntnisse aus der Immunhistologie korreliert werden. Dabei gelang es uns mit der kombinierten orthotopen Leber/D{\"u}nndarmtransplantation der Ratte in der Stammkombination BN®LEW ein geeignetes Tiermodell zu entwickeln. Erstmals war es damit m{\"o}glich, vollst{\"a}ndig physiologische Verh{\"a}ltnisse zu schaffen und die immunologischen Mechanismen nach Transplantation im Langzeitverlauf zu untersuchen. Nach Ablauf der initialen Gabe geringer Dosen des Immunsuppressivums FK506, konnten wir - nach passagerer Abstoßung - die induzierte spenderspezifische Toleranz nachweisen und dabei eine bloße Akzeptanz der Transplantate ausschließen, indem wir nachtr{\"a}glich Haut- und Herzorgane transplantierten. Mit Hilfe der Durchflußzytometrie untersuchten wir zus{\"a}tzlich wesentliche Mechanismen der Toleranzinduktion: den Chim{\"a}rismus und die Apoptose nicht-parenchymaler Zellen im Lebertransplantat. Den Chim{\"a}rismus, konnten wir in seinen unterschiedlichen Manifestationsformen (Makro-, Mikro- und Transplantatchim{\"a}rismus) zu jeder Zeit nach Transplantation nachweisen. Zum Nachweis apoptotischer Zellen mit der Durchflußzytometrie, gelang es uns eine Methode zu etablieren, die den dynamischen Apoptoseprozeß erfaßt und damit die Unterscheidung zwischen fr{\"u}hapoptotischen, apoptotischen und sp{\"a}tapoptotischen / nekrotischen Zellen erm{\"o}glicht. Die Apoptoseanalyse unterschiedlicher Leukozytenpopulationen im Lebertransplantat selbst gelang uns dabei ebenfalls. Unsere eigenen Ergebnisse, sowie die Erkenntnisse aus der Literatur lassen den Schluß zu, daß spenderspezifische Toleranz haupts{\"a}chlich in der Leber durch das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen induziert wird. Dabei scheinen der Chim{\"a}rismus und die T-Zellapoptose eine zentrale Rolle zu spielen.}, language = {de} } @phdthesis{Thorwarth2001, author = {Thorwarth, Wolf Michael}, title = {Kombinierte Leber- D{\"u}nndarmtransplantation}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2897}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Nach Transplantation moduliert die Leber nicht nur die Immunantwort des Empf{\"a}ngers gegen{\"u}ber ihr selbst, sondern {\"u}bt auch auf mittransplantierte Organe einen protektiven Effekt aus. Dieses Ph{\"a}nomen wurde in der vorliegenden Arbeit an dem hoch immunogenen D{\"u}nndarm untersucht. Diese Studie war dabei nicht nur unter immunologischen Gesichtspunkten von Bedeutung. So stellt die simultane Leber- / D{\"u}nndarmtransplantation f{\"u}r Patienten, die an einer Leberzirrhose infolge eines Kurzdarmsyndrom leiden, eine erfolgversprechende Therapieoption dar. Zur experimentellen Analyse dieser speziellen Transplantationsform existierte aber in der Ratte bisher kein vergleichbares Modell. In der vorliegenden Arbeit wird daher erstmalig ein Modell etabliert, in dem - orientiert an den Verh{\"a}ltnissen beim Menschen - Leber (arterialisiert) und D{\"u}nndarm simultan und orthotop transplantiert werden. Mittels kurzfristiger Immunsuppression wurde bei allogener Transplantation hier nicht nur Akzeptanz sondern Toleranz erreicht und mittels Indikator-Herz- und Hauttransplantation {\"u}berpr{\"u}ft. Die dazu ben{\"o}tigte immunsuppressive Dosis unterschritt dabei die f{\"u}r eine erfolgreiche isolierte D{\"u}nndarmtransplantation notwendige Immunsuppression erheblich. Dieser Toleranzentwicklung geht eine zeitlich begrenzte Abstoßungsreaktion voraus. Die daran beteiligten zellul{\"a}ren Mechanismen wurden durch sequentielle Immunhistologie dargestellt. W{\"a}hrend dieser Abstoßung sammeln sich {\"u}berdurchschnittlich viele apoptotische T-Lymphozyten, haupts{\"a}chlich CD8+ Zellen, im Lebertransplantat, nicht aber im transplantierten D{\"u}nndarm an. Dieses Ph{\"a}nomen konnte mittels einer neu etablierten Doppelf{\"a}rbung dargestellt werden. Apoptoseinduktion in alloreaktiven T-Zellen k{\"o}nnte einer der Mechanismen sein, die den immunsuppressiven Effekt des Lebertransplantates erkl{\"a}ren und den gleichzeitig transplantierten D{\"u}nndarm vor seiner Abstoßung bewahren.}, language = {de} } @phdthesis{KolbMaeurer2001, author = {Kolb-M{\"a}urer, Annette}, title = {Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1638}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Ausl{\"o}sung einer Immunantwort gegen{\"u}ber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich h{\"o}her als im Plasma-freien Medium oder Medium mit f{\"o}talem K{\"a}lberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen f{\"u}hrte zu einem konzentrationsabh{\"a}ngigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antik{\"o}rper gegen das listerielle Oberfl{\"a}chenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antik{\"o}rper das Haupt-Opsonin f{\"u}r die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma w{\"a}hrend der Inkubationszeit, was den Schluss zul{\"a}sst, dass Immunglobuline gegen das Oberfl{\"a}chenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, f{\"u}r die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich ph{\"a}notypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgel{\"o}ste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichons{\"a}ure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, f{\"u}hrte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes k{\"o}nnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Tr{\"a}ger.}, subject = {Mensch}, language = {de} } @phdthesis{GrosseWilde2001, author = {Große-Wilde, Anne}, title = {Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors f{\"u}r TRAIL (mTRAIL-R)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-559}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie geh{\"o}ren. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten prim{\"a}ren Zellen resistent gegen{\"u}ber TRAIL sind. In pr{\"a}klinischen Studien mit M{\"a}usen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizit{\"a}t von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben betr{\"a}chtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. {\"U}ber die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in M{\"a}usen zu etablieren. Zun{\"a}chst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch {\"u}ber 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach {\"U}berexpression Caspase-abh{\"a}ngig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu k{\"o}nnen, sollten mTRAIL-R-defiziente M{\"a}use generiert werden. Zur Modifikation des f{\"u}r p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalit{\"a}t oder sekund{\"a}re kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie l{\"o}sliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente M{\"a}use, k{\"o}nnen nun in vivo f{\"u}r die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Meisenzahl2001, author = {Meisenzahl, Christina}, title = {Regulation der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase durch Interferon in retinalen Pigmentepithelzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180452}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Ophtalmologische Krankheitsbilder, die mit Degeneration oder erblichen Dystrophien der Retina einhergehen, f{\"u}hren in vielen F{\"a}llen zur Erblindung und stellen daher ein großes Problem in der Augenheilkunde dar. Als Korrelat des Zellverlustes wurde der apoptotische Zelltod identifiziert. Die Schritte, die zwischen der Genmutation und dem funktionellen Defizit in der Zelle liegen sowie die Signalketten, die letztlich zur Entscheidung zum Zelltod f{\"u}hren, sind noch relativ unklar. Im Zusammenhang mit der Frage, welche Gene die molekulargenetische Grundlage f{\"u}r den Vorgang der Apoptose in Zellen der menschlichen Netzhaut bilden, wurde in dieser Arbeit die Frage untersucht, ob in der humanen Pigmentepithelzellinie ARPE-19 die Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase produziert werden und ob die Genexpression dieser Metalloproteinasen durch eine Behandlung der Zellen mit humanen Interferonen stimuliert werden kann. Der Nachweis sollte auf der mRNA-Ebene erfolgen. Als Nachweismethoden dienten die Northern-blot-Analyse, wobei f{\"u}r die Hybridisierung Digoxigenin-markierte antisense-RNA verwendet wurde, die durch in vitro-Transkription gewonnen wurde, sowie die RT-PCR. Als Modell diente die ARPE-19-Zelle, die sich durch ihre epitheliale Morphologie und rasche Proliferationsrate von anderen prim{\"a}ren RPE-Kulturen unterscheidet . Als Kontrolle wurden humane Fibroblasten sowie Gliomazellen verwendet. Mit der Northern-blot-Analyse konnte in der ARPE-19-Zelle die mRNA der Metalloproteinase Collagenase nicht nachgewiesen werden. Der Versuch, eine eventuell sehr geringe mRNA-Menge durch Behandlung mit Interferon alpha und gamma {\"u}ber die Nachweisgrenze zu erh{\"o}hen, erbrachte ebenfalls ein negatives Ergebnis. F{\"u}r die Untersuchung von Stromelysin 1 wurde auf die sensiblere Methode der RT-PCR {\"u}bergegangen. W{\"a}hrend Stromelysin 1 in den Kontrollzellen nachgewiesen werden konnte, konnte auch mit der RT-PCR-Methode in der ARPE-19-Zelle Stromelysin 1 nicht nachgewiesen werden. Daher muss davon ausgegangen werden, dass die ARPE-19-Zelle durch die Anzahl der Passagen, der sie w{\"a}hrend der Zellkultur unterzogen wurde, zwar nicht immortalisierte, jedoch eine gewisse Zahl von Genen abschaltete, zu denen auch die Gene der hier untersuchten Metalloproteinasen Collagenase und Stromelysin geh{\"o}ren, oder dass die Zellinie nicht den komplett identischen Chromosomensatz einer origin{\"a}ren retinalen Pigmentepithelzelle besitzt. Die Tatsache, daß hochspezialisierte Zellen bei oftmaligem Passagieren ihre spezialisierten Eigenschaften verlieren, kann in der Forschung h{\"a}ufig beobachtet werden. Offenbar ist die in Kultur gehaltene ARPE-19-Zelle eine in ihrer transkriptionellen Aktivit{\"a}t extrem reduzierte Zelle, bei der auch die Transkription der Metalloproteinasen Stromelysin und Collagenase abgeschaltet ist.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Jordan2001, author = {Jordan, Bruce}, title = {The identification of NRAGE}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1180090}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {The inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) have been shown to interact with a growing number of intracellular proteins and signalling pathways in order to fulfil their anti-apoptotic role. In order to investigate in detail how the avian homologue ITA interfered with both TNF induced apoptosis and the NGF mediated differentiation in PC12 cells, a two hybrid screen was performed with a PC12 library using ITA as a bait. The screen resulted in the identification of several overlapping fragments of a previously unknown gene. The complete cDNA for this gene was isolated, the analysis of which revealed a high homology with a large family of tumour antigens known as MAGE (melanoma associated antigens). This newly identified member of the MAGE family, which was later named NRAGE, exhibited some unique characteristics that suggested for the first time a role in normal cellular physiology for this protein family. MAGE proteins are usually restricted in their expression to malignant or tumour cells, however NRAGE was also expressed in terminally differentiated adult tissue. NRAGE also interacted with the human XIAP in direct two-hybrid tests. The interactions observed in yeast cells were confirmed in mammalian cell culture, employing both coimmunoprecipitation and mammalian two-hybrid methods. Moreover, the results of the coimmunoprecipitation experiments indicated that this interaction requires the RING domain. The widely studied 32D cell system was chosen to investigate the effect of NRAGE on apoptosis. NRAGE was stably transduced in 32D cells, and found to augment cell death induced by the withdrawal of Interleukin-3. One reason for this reduced cell viability in NRAGE expressing cells could be the binding of endogenous XIAP, which occurred inducibly after growth factor withdrawal. Interestingly, NRAGE was able to overcome the protection afforded to 32D cells by the exogenous expression of human Bcl-2. Thus NRAGE was identified during this research doctorate as a novel pro-apoptotic, IAP-interacting protein, able to accelerate apoptosis in a pathway independent of Bcl-2 cell protection.}, subject = {Apoptosis}, language = {en} } @phdthesis{Schauber2001, author = {Schauber, J{\"u}rgen}, title = {Modulation von Zellzyklus- und Apoptoseregulation in humanen kolorektalen Karzinomzellen durch Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1179976}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Zahlreiche experimentelle und epidemiologische Studien schreiben der kurzkettigen Fetts{\"a}ure Butyrat und dem Cyclooxygenasehemmer Acetylsalicyls{\"a}ure eine Schutzwirkung auf die Entstehung des kolorektalen Karzinoms zu. Die genauen Mechanismen hinter der Wirkung beider Substanzen sind ungekl{\"a}rt. Um die Effekte von Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure, sowie deren Kombination, auf das Wachstum, die Differenzierung und Apoptose von Kolonkarzinomzellen zu untersuchen, wurden Zellkulturexperimente und Western Blot Analysen durchgef{\"u}hrt. Unter Butyratinkubation kam es zu einer Steigerung der Differenzierung von HT-29-Kolonkarzinomzellen, jedoch nicht von Caco-2 Zellen. Acetylsalicyls{\"a}ure allein hatte keinen relevanten Effekt auf die Zelldifferenzierung und in Kombination konnte Acetylsalicyls{\"a}ure die differenzierende Wirkung des Butyrats nicht verst{\"a}rken. Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure hemmten die Proliferation der untersuchten kolorektalen Karzinomzellen. Bei Inkubation mit einer Kombination von Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure wurde der antiproliferative Effekt der Einzelsubstanzen deutlich verst{\"a}rkt. Im Western-Blot konnte diese Beobachtung durch Untersuchung des Proliferationsmarkers PCNA best{\"a}tigt werden. Gleichzeitig ver{\"a}nderte sich das Expressionsmuster zellzyklusregulierender Proteine in den untersuchten Zellen: Die Cyclin D3-Expression wurde in Caco-2 Zellen sowie in HT-29 Zellen durch Butyratinkubation erh{\"o}ht. In Kombination mit Acetylsalicyls{\"a}ure verst{\"a}rkte sich die Wirkung von Butyrat auf die Expression von p21Waf1/Cip1 und cdk2: Acetylsalicyls{\"a}ure und Butyrat in h{\"o}heren Konzentrationen reduzierten die Expression von cdk2 in HT-29 Zellen, in niedrigen Konzentrationen f{\"u}hrte nur die Acetylsalicyls{\"a}ure-Butyrat-Kombination zu einem Abfall des cdk2-Proteingehalts. Butyrat induzierte die Expression des cdk-Inhibitors p21Waf1/Cip1 in beiden Kolonkarzinomzellinien. Die Wirkung auf p21Waf1/Cip1 war hierbei p53-unabh{\"a}ngig, da es gleichzeitig zu einem Abfall der Konzentration an p53-Protein in HT-29 Zellen kam und in Caco-2 Zellen kein p53 nachweisbar war. Acetylsalicyls{\"a}ure hatte erst in h{\"o}herer Konzentration einen Einfluss auf die p21Waf1/Cip1 Proteinexpression in HT-29 Zellen. Die Kombination von Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure {\"u}bertraf in ihrer Wirkung die des Butyrats schon bei Konzentrationen, bei denen die alleinige Butyratinkubation ohne Effekt blieb. Weiterhin induzierte Butyrat, {\"u}ber einen Anstieg der Expression des pro-apoptotischen Faktors Bak, Apoptose in den untersuchten Kolonkarzinomzellen, bei gleichzeitigem Abfall des anti-apoptotischen Bcl-XL. Bei Inkubation mit der Acetylsalicyls{\"a}ure-Butyrat-Kombination kam es zu einer deutlichen Verst{\"a}rkung der Apoptoseinduktion, wobei Acetylsalicyls{\"a}ure die Wirkung des Butyrats auf Bak und Bcl-XL jedoch nicht steigerte. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Effekt des Butyrats mit einer Inhibition der Phosphorylierung und Degradation von IkBa, und damit einer Verhinderung der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB einhergeht, was die Wirkung von apoptose-induzierenden Substanzen verst{\"a}rken kann. Zusammenfassend zeigte sich bei Kombination der Einzelsubstanzen Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure eine Verst{\"a}rkung ihrer Wirkung auf die Zellproliferation, sowie die Apoptoseinduktion bei Kolonkarzinomzellen. Dieser Effekt wird durch unterschiedliche molekulare Mechanismen vermittelt, wobei mit p21Waf1/Cip1 und cdk2 erstmals Faktoren ermittelt wurden, auf deren Expression Butyrat und Acetylsalicyls{\"a}ure additive oder potentiell synergistische Effekte haben.}, language = {de} } @phdthesis{Seeberger2000, author = {Seeberger, Harald Bruno Gustav}, title = {Fr{\"u}he Entwicklungsschritte in der Pathogenese der B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2286}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {B-Zell-Lymphome vom mukosa-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT)-Typ sind die gr{\"o}ßte Gruppe der extranodalen Lymphome. Sie enstehen vor dem Hintergrund einer chronischen Entz{\"u}ndung, wie etwa einer Helicobacter pylori-assoziierten Gastritis im Magen. Die Mechanismen der Lymphomgenese sind weitgehend unverstanden. Der Befund, dass die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome autoreaktiv sind und durch Antigen oder T-Zell-vermittelte Signale stimuliert werden, weist auf ein m{\"o}gliches Ver-sagen der T-Zell-Kontrolle hin. Zur Pr{\"u}fung dieser Hypothese wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl tumor-infiltrierende T-Zellen als auch maligne B-Zellen aus MALT-Typ Lymphomen untersucht. Mit Hilfe von Expressionsanalysen der Vb -Kette des T-Zell-Rezeptors (TCR) wurden antigen-induzierte klonale Expansionen in den tumor-infiltrierenden T-Zellen nachgewiesen. Weiterhin wurden {\"a}hnliche antigen-erkennende Regionen (CDR3) des TCR in tumor-infiltrierenden T-Zellen aus zwei verschiedenen MALT-Typ Lymphomen gefunden. Diese Ergebnisse charakterisieren die T-Zellen als funktionell und auch als potenziell tumor-reaktiv. Um m{\"o}gliche Defekte bei malignen B-Zellen zu untersuchen, wurde eine in vitro T/B-Zell-Kokultur entwickelt. Damit war es m{\"o}glich, die Interaktion des apoptose-induzierenden Oberfl{\"a}chenmolek{\"u}ls FasL auf aktivierten T-Zellen mit dem entsprechenden Todesrezeptor Fas auf malignen B-Zellen zu untersuchen. Drei von sieben MALT-Typ Lymphomen und vier von f{\"u}nf DLBL erwiesen sich als resistent gegen FasL-vermittelte Apoptose. Meine Untersuchungen deuten darauf hin, dass hierf{\"u}r eine mutationsbedingte funktionelle Inaktivierung des Fas-Rezeptors verantwortlich ist. In Fas-Transkripten aller untersuchten malignen B-Zellen wurden insgesamt 14 verschiedene Punktmutationen gefunden, die zu Aminos{\"a}ureaustauschen bei der Translation f{\"u}hren. Zehn dieser Mutationen waren mit der Apoptose-Resistenz maligner B-Zellen assoziiert. Durch erg{\"a}nzende Untersuchungen konnten alternative Mechanismen der Apoptose-Resistenz wie etwa reduzierte Fas-Expression, Produktion von l{\"o}slichem Fas (sFas) oder St{\"o}rungen in der Fas-Signalkaskade weitgehend ausgeschlossen werden. Aus diesen Ergebnissen l{\"a}sst sich folgender Schluss ziehen: Resistenz gegen FasL/Fas-vermittelte Apoptose ist ein Mechanismus der fr{\"u}hen MALT-Typ Lymphomgenese und m{\"o}glicherweise auf bestimmte Fas-Mutationen zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Durch Apoptose-Resistenz entkommen die malignen B-Zellen der MALT-Typ Lymphome der vorhandenen T-Zell-Kontrolle. Gleichzeitig nehmen sie die parakrin angebotene T-Zell-Hilfe solange in Anspruch, bis sie v{\"o}llige Autonomie erreicht haben. Durch das abnorm verl{\"a}ngerte {\"U}berleben der B-Zellen steigt dann die Wahrscheinlichkeit, weitere Aberrationen wie etwa die in 50 Prozent aller F{\"a}lle auftretende Chromosomentranslokation t(11;18)(q21;q21) zu erwerben.}, subject = {MALT}, language = {de} } @phdthesis{Goebel2000, author = {Goebel, Stefan}, title = {Mechanismen der Toxoplasma-gondii-vermittelten Inhibierung der Apoptose in humanen Wirtszelllinien}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1325}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Als obligat intrazellul{\"a}rer Parasit und Erreger von lebenslang persistierenden Infektionen in Mensch und Tier d{\"u}rfte Toxoplasma gondii von der Integrit{\"a}t seiner Wirtszelle in besonderem Maße abh{\"a}ngig sein. Ziel der Arbeit war es, den Einfluss des Parasiten auf die Wirtszellapoptose zu untersuchen. T. gondii inhibiert die in vitro induzierte Apoptose in humanen HL-60- und U937-Zellen. Dabei muss der Parasit aktiv in die Zelle eindringen, jedoch nicht in dieser replizieren k{\"o}nnen. Er interferiert dabei mit mindestens zwei Komponenten der Apoptose-Signalkaskade: Erstens vermindert T. gondii die Herunterregulation der Mcl-1-Expression nach Apoptoseinduktion. Das f{\"u}hrt dazu, dass trotz Apoptoseinduktion die Translokation von Cytochrom c aus den Mitochondrien in das Zytoplasma inhibiert wird und daraufhin die Caspasen 9 und 3 sowie deren Substrate weniger stark aktiviert werden. Zweitens wird die Expression der Poly-(ADP-Ribose)Polymerase (PARP) durch T. gondii inhibiert. Beide Mechanismen k{\"o}nnten an der Inhibierung der Wirtszellapoptose durch T. gondii beteiligt sein und dem Parasiten damit sein intrazellul{\"a}res {\"U}berleben sichern.}, subject = {Toxoplasmase gondii}, language = {de} } @phdthesis{Loske2000, author = {Loske, Claudia}, title = {Metabolische Ver{\"a}nderungen und Zelltod in neuralen Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts"}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1707}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Advanced Glycation Endproducts (AGEs) entstehen aus nicht-enzymatisch glykierten Proteinen. In einer Folge von Dehydratations-, Kondensations- und Oxidationsschritten entsteht ein heterogenes Gemisch aus farbigen, fluoreszierenden Verbindungen. AGE-modifizierte Proteine sind unl{\"o}slich und proteaseresistent, bei ihrer Bildung entstehen freie Radikale und andere reaktive Intermediate. Von der AGE-Bildung betroffen sind vor allem langlebige Proteine mit geringem Umsatz wie Kollagen und Kristallin aber auch pathologische Proteinablagerungen, z.B. in der Alzheimer´schen Demenz (AD). Die Akkumulation von AGEs spielt in der Pathogenese von Komplikationen des Diabetes und der H{\"a}modialyse eine Rolle, f{\"u}r die AD wird eine Beteiligung von AGEs am Krankheitsverlauf diskutiert. Die Alzheimer´sche Demenz ist gekennzeichnet durch den histologischen Nachweis seniler Plaques und neurofibrill{\"a}rer B{\"u}ndel in Hirngewebe der Patienten. Auf Ebene des Stoffwechsels kommt es zu einer Verringerung des zerebralen Glukoseumsatzes, es finden sich Marker sowohl f{\"u}r eine Akutphasenreaktion als auch f{\"u}r oxidativen Stress. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die AGE-Bildung in vitro die Aggregation von ßA4, dem Hauptbestandteil der senilen Plaques in der AD, beschleunigt. Der geschwindigkeits-bestimmende Schritt ist dabei die Glykierung des ßA4-Monomers. Durch Zugabe von {\"U}bergangsmetall-ionen kann die Vernetzung weiter beschleunigt werden. Dies deutet darauf hin, dass AGEs zur Plaquebildung in der AD beitragen, redox-aktive Eisenionen sind in der AD mit den Plaques assoziiert. Mit Hilfe von Metallchelatoren, Antioxidantien oder mit Substanzen, welche die zur Vernetzung notwendigen Aminogruppen abblocken, l{\"a}sst sich die Aggregation von ßA4 verlangsamen oder verhindern. AGEs wirken zytotoxisch auf BHK 21 Fibroblasten und humane SH-SY5Y Neuroblastoma Zellen. Die Toxizit{\"a}t unterschiedlicher Modell-AGEs ist abh{\"a}ngig von verschiedenen Faktoren, u.a. von dem zur Herstellung verwendeten Protein und vom Zucker. Die LD50 der Modell-AGEs korreliert mit dem AGE-Gehalt und der Radikalproduktion der Pr{\"a}parationen in vitro. Die AGE-Toxizit{\"a}t ist haupts{\"a}chlich radikalvermittelt. Oxidativer Stress l{\"a}sst sich in AGE-behandelten Zellen durch die Bildung intrazellul{\"a}rer Lipidperoxidationsprodukte nachweisen. Auf Ebene der Signaltransduktion konnte die Aktivierung des Transkriptions-faktors NfkB als Zeichen der Stressabwehr nachgewiesen werden. Die Gabe von Antioxidantien vor oder gleichzeitig mit den AGEs verringerte den Zelltod. Auch durch das Blockieren des Rezeptors f{\"u}r AGEs (RAGE) mit spezifischen Antik{\"o}rpern konnte die Zahl {\"u}berlebender Zellen gesteigert werden. Durch AGEs ausgel{\"o}ster Stress f{\"u}hrt in Neuroblastoma Zellen bereits in Konzentrationen unterhalb der LD50 zu St{\"o}rungen im Redoxstatus, es kommt zur Depletion von GSH und zu Verschiebungen im Verh{\"a}ltnis GSH/GSSG. Damit einher gehen Ver{\"a}nderungen im Energiestoffwechsel der Zelle, nach anf{\"a}nglich erh{\"o}hter Glukoseaufnahme kommt es im weiteren Verlauf der Inkubation zu einer Verringerung der Aufnahme von Glukose aus dem Medium, gefolgt von einer Zunahme der Laktataussch{\"u}ttung. Ausserdem wurde eine Depletion von ATP um bis zu 50 Prozent nachgewiesen. Antioxidantien k{\"o}nnen die St{\"o}rungen im Metabolismus der Zellen verhindern oder abschw{\"a}chen, die meisten der getesteten Substanzen konnten Redoxstatus und ATP-Gehalt der Zellen zu normalisieren. Obwohl sich in AGE-gestressten Zellkulturen durch Annexin-Fluorescein-Markierung ein geringf{\"u}gig erh{\"o}hter Prozentsatz apoptotischer Zellen nachweisen ließ und AGEs auch die Freisetzung von Cytochrom c ins Zytoplasma induzieren, verl{\"a}uft der durch AGEs ausgel{\"o}ste Zelltod verl{\"a}uft offenbar insgesamt nekrotisch. Sowohl durch Radikalproduktion als auch {\"u}ber rezeptorvermittelte Signalwege verursachen AGEs oxidativen Stress und induzieren Ver{\"a}nderungen im Metabolismus der Zelle. Dies f{\"u}hrt u. a. dazu, dass f{\"u}r die antioxidativen Schutzmechanismen der Zelle nicht mehr gen{\"u}gend Energie zur Verf{\"u}gung steht. AGE-Stress tr{\"a}gt damit in einer selbstverst{\"a}rkenden Reaktionskaskade zur Neurodegeneration bei und kann so an der Pathogenese der AD beteiligt sein. Antioxidantien und auch AGE-Inhibitoren k{\"o}nnten einen interessanten Ansatz zur Entwicklung alternativer Therapien in der AD darstellen.}, subject = {Alzheimer-Krankheit}, language = {de} } @phdthesis{Matenia2000, author = {Matenia, Dorthe}, title = {Die Rolle der Serin/Threonin Kinase Cot in Proliferation, Differenzierung und Apoptose}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1712}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Mitogene Signale werden von der Plasmamembran zum Zellkern {\"u}ber komplexe z.T. miteinander verkn{\"u}pfte Signaltransduktionskaskaden {\"u}bertragen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Proto-Onkoprotein Cot als eine neue Komponente von mitogenen Signalkaskaden identifiziert, die die F{\"a}higkeit hat, sowohl die klassische mitogene Kaskade als auch den JNK-Streß-Kinaseweg zu aktivieren. Wildtyp und aktiviertes Cot phosphorylieren und aktivieren MEK-1 und SEK-1 in vitro. Expression von onkogenem Cot in 293-, NIH3T3- und PC12- Zellen f{\"u}hrt auch in vivo zu einer Phosphorylierung der endogenen Proteine c-Jun und ERK-1/2. In Bezug auf diese F{\"a}higkeit, zwei unterschiedliche Signalkaskaden zu stimulieren, wurden die biologischen Effekte von Cot auf verschiedene Zelltypen, sowie seine tumorausl{\"o}sende Wirkung in der Maus untersucht. Expression von onkogenem c-Raf-1 oder v-Mos f{\"u}hrt zu einer Differenzierung in PC12-Zellen. Cot induziert ebenfalls Neuritenbildung in diesen Zellen. {\"A}hnlich wie v-raf hat onkogenes cot eine antiapoptotische Wirkung auf 32D-Zellen nach IL-3-Entzug. In neugeborenen NSF/N-M{\"a}usen induzierte retroviral-exprimiertes onkogenes Cot nach einer Latenzzeit von 7-10 Wochen B-Zell-Lymphome vergleichbar mit v-raf/v-myc induzierten Tumoren [191]. Diese Daten stimmen mit der Rolle von Cot in der klassischen mitogenen Kaskade {\"u}berein und lassen darauf schließen, daß die simultane Aktivierung von JNK in diesem Zusammenhang keinen antagonistischen Effekt hat. Aktives NF-kB reguliert die Transkription einer Reihe von Ziel-Genen, die in verschiedenen zellul{\"a}ren Funktionen involviert sind. Viele Stimuli, Mitglieder der mitogenen Kaskade eingeschlossen, aktivieren NF-kB, so z.B. auch c-Raf-1, das mit Cot {\"u}berlappende Effekte auf Apoptose-Suppression, Transformation und Differenzierung aufweist und auf der gleichen Ebene zu funktionieren scheint. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß Cot NF-kB aktiviert, dieses aber indirekt durch einen autokrinen Loop geschieht, der den EGFR und die Streß-Kinasekaskade involviert. Mit c-Raf-1 konnten in unserem Labor bereits {\"a}hnliche Ergebnisse gezeigt werden [234]. Eine direkte Interaktion zwischen Cot und der NF-kB-Aktivierung konnte durch die Identifikation von p105, einem Vorl{\"a}uferprotein und Regulator von NF-kB, als Cot-Interaktionspartner in einem Two-Hybrid Screen gefunden werden. Die Tatsache, daß Cot mit IKKa und IkBa, beides NF-kB-Regulatoren, copr{\"a}zipitiert, deutet ebenfalls auf einen direkten Mechanismus der Cot-abh{\"a}ngigen NF-kB-Aktivierung hin. Dieser Prozeß wird haupts{\"a}chlich durch den Transport der Komponenten des NF-kB-Transkriptionsfaktorkomplexes und seiner Regulatoren zwischen Zytosol und Nukleus kontrolliert. Das kleine G-Protein Ran spielt eine kritische Rolle in derartigen Transportprozessen und wurde interessanterweise ebenfalls in einem Two-Hybrid Screen als neuer Interaktionspartner von Cot identifiziert. Durch Coimmunopr{\"a}zipitationsexperimente konnte dieses Ergebnis best{\"a}tigt werden. Diese Daten weisen auf einen neuen Mechanismus der NF-kB-Regulation durch Cot hin und geben neue Ans{\"a}tze, die komplexen Funktionen von Cot in der Zelle zu diskutieren und weiter zu analysieren.}, subject = {Protein-Serin-Threonin-Kinasen}, language = {de} } @phdthesis{Schaefer2000, author = {Sch{\"a}fer, Rolf}, title = {Aktivierung von Caspasen in AKR-2B Mausfibroblasten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1950}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit konnte die essentielle Beteiligung von Caspasen im Zelltodmodell der AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen und ihre Aktivit{\"a}ten charakterisiert werden. AKR 2B-Mausfibroblasten stellen eine subklonierte und gut charakterisierte Zellinie dar, in der durch Entzug des Serums der Zelltod induziert wird. W{\"a}hrend des Zelltods sterben innerhalb von 6h etwa 50 Prozent einer dichtearretierten Kultur. Die {\"u}berlebenden Zellen bleiben von diesem Mangelzustand f{\"u}r mindestens weitere 48h unbeeinflußt, ben{\"o}tigen aber zum {\"U}berleben eine Proteinneusynthese. Der Zelltod zeigt f{\"u}r eine Apoptose typische morphologische Ver{\"a}nderungen der Zelle, obwohl apoptotische Charakteristika, wie die oligonukleosomale Fragmentierung der DNA oder die Aufnahme der zerfallenen Zelle durch benachbarte Zellen, ausbleiben. Mittels unterschiedlicher Methoden konnte die Expression von mRNA aller f{\"u}r den apoptotischen Prozeß bekannten relevanten Caspasen in den AKR 2B-Mausfibroblasten nachgewiesen werden. Die Caspasen-1, -2, -3, -6 und -9 liegen in ihrer zymogenen Form konstitutiv in den Zellen vor. Mit Ausnahme der Caspase-9 konnte die durch Serumentzug induzierte Spaltung dieser Caspasen in Untereinheiten und somit ihre Aktivierung nicht detektiert werden. Die wesentliche Beteiligung dieser Cystein-Proteasen wurde jedoch durch den protektiven Effekt spezifischer Inhibitoren und den Nachweis ihrer spezifischen Aktivit{\"a}t bestimmt. Die Charakterisierung dieser enzymatischen Aktivit{\"a}ten lieferte Hinweise zur Identit{\"a}t der aktivierten Caspasen. Neben einer konstitutiven VEIDase- und IETDase-Aktivit{\"a}t wird 3h nach Entzug des Serums eine DEVDase maximal aktiviert. Das Gemisch an Caspase-Aktivit{\"a}ten wird durch eine DEVDase dominiert. Diese Aktivit{\"a}t wird zum gr{\"o}ßten Teil durch nur ein Enzym gestellt, wie durch eine Affinit{\"a}tsmarkierung und 2D-Gelelektrophorese gezeigt wurde. KM- und Ki-Wert-Bestimmungen der DEVDase deuten darauf hin, daß dieses Enzym typische Effektoreigenschaften, wie die der Caspase-3, besitzt. Daneben werden Lamine w{\"a}hrend des Zelltods in AKR 2B-Mausfibroblasten abgebaut, was auf eine aktivierte Caspase-6 hinweist. Die enzymatischen Charakteristika dieser Protease weichen aber von den in AKR 2B-Mausfibroblasten festgestellten Werten deutlich ab, so daß man ihr nur eine untergeordnete Rolle im Caspasen-Gemisch zuordnen kann. Eine mehrfach chromatographische Reinigung der Aktivit{\"a}t bietet die beste Grundlage f{\"u}r eine anschließende Sequenzierung der Caspase mit dem Ziel ihrer Identifizierung. Durch die Expression des viralen Caspase-Inhibitors CrmA konnte eine tragende Rolle der Caspase-8 und damit des Rezeptor-vermittelten Weges in der Initiierung des apoptotischen Programms in AKR 2B-Mausfibroblasten ausgeschlossen werden. Gleiches gilt f{\"u}r den mitochondrial-vermittelten Weg, f{\"u}r dessen Beteiligung, bis auf die Spaltung der Caspase-9, keine Hinweise vorliegen. Der Weg, der zur Aktivierung der DEVDase f{\"u}hrt, ist Ziel gegenw{\"a}rtiger Untersuchungen. Substanzen, die Signalwege aktivieren PDGF-BB, TPA, Forskolin und 8Br-cAMP) oder auch Substanzen, deren Verbindung zu Signalwegen noch weitgehend offen ist, sch{\"u}tzen die Zellen vor dem Zelltod. Der protektive Effekt dieser Signalwege konzentriert sich in einem Konvergenzpunkt, der auf noch unbekannte Weise die Aktivierung der Effektor-Caspasen blockiert. Die Identit{\"a}t dieses Konvergenzpunktes und von ihm ausgehenden protektiven Weges ist Ziel weiterer Untersuchungen. So ist es m{\"o}glicherweise dieser Weg, der zum {\"U}berleben von 50 Prozent der AKR 2B-Mausfibroblasten w{\"a}hrend des Serumentzugs wesentlich beitr{\"a}gt.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Kuss2000, author = {Kuß, Andreas}, title = {Untersuchungen zur CD40 induzierten Expression von A1 in B-Lymphozyten der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1669}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus {\"u}ber den Antigenrezeptor f{\"u}hrt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation {\"u}ber CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und sch{\"u}tzt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation {\"u}ber CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in prim{\"a}ren B-Lymphozyten aus M{\"a}usen anregt. Die CD40 Abh{\"a}ngigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem f{\"u}r unreife B-Lymphozyten, best{\"a}tigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abh{\"a}ngigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden {\"u}ber chim{\"a}re Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression {\"u}ber eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen {\"u}ber den BZR wiesen diese eine gr{\"o}ßere {\"U}berlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erkl{\"a}rt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abh{\"a}ngige Aktivit{\"a}tsverlust eines NFkB-abh{\"a}ngigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die {\"U}berexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, f{\"u}hrte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsf{\"a}higkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdr{\"u}ckte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsf{\"a}higkeit aufrecht erh{\"a}lt, w{\"a}hrend die andere das {\"U}berleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach f{\"u}r letztere von zentraler Bedeutung.}, subject = {Apoptosis}, language = {de} } @phdthesis{Lee1999, author = {Lee, Kyeong-Hee}, title = {Cofilin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1681}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {1999}, abstract = {This study has identified cofilin, an actin binding protein, as a control element in the reorganization of the actin cytoskeleton which is highly relevant for T lymphocyte activation. Cofilin is regulated in its activity by reversible phosphorylation which is inducible by stimulation through accessory receptors such as CD2 and CD28. First it could be demonstrated that accessory receptor triggering induces the transient association of cofilin with the actin cytoskeleton and that only the dephosphorylated form of cofilin possesses the capacity to bind cytoskeletal actin in vivo. PI3-kinase inhibitors block both the dephosphorylation of cofilin and its association with the actin cytoskeleton. Importantly, cofilin, actin, PI3-kinase and one of its substrates, namely phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) which can bind to cofilin, co-localize within CD2-receptor caps. The cofilin/F-actin interaction has been identified as a crucial regulatory element for receptor cap formation and the strength of signal transduction. To this end, appropriately designed cell permeable non-toxic peptides that are homologous to actin binding motifs of the human cofilin sequence were introduced into untransformed human peripheral blood T lymphocytes. These peptides competitively and dose dependently inhibit the activation induced interaction of cofilin with the actin cytoskeleton in vivo. By this approach it was possible to study, for the first time, the functional consequences of this interaction in immunocompetent T cells. The present data demonstrate that inhibition of the actin/cofilin interaction in human T lymphocytes by means of these cofilin derived peptides abolishes receptor cap formation and strongly modulates functional T cell responses such as T cell proliferation, interleukin-2 production, cell surface expression of CD69, gIFN production, and CD95L expression. Importantly, receptor independent activation by PMA and calcium ionophore circumvents these peptide produced inhibitory effects on lymphocyte stimulation and places the cofilin/actin interaction to a proximal step in the cascade of signaling events following T cell activation via surface signals. The present results are novel since as yet no information existed regarding the molecular elements which link cell surface receptor stimulation directly to the resulting reorganization of the actin cytoskeleton.}, subject = {T-Lymphozyt}, language = {en} }