@phdthesis{Schaefer2012,
  author    = {Sch{\"a}fer, Barbara},
  title     = {Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivit{\"a}t und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71469},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energietr{\"a}ger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden {\"U}berblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielf{\"a}ltige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ver{\"a}nderungen in der Aktivit{\"a}t durch verschiedene Einfl{\"u}sse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorg{\"a}ngen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem D{\"u}nndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkst{\"a}rke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr {\"a}hnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivit{\"a}t. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol f{\"u}hrt teilweise zu einer erh{\"o}hten Invertaseaktivit{\"a}t und Calystegin B2 verf{\"u}gt nur {\"u}ber ein beschr{\"a}nktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivit{\"a}t. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegen{\"u}ber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. F{\"u}r die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgef{\"u}hrt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten k{\"o}nnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde gr{\"o}ßtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.},
  subject      = {Invertase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bonfig2008,
  author    = {Bonfig, Katharina Barbara},
  title     = {Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus w{\"a}hrend Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Invertasen sind Schl{\"u}sselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben m{\"o}glicherweise auch w{\"a}hrend einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zun{\"a}chst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten r{\"a}umliche und zeitliche Ver{\"a}nderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ {\"a}hnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet f{\"u}r die sensitive, nicht-invasive Pathogenfr{\"u}herkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-{\"U}berg{\"a}ngen und die Aktivit{\"a}t von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivit{\"a}t vakuol{\"a}rer Invertasen stieg vor{\"u}bergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, w{\"a}hrend sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivit{\"a}t extrazellul{\"a}rer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienst{\"a}mme von P. syringae, die das gr{\"u}n fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zun{\"a}chst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In {\"U}bereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Bl{\"a}ttern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollst{\"a}ndig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivit{\"a}t durch Messung der Invertaseaktivit{\"a}t in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollst{\"a}ndig reprimiert war. In funktionellen Ans{\"a}tzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression {\"a}nderte die Sensitivit{\"a}t gegen{\"u}ber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivit{\"a}t in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Bl{\"a}ttern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erh{\"o}hte Sensitivit{\"a}t der Pflanzen gegen{\"u}ber der Infektion, eine st{\"a}rkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erh{\"o}htes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivit{\"a}t nach zus{\"a}tzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivit{\"a}t nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erh{\"o}hte die Spiegel an Salicyls{\"a}ure unabh{\"a}ngig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicyls{\"a}ure-vermittelten Abwehrweges bei zus{\"a}tzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erh{\"o}ht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr f{\"u}r die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivit{\"a}t der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivit{\"a}t dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekr{\"a}ftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte f{\"u}r A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplement{\"a}ren Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivit{\"a}t f{\"u}r eine normale Keimlingsentwicklung.},
  subject      = {Invertase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hirsche2008,
  author    = {Hirsche, J{\"o}rg},
  title     = {Metabole Regulation von Pollenentwicklung und Pollenkeimung durch Zucker},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29654},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden {\"u}ber eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuol{\"a}re und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile f{\"u}r die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschl{\"a}uche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate prim{\"a}r in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die {\"u}ber die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivit{\"a}t zu m{\"a}nnlich sterilen Pflanzen f{\"u}hrt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivit{\"a}t mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch m{\"a}nnlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden k{\"o}nnen. Ein Aktivit{\"a}tsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung m{\"a}nnlich steriler Pflanzen {\"u}ber Familiengrenzen hinweg nicht m{\"o}glich ist. Neben ihrer Funktion als Energietr{\"a}ger stellen Kohlenhydrate auch Signalmolek{\"u}le dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabh{\"a}ngige Signalingwege involviert sein m{\"u}ssen, um ein Auskeimen der Pollen zu erm{\"o}glichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabh{\"a}ngige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden.},
  subject      = {Pollen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Proels2004,
  author    = {Pr{\"o}ls, Reinhard},
  title     = {Regulation and function of extracellular invertases of tomato},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-10260},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Wachstum und Entwicklung pflanzlicher Gewebe bedingen eine fortw{\"a}hrende Ver{\"a}nderung von Source-Sink Beziehungen. Gewebe mit einem Nettoexport (Source) oder - import (Sink) von Kohlenhydraten m{\"u}ssen ihren aktuellen Bedarf an Assimilaten entsprechend dem Entwicklungsstadium anpassen. Dar{\"u}ber hinaus haben Pflanzen als ortsgebundene Lebewesen Regulationsmechanismen entwickelt, die eine flexible Antwort der Assimilatverteilung auf spezielle Anforderungen des Habitats, wie biotische oder abiotische Stressfaktoren und wechselnde Lichtbedingungen, erm{\"o}glichen. Die Assimilatverteilung ist vielf{\"a}ltig reguliert und erfordert spezifische Enzymfunktionen, wie Zuckertransporter und saccharosespaltende Enzyme. Extrazellul{\"a}re Invertasen nehmen eine essentielle Funktion in der apoplastischen Phloementladung und in der Regulation von Source-Sink {\"U}berg{\"a}ngen ein. Dies spiegelt sich in dem Auftreten verschiedener Invertase- Isoenzyme mit speziellen Expressions- und Regulationsmustern wider, welche eine Koordination des Kohlenhydratmetabolismus in unterschiedlichen Geweben, zu unterschiedlichen Entwicklungsstufen und unter sich {\"a}ndernden Umweltbedingungen erm{\"o}glichen. Ein detailliertes Wissen {\"u}ber die Funktion extrazellul{\"a}rer Invertasen k{\"o}nnte eingesetzt werden, um Wachstum, Entwicklung oder Pathogenresisitenz von Nutzpflanzen gezielt zu ver{\"a}ndern. In der vorliegenden Studie wurden die Regulationsmuster und die Funktion dreier extrazellul{\"a}rer Invertasen aus Tomate, Lin5, Lin6 und Lin7 untersucht. Durch umfangreiche Promotorstudien konnte eine gewebe- und entwicklungsspezifische Expression dieser Isoenzyme und entsprechende Regulationsmuster offengelegt werden. Lin5 zeigt eine entwicklungsabh{\"a}ngige Expression in Fr{\"u}chten. Lin6 wird in fr{\"u}hen Entwicklungsstadien, beginnend mit der Samenkeimung, exprimiert; in ausgewachsenen Pflanzen ist eine Lin6 Expression nur in Pollen oder nach Verwundungsinduktion nachweisbar. Lin7 wird ausschließlich in Tapetum-Gewebe und Pollen exprimiert. Die hormonelle Regulation der Isogene wurde im Detail untersucht, hierbei konnten bekannte Ph{\"a}notypen, welche durch Gibberellins{\"a}ure und Jasmonate bedingt werden, mit Invertasefunktionen in Korrelation gebracht werden. Dar{\"u}ber hinaus konnte in einem funktionalen Ansatz gezeigt werden, dass Lin7 eine wichtige Rolle in der Pollenkeimung zukommt. Die vorliegende Arbeit stellt die umfassendste Untersuchung extrazellul{\"a}rer Invertasen w{\"a}hrend der Bl{\"u}tenentwicklung dar, an der drei Isoenzyme aus Tomate beteiligt sind. Dadurch, dass den einzelnen Invertasen Lin5, Lin6 und Lin7 individuelle Funktionen zugewiesen werden konnten, er{\"o}ffnen sich neue Erkenntnisse {\"u}ber die Kohlenhydratversorgung w{\"a}hrend der Bl{\"u}ten- und Fruchtentwicklung. F{\"u}r die untersuchten gewebespezifischen Promotoren er{\"o}ffnen sich zudem Anwendungsm{\"o}glichkeiten in der Biotechnologie, was insbesondere f{\"u}r den pollenspezifischen Lin7 Promotor zutrifft. Es konnte gezeigt werden, dass der Lin6 Promotor das Ziel von hormon-, zucker- und verwundungsvermittelten Signalwegen ist. Dar{\"u}ber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass Elemente des circadianen Oszillators von A. thaliana mit dem Lin6 Promotor funktionell interagieren und die Lin6 Expression einem diurnalen Rhythmus unterliegt. Dieses komplexe Regulationsmuster spiegelt sich in vielen cis-aktiven Elementen wider, die im Lin6 Promotor vorgefunden wurden. Durch dieses Merkmal wird die These gest{\"u}tzt, dass verschiedene Stimuli {\"u}ber die extrazellul{\"a}re Invertase integriert werden und so eine koordinierte Zellantwort auf sich {\"a}ndernde interne und externe Bedingungen erm{\"o}glicht wird. Nachdem Zuckermolek{\"u}le ihrerseits die Expression von Lin6 induzieren, wird dadurch eine Amplifikation von Signalen {\"u}ber eine positive R{\"u}ckkopplungsschleife erm{\"o}glicht. Die Vielzahl an cis-aktiven Elementen und deren Anordnung im Lin6 Promotor stellen ein ideales Modellsystem dar, um Fragen in Bezug auf Signalinteraktion und -integration zu untersuchen. In einer umfangreichen Studie wurde der Lin6 Promotor erfolgreich als induzierbares Expressionssystem eingesetzt. Hierbei wurde ein Invertaseinhibitor unter der Kontrolle des cytokinininduzierbaren Lin6 Promotors in transgenen Tabakpflanzen exprimiert. Mit diesem Ansatz ist es gelungen einen kausalen Zusammenhang zwischen dem Hormon Cytokinin und extrazellul{\"a}ren Invertasen in der Seneszenzverz{\"o}gerung herzustellen. Diese Studie zeigt, dass induzierbare Expressionssysteme essentiell sind, um spezifische Fragestellungen auf molekularer Ebene kl{\"a}ren zu k{\"o}nnen. Bei der Klonierung obig genannter Promotorsequenzen haben sich zudem zwei interessante strukturelle Besonderheiten ergeben. Zum einen sind die Gene von Lin5 und Lin7 in einem Tandem auf dem Genom angeordnet, zum anderen konnte eine Transposoninsertion im Intron I des Lin5 Gens gezeigt werden. Mit einem Primerpaar, das aus der Transposaseregion dieses Transposons abgeleitet wurde, konnten entsprechende Sequenzen von mehreren Solanaceae Spezies gewonnen werden.},
  subject      = {Tomate},
  language  = {en}
}