@phdthesis{Koestlin2006,
  author    = {K{\"o}stlin, Sebastian Michael Cosmann},
  title     = {Die Sekretion angiogenetischer Zytokine durch menschliche Melanomzellen unter Hypoxie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21305},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Das maligne Melanom ist ein Tumor der Hautpigmentzellen mit weltweit steigender Inzidenz. Aufgrund seiner fr{\"u}hzeitigen lymphogenen und h{\"a}matogenen Metastasierung z{\"a}hlt das maligne Melanom zu den prognostisch sehr ung{\"u}nstigen Tumorerkrankungen. Nach erfolgter Metastasierung werden mit den derzeitig etablierten Therapieschemata noch keine ausreichenden Prognoseverbesserungen erzielt. Einen m{\"o}glichen neuen Therapieansatz stellt die Blockade der Tumorangiogenese dar. Besondere Bedeutung wird dabei der zyto- bzw. chemokinvermittelten Angiogenese zugemessen. In den letzten Jahren zeigten verschiedene diesbez{\"u}gliche Studien richtungsweisende und erfolgversprechende Ergebnisse. Trotzdem besteht weiterhin hoher Bedarf an Verbesserung des Verst{\"a}ndnisses der zugrundeliegenden Regulationsmechanismen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Sekretion acht angiogenetisch wirksamer Zyto- und Chemokine in vitro durch hoch- und niedrigmaligne Melanomzellen unter normalen Kulturbedingungen sowie unter Hypoxie, Serum- und Glukosemangel zu erfassen. Diese Stressbedingungen dienten als vereinfachtes in vitro-Modell der Mangelbedingungen, die in schnell wachsenden bzw. Nekrosezonen angrenzenden Tumorarealen vorherrschen. Mittels ELISA wurden die abgegeben Mengen der Zytokine VEGF, b-FGF, Angiogenin, PDGF und TGF-ß sowie der Chemokine IL-8, Gro-\&\#945; und GM-CSF in den Zell{\"u}berst{\"a}nden bestimmt. Dabei zeigten die verschiedenen Melanomzelllinien f{\"u}r alle getesteten Zyto- bzw. Chemokine außer GM-CSF charakteristische Sekretionsverhalten unter bestimmten Kulturbedingungen. Insbesondere unter Hypoxie und nach Reoxigenierung ließen sich signifikante Ver{\"a}nderungen im Sekretionsverhalten der verschiedenen Melanomzelllinien feststellen. Eine signifikante Steigerung in der Freisetzung der Zyto- bzw. Chemokine durch Melanomzellen unter Hypoxie ließ sich nur f{\"u}r VEGF, b-FGF, Angiogenin und IL-8 feststellen. Zudem unterschieden sich hochmaligne Melanomzelllinien signifikant von niedrigmalignen Zelllinien in ihrer Sekretion von VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-\&\#945; unter normalen Kulturbedingungen und unter Hypoxie (Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-\&\#945;). In weiterf{\"u}hrenden Experimenten wurde das Sekretionsverhalten von normalen Melanozyten, Endothelzellen und Fibroblasten untersucht. Dabei wiesen differenzierte Melanozyten im Vergleich zu den Melanomzellen signifikante Unterschiede in den abgegebenen Zyto-/ Chemokinmengen f{\"u}r VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-\&\#945; unter normalen bzw. hypoxischen Kulturbedingungen auf. Differenzierte Melanozyten unterschieden sich also von Melanomzellen in ihrer Sekretion bei den selben Zyto- bzw. Chemokinen wie niedrigmaligne von hochmalignen Melanomzelllinien (VEGF, Angiogenin, PDGF, IL-8 und Gro-\&\#945;). Im Sekretionsverhalten f{\"u}r VEGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-\&\#945; {\"a}hnelten Fibroblasten und Endothelzellen (bzgl. VEGF nur HMEC-1) den Melanomzellen. Der Einfluss dieser vier Zyto- und Chemokine und b-FGF auf das in-vitro-Wachstumsverhalten von Endothelzellen wurde mit einem BrD-U-Proliferationsassay untersucht. Sowohl mikrovaskul{\"a}re (HMEC-1) als auch makrovaskul{\"a}re (HUVEC) Endothelzellen steigerten ihre Proliferation unter dem Einfluss von VEGF, b-FGF, Angiogenin, IL-8 und Gro-\&\#945; signifikant. HMEC-1 reagierten dabei mit einem tendenziell st{\"a}rkeren Ansprechen auf die Stimulation als HUVEC. In weiteren Versuchen zeigten HUVEC eine erh{\"o}hte Sensibilit{\"a}t f{\"u}r Zytokine (insbesondere f{\"u}r b-FGF) unter Serummangelbedingungen, nicht jedoch f{\"u}r Chemokine (IL-8 und Gro-\&\#945;). Am deutlichsten fiel die Proliferationssteigerung unter dem Einfluss der einzelnen Zyto- und Chemokine aus, wenn HUVEC in nonadh{\"a}rentem Zustand stimuliert wurden. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte erstmalig bzw. zeitgleich mit anderen Publikationen gezeigt werden, dass Melanomzellen unter Hypoxie nicht nur VEGF, sondern auch Angiogenin und IL-8 deutlich vermehrt sezernieren, dass diese Sekretionssteigerung nach Reoxigenierung weiter anh{\"a}lt und Melanomzellen signifikant von differenzierten Melanozyten unterscheidet. Jedes dieser Zyto- und Chemokine stimulierte die Endothelzellproliferation in vitro. Dabei erh{\"o}hten Serummangel und vor allem initial fehlende Zell-Zellkontakte die Zyto- bzw. Chemokinwirkung. Im Gegensatz zu dem bisher intensiver untersuchten VEGF sezernierten hochmaligne Melanomzellen unter Hypoxie signifikant mehr Angiogenin und IL-8 als niedrigmaligne Melanomzellen. Nur f{\"u}r Angiogenin zeigte sich dar{\"u}ber hinaus eine gegens{\"a}tzliche Sekretionsregulation unter Hypoxie aller Melanomzellen im Vergleich zu normalen Melanozyten. Dies k{\"o}nnte f{\"u}r IL-8 und im Besonderen f{\"u}r Angiogenin auf eine m{\"o}gliche Schl{\"u}sselfunktion in der Melanom-induzierten Angiogenese hindeuten. Inwieweit R{\"u}ckschl{\"u}sse auf die in vivo-Verh{\"a}ltnisse und eine klinische Relevanz zul{\"a}ssig sind, werden weitere Untersuchungen und ggf. Therapiestudien zeigen m{\"u}ssen.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Vogtmann2005,
  author    = {Vogtmann, Alexandra},
  title     = {Vergleichende Untersuchungen zur automatisierten Auswertung von Elispot-Platten mit verschiedenen Bildanalysesystemen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18395},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, erstmals unterschiedliche automatisierte Bildanalysesysteme in der Auswertung von Elispot-Proben miteinander zu vergleichen. Neben dem Vergleich der Anzahl der gemessenen Spots, sollten die Zeit f{\"u}r die Messungen, die Genauigkeit, Richtigkeit und Pr{\"a}zision untersucht werden. Weiterhin sollten die Zuverl{\"a}ssigkeit der Messungen sowie die Einflussgr{\"o}ßen der einzelnen Bildanalysesysteme gepr{\"u}ft werden. Es wurden Elispotproben von verschiedenen Spezies (Maus und Human) und von verschiedenen unabh{\"a}ngigen Arbeitsgruppen verwendet. Die verglichenen Bildanalysesysteme bestanden aus den aufeinander abgestimmten Komponenten Mikroskop, Farbkamera, Motortisch mit Steuerung, Analysesoftware und Rechner. Sie unterschieden sich in ihren Mikroskopen, in der Anzahl der pro Well aufgenommenen Bilder und in der damit erreichten Bildpunktaufl{\"o}sung. Beim KS Elispot wurden im Auflichtmikroskop pro Well 12 Bilder {\"u}ber eine Farbkamera aufgenommen, die Bildpunktaufl{\"o}sung f{\"u}r ein 760x580 Pixel Bild eines Wells betrug 2.6µm. Beim KS Elispot compact 0.65-Zoom-Einstellung wurde im Stereomikroskop pro Well 1 Bild {\"u}ber eine Farbkamera aufgenommen und eine Bildpunktaufl{\"o}sung von 12µm erreicht. Beim KS Elispot 1.25-Zoom-Einstellung wurden im Stereomikroskop 4 Bilder pro Well {\"u}ber eine Farbkamera erstellt, die Bildpunktaufl{\"o}sung betrug 6µm. Im Bezug auf den Faktor Zeit war das KS Elispot compact dem KS Elispot deutlich {\"u}berlegen. Bei Verwendung eines Bildes pro Well bzw. 4 Bildern pro Well wertete das KS Elispot compact eine komplette 96-Well-Mikrotiterplatte bis zu 6 Mal schneller bzw. mindestens doppelt so schnell aus wie das KS Elispot. Die hohe Aufl{\"o}sung des KS Elispot resultiert in einer langen Auswertungszeit der einzelnen Platten. Werden große Mengen von Elispot-Proben ausgewertet, so bietet das KS Elispot compact aufgrund seiner k{\"u}rzeren Messzeiten eine deutliche Ersparnis an Zeit und damit gegen{\"u}ber dem KS Elispot unter diesem Gesichtspunkt einen entscheidenden Vorteil. Die Variabilit{\"a}t der Messungen lag bei allen Systemen niedrig, ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Systemen. Die h{\"o}chste Zuverl{\"a}ssigkeit bei der Spoterkennung konnte f{\"u}r das System KS Elispot nachgewiesen werden. Es erkannte nahezu alle echten Spots und mehr echte Spots als das KS Elispot compact. Das KS Elispot wies im Gegensatz zum KS Elispot compact keine falsch-positiven Spots auf. Bei Verwendung von 4 Bildern pro Well arbeitete das KS Elispot compact zuverl{\"a}ssiger als bei Erstellung von nur einer Aufnahme pro Well: der Anteil an falsch-positiven Spots am Ergebnis sank und der Anteil der richtig erkannten Spots stieg. Die Werte lagen jedoch immer noch unterhalb der Ergebnisse, die das KS Elispot erzielt hatte. Das KS Elispot compact erkannte grunds{\"a}tzlich in denselben Wells weniger Spots als das KS Elispot, das der tats{\"a}chlichen Anzahl der Spots am n{\"a}chsten kam. Bei Verwendung von nur einer Aufnahme pro Well identifizierte das KS Elispot compact deutlich weniger Spots als bei Aufnahme von 4 Bildern pro Well. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Systemen KS Elispot und KS Elispot compact wurden bei der Messung durch das KS Elispot compact mit einem Bild pro Well bei Spotzahlen {\"u}ber 100 bei Mausspots und {\"u}ber 400 bei Humanspots gesehen. Die zwischen dem KS Elispot und dem KS Elispot compact nachgewiesenen Unterschiede waren bei kleinen Spots (bis 100µm) deutlich gr{\"o}ßer als bei Spots gr{\"o}ßerer Durchmesser. Der Vergleich der Systeme erbrachte, dass das hochaufl{\"o}sende KS Elispot eine bessere Auswertungsqualit{\"a}t als das KS Elispot compact bietet, insbesondere bei der Auswertung von Elispot-Proben, die sehr viele und zudem sehr kleine Spots enthielten. Beim KS Elispot compact war die Messung mit 4 Bildern pro Well der Auswertung mit nur einem Bild pro Well bez{\"u}glich der Zuverl{\"a}ssigkeit klar {\"u}berlegen. Bei Verwendung des KS Elispot compact sollte deshalb bei sehr kleinen Spots zumindest die mit 4 Bildern pro Well arbeitende Einstellung gew{\"a}hlt werden. Weiterhin ist zu bemerken, dass eine optimale Auswertung von Elispot-Proben durch automatisierte Reader-Systeme maßgeblich durch die Pr{\"a}paration der verwendeten Elispot-Proben und die daraus resultierende Qualit{\"a}t der Spots beeinflusst wird. Zahlreiche Artefakte, eine starke Untergrundf{\"a}rbung oder nicht deutlich ausgebildete typische Spotmerkmale k{\"o}nnen die Messergebnisse eines Systems beeintr{\"a}chtigen. Hierbei wurde das KS Elispot compact System st{\"a}rker beeinflusst als das KS Elispot System. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Auswertung der Elispot-Proben und damit die gewonnenen Ergebnisse von dem verwendeten, automatisierten Lesesystem abh{\"a}ngen.Die Arbeit unterstreicht den hohen Stellenwert der Standardisierung, Validierung und Optimierung aller Komponenten der Elispot-Methode. Dies ist auch gerade in Bezug auf die Weiterentwicklung dieser Technik und die Er{\"o}ffnung von weiteren Einsatzspektren unerl{\"a}sslich.},
  language  = {de}
}