@phdthesis{LehmanngebHofmann2017,
  author    = {Lehmann [geb. Hofmann], Anna},
  title     = {Entwicklung potenzieller Inhibitoren der Hitzeschockkomponenten HSF1 und HSP70 am Modell des Multiplen Myeloms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-153477},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Krebs geh{\"o}rt zu einem der zentralen Leiden der 21. Jahrhunderts und ist in den einkommensstarken L{\"a}ndern die zweith{\"a}ufigste Todesursache. Die Erkrankung Multiples Myleom (MM) geh{\"o}rt mit 1.3 \% aller Krebserkrankungen zwar zu den seltenen Formen, verl{\"a}uft jedoch meist t{\"o}dlich und zeichnet sich durch eine unkontrollierte Entartung der monoklonaler Plasmazellen im Knochenmark aus. Da maligne Zellen dauerhaft internen und externen Stressfaktoren ausgesetzt sind und auf die Hitzeschutzantwort angewiesen sind, stellen die Komponenten des Hitzeschocksystems wie z.B. Chaperone HSP70 und HSP90 bzw. der Hitzeschockfaktor HSF1 ein attraktives therapeutisches Ziel dar. Nachweislich f{\"u}hrt die Inhibition des Chaperons HSP90 zur HSF1-vermittelten Hochregulation des Proteins HSP70, sodass die Hitzeschutzantwort der zytotoxischen Aktivit{\"a}t der Inhibitoren entgegenwirkt und die Therapieerfolgschancen mindert. Die vorliegende Doktorarbeit, die im Rahmen der Klinischen Forschergruppe 216 (CRU216) ausgearbeitet wurde, befasste sich einerseits mit der Erweiterung der bereits vorhandenen Substanzbibliotheken sowohl zur Inhibition des Proteins HSP70 als auch des Transkriptionsfaktors HSF1. Hierdurch sollten detailliertere Struktur-Wirkungs-Bezeugungen evaluiert werden. Weiterhin wurden die kooperierenden Arbeitsgruppen des Forschungsprojektes durch die Entwicklung und Herstellung von Substanzen unterst{\"u}tzt, um mit Hilfe vielseitiger Methoden die exakten Wirkmechanismen beider Verbindungsklassen zu verstehen und aufzukl{\"a}ren. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivate aus der vorangehenden Arbeit wurde erfolgreich um neue Carbons{\"a}ure- ((±) 6a-j) und Carbons{\"a}ureamidverbindungen ((±) 7b-e) erweitert. Durch die Substitution phenolischer Seitengruppen der Isoquinolinone gelang es, S{\"a}urederivate herzustellen, die eine h{\"o}here Zytotoxizit{\"a}t auf den INA-6-Zellen als die Leitstruktur AH073t aufwiesen. Dabei handelt es sich um die monobromierte Verbindung (±) 6c (EC50 = 0.17 µM) oder das Derivat mit einem kurzem Bromoethoxylinker (±) 6j (EC50 = 0.18 µM). Parallel hierzu wurde festgestellt, dass die Substitution aromatischer Seitengruppen durch aliphatische Reste ((±) 6h-i) zum kompletten Aktivit{\"a}tsverlust f{\"u}hrte. Durch dir fortf{\"u}hrende Umsetzung zu den Amiden gelang die Herstellung des Derivates (±) 7c (EC50 = 0.47 µM), welches eine {\"a}hnliche Aktivit{\"a}t im Vergleich zu der Struktur AH122t ((±) 7a) zeigte. Weiterhin wurde Verbindung (±) 7d identifiziert, die eine sechsfach h{\"o}here Zytotoxizit{\"a}t von 34.8 nM im Vergleich zu der Leitstruktur (±) 7a (EC50 = 200 nM) aufwies. Die Trennung der trans-Enantiomere der Leitstruktur AH073t wurde erfolgreich mit Hilfe einer chiralen chromatographischen Methode durchgef{\"u}hrt und die Absolutkonfiguration mit Hilfe der Circulardichroismus-Spektroskopie (Arbeitskreis Bringmann) bestimmt. Durch die biologische Untersuchung an den MM-INA-6-Zellen (Arbeitskreis Chatterjee) wurde die enantiospezifische Aktivit{\"a}t des 3R,4R-Enantiomers best{\"a}tigt, wohingegen das 3S,4S-Isomer hingegen nicht aktiv war. Die angestrebte Amidierung zu enantiomerenreinen Substanzen f{\"u}hrte gegen die Erwartung zu einem Diastereomerengemisch, da aufgrund des aciden Protons am Kohlenstoff C-4 die Carbons{\"a}uren im Laufe der Synthese epimerisierten. Um die Epimerisierung an der aciden Position zu vermeiden, wurden neuartige Isochinolinoncarbons{\"a}ure-Derivate hergestellt, die erstmalig an dem Kohlenstoff C 4 substituiert wurden. Mit Hilfe einer Schutzgruppentechnik wurden in drei Syntheseschritten erfolgreich drei neue Derivate, n{\"a}mlich eine fluorierte ((±) 11), methylierte ((±) 15) und ethylierte Verbindung ((±) 16), erhalten. Die Bestimmung der Absolutkonfiguration der fluorierten und ethylierten Spezies gelang durch die R{\"o}ntgenstrukturanalyse der Einkristalle (Arbeitskreis Braunschweig). Dabei wurde festgestellt, dass die Alkylierungsreaktion stereospezifisch verliefen und ausschließlich cis-Derivate erhalten wurden. Die biologische Untersuchung dieser Substanzen best{\"a}tigte die Konfiguration, da alle drei Verbindungen keine Aktivit{\"a}t auf MM-INA-6-Zellen zeigten (EC50 >100 µM). Weiterhin wurde mit Hilfe einer UV-metrischen Messung die S{\"a}ttigungskonzentration der neuen Derivate untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Substitution am Kohlenstoff C-4 zur Senkung der L{\"o}slichkeit gef{\"u}hrt hat. Anhand der Proteinkristallstruktur des bHSC70 (C.Grimm) wurde ein TMAO-Molek{\"u}l in der N{\"a}he der der Interface-Oberfl{\"a}che identifiziert. Basierend auf diesem Ergebnis wurde eine Methode zur Herstellung eines TMAO-Isochinolinonhybrides entwickelt, welches sich an der Leitstruktur AH073t orientierte. W{\"a}hrend der Synthesesequenz ist es zu der Decarboxylierung des angestrebten 3,4-Dihydroisochinolin-1(2H)-on-Derivates gekommen, wodurch das neue Derivat 17 erhalten wurde. Nachdem die Reaktionsbedinungen variiert und die gew{\"u}nschte Verbindung nicht erhalten wurde, wurde 17 im darauffolgenden Syntheseschritt erfolgreich zum TMAO-Hybrid 18 umgesetzt. Der Szintillationsn{\"a}henachweis (SPA) ist eine etablierte Methode, um mit Hilfe von radioaktivmarkierten Liganden Bindungsstudien im Hochdurchsatzformat durchzuf{\"u}hren und hier die Bindungsposition der Isochinolinon-Derivate zu untersuchen. Die Substanz AH122t diente hierbei als Leitstruktur zur Entwicklung einer Methode zur Radioaktivmarkierung der potentiellen HSP70-Inhibitoren, sodass die aktivierte Stanylverbindung (±) 19 erhalten wurde. Diese Verbindung konnte in der Gegenwart von Chloramin T und des NaI-Salzes innerhalb von wenigen Sekunden zum Radioliganden (±) 7d* umgesetzt werden. Die Herstellung des Radioliganden wurde mittels einer entwickelten HPLC-Methode analysiert und validiert. Eine weitere M{\"o}glichkeit zur Evaluieren der potentiellen Bindungspartner der hergestellten Isochinolinon-Verbindungen bietet die Affinit{\"a}tschromatographie gekoppelt mit der proteomischen Analyse mittels quantitativer Massenspektrometrie (Arbeitskreis Schlosser). Es gelang die Herstellung der Biotin-markierter Liganden (±) 23, der sich an der Leitstruktur AH073t orientierte, und (±) 25, der sich an AH081t orientierte. Die ersten Analysen mittels Affinit{\"a}tschromatographie zeigten, dass mit dem Liganden (±) 23 {\"u}berraschenderweise keine Proteine signifikant angereichert wurden, w{\"a}hrend mit dem Liganden (±) 25 zwar keine HSP70-Proteine angereichert, aber einige Komponenten der Hitzeschutzantwort wie die Phosphatidylinositol-Kinasen DNA-PK und ATM, und die Untereinheiten des Chaperons HSP90 identifiziert werden konnten. Die bereits bestehende Substanzbibliothek der -Acylaminocarboxamide wurde erfolgreich mit Hilfe der Ugi-Multikomponentenreaktion um die Derivate (±) 38c-g erweitert. Die Evaluierung der biologischen Aktivit{\"a}t erfolgte semiquantitativ mittels Westernblot und quantitativ mittels ELISA-Assay (Arbeitskreis Chatterjee), wobei die Beurteilung indirekt anhand des HSF1-vermittelten Regulationslevels des Chaperons HSP72 erfolgte. Hierbei wurden neue Verbindungen (±) 38c und (±) 38g mit dem ,-ges{\"a}ttigten Carbonylsystem identifiziert, die eine vergleichbare inhibitorische Aktivit{\"a}t wie die bereits bekannten unges{\"a}ttigten Derivaten (±) 37l oder (±) 37m zeigten, was darauf hinweist, dass die inhibitorische Aktivit{\"a}t der  Acylaminocarboxamide nicht von der kovalenten Bindung des Michael-Systems verursacht wird. Um das Target der -Acylaminocarboxamide zu evaluieren, wurde auch hier die Durchf{\"u}hrung der Affinit{\"a}tschromatographie gekoppelt mit der Analyse mittels der quantitativer Massenspektrometrie angestrebt (Arbeitskreis Schlosser). In Anlehnung an die Synthesemethodik f{\"u}r die HSP70-Liganden wurden hierf{\"u}r die Biotin-markierten Liganden (±) 42, (±) 44 und (±) 46 erfolgreich hergestellt, die sich durch die Position des Biotinlinkers unterscheiden. Die proteomische Untersuchung wurde erfolgreich mit den Liganden (±) 44 und (±) 46 durchgef{\"u}hrt und es wurden 68 Proteine signifikant angereichert. Viele dieser Proteine tragen die sogenannte Armadillo-Dom{\"a}ne, die eine wichtige Rolle in der Protein-Protein-Interaktion spielt und eine hochkonservierte Bindungstasche aufweist. Unter den angereicherten Proteinen befanden sich mitunter der MICOS-Komplex, der CCR4-NOT-Komplex und die Kinasen des Phosphatidylinositol-Signalwegs. Von den letzteren konnten explizit die Kinasen DNA-PK, ATM, ATR und mTOR identifiziert werden, die m{\"o}glicherweise die HSF1-regulierte HSP70-Expression beeinflussen. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Position des Linkers die Bindung an zwei unterschiedliche Proteingruppen beeinflusst. W{\"a}hrend der Ligand (±) 44 ausschließlich mit den Proteinen des CCR4-NOT-Komplexes interagierte, wurden f{\"u}r den Liganden (±) 46 die Komponenten des COG Komplexes identifiziert.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}