@phdthesis{Danzer2002,
  author    = {Danzer, Claus-Peter},
  title     = {Generierung von chim{\"a}ren M{\"a}usen mit Mutationen in der Signalleitungs-Dom{\"a}ne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-M{\"a}usen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialins{\"a}ure-bindende Immunglobulin-{\"a}hnliche Lectine). Mit der {\"a}ußersten der 7 extrazellul{\"a}ren Ig-{\"a}hnlichen Dom{\"a}nen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialins{\"a}ure interagieren. In der cytoplasmatischen Dom{\"a}ne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungekl{\"a}rt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerst{\"o}rte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Dom{\"a}ne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren f{\"u}r CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. F{\"u}r beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingef{\"u}hrten Mutationen vollst{\"a}ndig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chim{\"a}re Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank erm{\"o}glichte die Verl{\"a}ngerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch {\"o}ffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Ver{\"a}nderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerst{\"o}rten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalit{\"a}t des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig f{\"u}r die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialins{\"a}ure auf der selben Zelloberfl{\"a}che (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialins{\"a}ure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5\% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-M{\"a}usen, aber nur ca. 4,5\% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- M{\"a}usen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialins{\"a}ure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In {\"U}bereinstimmung damit f{\"u}hrte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abh{\"a}ngiger Demaskierung. 4. FACS-F{\"a}rbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- M{\"a}usen um ca. 70-80\% gegen{\"u}ber wt-M{\"a}usen verkleinert ist. In Best{\"a}tigung fr{\"u}herer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabh{\"a}ngige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- M{\"a}usen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant st{\"a}rker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- M{\"a}usen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}