@phdthesis{Kraus2020,
  author    = {Kraus, Michael},
  title     = {The Conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase into a Polyphenol Transglucosidase via Structure-based Enzyme Engineering},
  doi       = {10.25972/OPUS-19247},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-192477},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2020},
  abstract  = {The initial goal was the conversion of Bifidobacterium adolescentis Sucrose Phosphorylase (BaSP) into a polyphenol glucosidase by structure based enzyme engineering. BaSP was chosen because of its ability to utilize sucrose, an economically viable and sustainable donor substrate, and transfer the glucosyl moiety to various acceptor substrates. The introduction of aromatic residues into the active site was considered a viable way to render it more suitable for aromatic acceptor compounds by reducing its polarity and potentially introducing π-π-interactions with the polyphenols. An investigation of the active site revealed Gln345 as a suitable mutagenesis target. As a proof of concept BaSP Q345F was employed in the glycosylation of (+)-catechin, (-)-epicatechin and resveratrol. The variant was selective for the aromatic acceptor substrates and the glucose disaccharide side reaction was only observed after almost quantitative conversion of the aromatic substrates. A crystal structure of BaSP Q345F in complex with glucose was obtained and it displayed an unexpected shift of an entire domain by 3.3 {\AA}. A crystal structure of BaSP D192N-Q345F, an inactive variant in complex with resveratrol-3-α-D-glucosid, the glucosylation product of resveratrol, synthesized by BaSP Q345F was solved. It proved that the domain shift is in fact responsible for the ability of the variant to glycosylate aromatic compounds. Simultaneously a ligand free crystal structure of BaSP Q345F disproved an induced fit effect as the cause of the domain shift. The missing link, a crystal structure of BaSP Q345F in the F-conformation is obtained. This does not feature the domain shift, but is in outstanding agreement with the wildtype structure. The domain shift is therefore not static but rather a step in a dynamic process. It is further conceivable that the domain shifted conformation of BaSP Q345F resembles the open conformation of the wild type and that an adjustment of a conformational equilibrium as a result of the Q345F point mutation is observed. An investigation into the background reaction, the formation of glucose-glucose disaccharides of BaSP Q345F and three further variants that addressed the same region (L341C, D316C-L341C and D316C-N340C) revealed the formation of nigerose by BaSP Q345F.},
  subject      = {Phosphorylase},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kraus2006,
  author    = {Kraus, Michael},
  title     = {Synthese von 14C-markierten Anthocyanidinen und Studien zur intestinalen Verf{\"u}gbarkeit von Anthocyanen aus Heidelbeeren (Vaccinium myrtillus L.)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21026},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der Ern{\"a}hrung wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung von entz{\"u}ndlichen und b{\"o}sartigen Erkrankungen des Darmtraktes zugesprochen. So ist bekannt, dass fettreiche Ern{\"a}hrung mit hohem Fleischverzehr das Auftreten derartiger Krankheiten beg{\"u}nstigt. Auf der anderen Seite weiß man, dass sekund{\"a}re Pflanzeninhaltsstoffe wie Polyphenole und Flavonoide sowohl in vitro als auch im Tierversuch chemopr{\"a}ventive Effekte zeigen. Besondere Bedeutung scheint den Anthocyanen zuzukommen. Dabei ist bislang ungekl{\"a}rt, wie hoch der Anteil an Anthocyanen nach dem Verzehr von z. B. Fr{\"u}chten ist, der in den Dickdarm gelangt. Es war ein Ziel der vorliegenden Arbeit, diese Fragestellung an Hand eines einschl{\"a}gigen Beispiels, d.h. der Anthocyane aus Heidelbeeren (Vaccinum mytillus L.), zu beantworten. Wir f{\"u}hrten hierzu eine Interventionsstudie mit Ileostomie-Probanden durch. Nach polyphenolfreier Ern{\"a}hrung {\"u}ber 24 Stunden verzehrten f{\"u}nf Probanden je 300 g Wildheidelbeeren. Der Ileostoma-Ausfluss wurde danach in zeitlichen Abst{\"a}nden gesammelt, sofort tiefgefroren und nach extraktiver Probenaufarbeitung mittels HPLC-DAD und HPLC-ESIpos-MS/MS untersucht. Quantitative Bestimmungen erfolgten via HPLC-DAD, wobei die jeweilige Kalibrierung mit eigens aus Heidelbeeren isolierten authentischen Anthocyanreferenzen durchgef{\"u}hrt wurde. Durchschnittlich sind 46 \% der aufgenommen Anthocyanmenge im Ileostoma-Ausfluss wieder gefunden worden. Der ausgeschiedene Anteil war abh{\"a}ngig von der Struktur des Aglycons und des jeweiligen Zuckerrestes. Malvidin-3-O-arabinosid (Mv-3-O-ara) (42) wurde zu 85.1\% der aufgenommenen Menge im D{\"u}nndarmausfluss detektiert, Cyanidin-3-O-glucosid (Cy-3-O-glc) (6) hingegen nur zu 28.3\%. Das Maximum der Ausscheidung lag zwischen zwei und vier Stunden. Insgesamt war erkennbar, dass Glucoside am st{\"a}rksten metabolisiert oder aufgenommen wurden. Stabiler waren die Galactoside; Arabinoside [ausgenommen Delphinidin-3-O-arabinosid (12)] zeigten die gr{\"o}ßte Stabilit{\"a}t. Diese Tendenz wurde in Modellversuchen, bei denen verschiedene Anthocyane mit polyphenolfreiem D{\"u}nndarmausfluss inkubiert wurden, best{\"a}tigt. Stabilit{\"a}tsuntersuchungen der freien Aglycone ergaben Abh{\"a}ngigkeiten vom Substitutionsmuster der Anthocyanidine am B-Ring; methoxylierte Strukturen erwiesen sich weitaus stabiler als hydroxylierte. Zusammenfassend ist erstmals festzustellen, dass ein beachtlicher Teil der applizierten Anthocyane unter physiologischen Umst{\"a}nden in den Dickdarm gelangt und dort zur Pr{\"a}vention von Darmerkrankungen beitragen k{\"o}nnte. Da aber auf Grund der gewonnenen Ergebnisse auch ein beachtlicher Teil der Anthocyane nicht wieder gefunden wurde und aus der Literatur bekannt ist, dass sich nur sehr geringe Mengen im Urin nachweisen lassen, stellt sich die Frage {\"u}ber den Verbleib dieser Anthocyananteile. Eine Strategie, dieses Problem experimentell anzugehen, beruht in der Anwendung markierter Substrate, z. B. 14C-markierter Anthocyanidine. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden demzufolge [4-14C]-Pelargonidinchlorid (35) und [4-14C]-Delphinidin-chlorid (36) (auf Grundlage entsprechender nicht markierter Versuche) synthetisiert. Beide Synthesen gingen von 1,3,5-Trihydroxybenzol (37) aus. In einer Vilsmeyer-Reaktion wurde mittels [Formyl-14C]-dimethylformamid markierter 2,4,6-Trihydroxy-benzaldehyd (38) gewonnen. Nach Benzoylierung erhielt man den f{\"u}r die weiteren Schritte ben{\"o}tigten, radioaktiv markierten Baustein 2-Benzoyl-4,6-dihydroxybenzalde-hyd (39). [4-14C]-Pelargonidinchlorid (35) erhielt man durch Kondensation von [Formyl-14C]-2-benzoyl-4,6-dihydroxybenzaldehyd (39) mit \&\#969;,4-Diacetoxyacetophenon (17), welches ausgehend von Methoxybenzol (22) in einer dreistufigen Synthese gewonnen wurde. [4-14C]-Delphinidinchlorid (36) wurde durch Kondensation von 2-Benzoyl-4,6-dihydroxybenzaldehyd (39) mit \&\#969;,3,4,5-Tetraacetoxyacetophenon (20) erhalten. Die Synthese des Intermediates (20) erfolgte ausgehend von 3,4,5-Trihydroxybenzoes{\"a}ure (30) via 3,4,5-Triacetoxybenzoes{\"a}ure (31), deren Acylchlorid (32), anschließender Umsetzung zum Diazoketon (33) und Gewinnung von \&\#969;,3,4,5-Tetraacetoxyacetophenon (20), aus dem [4-14C]-Delphinidinchlorid in zwei Schritten zug{\"a}nglich war. Mit der damit erstmals gew{\"a}hrleisteten Bereitstellung 14C-markierter Anthocyanidine ist der Weg f{\"u}r zuk{\"u}nftige Tierversuche zur Ermittlung der Verteilung von Anthocyanidinen im K{\"o}rper geebnet.},
  subject      = {Blaubeere},
  language  = {de}
}