@phdthesis{Dorsch2009,
  author    = {Dorsch, Sandra},
  title     = {Rezeptor-Rezeptor-Interaktion ß-adrenerger Rezeptoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39712},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Viele Membranrezeptoren liegen als {\"u}ber Disulfidbr{\"u}cken-verbundene Dimere vor. Ein Nachweis der Dimerisierung ist in diesen F{\"a}llen methodisch klar und einfach zu erbringen. F{\"u}r die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren dagegen ist weder die Existenz von Di- oder Oligomeren noch deren Funktion eindeutig belegt. Meist wurden Methoden wie Coimmunopr{\"a}zipitation und Resonanz-Energie-Transfer-Verfahren wie BRET oder FRET verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu untersuchen. Trotz ihrer hohen Sensitivit{\"a}t besitzen diese Methoden einige Grenzen und k{\"o}nnen je nach experimentellem Ansatz und Verwendung verschiedener Kontrollen, unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich des Vorliegens einer Protein-Protein-Interaktion liefern. Weder die Stabilit{\"a}t der Interaktion, noch die Fraktion der interagierenden Proteine kann mittels Resonanz-Energie-Transfer-Assays zuverl{\"a}ssig ermittelt werden. Auch die Gr{\"o}ße der Komplexe ist nicht oder nur technisch aufwendig bestimmbar. Deshalb wurde in dieser Arbeit eine neue, unabh{\"a}ngige Methode entwickelt, um Rezeptor-Rezeptor-Interaktionen in lebenden Zellen genauer untersuchen zu k{\"o}nnen. Diese auf „Fluorescence Recovery after Photobleaching" basierende Mikroskopie-Methode erlaubt die Mobilit{\"a}t von Proteinen zu bestimmen. Um Homointeraktionen zwischen Proteinen messen zu k{\"o}nnen, m{\"u}ssen zwei Protein-Fraktionen mit unterschiedlicher Mobilit{\"a}t vorliegen. Deshalb wurde eine Rezeptor-Fraktion extrazellul{\"a}r mit YFP markiert und mit Hilfe polyklonaler Antik{\"o}rper gegen YFP spezifisch immobilisiert. Die andere Rezeptorfraktion wurde intrazellul{\"a}r mit CFP oder Cerulean markiert und wurde deshalb nicht von extrazellul{\"a}ren Antik{\"o}rpern erkannt. So konnten mittels Zwei-Farben-FRAP potenzielle Interaktionen zwischen den immobilisierten extrazellul{\"a}r-markierten Rezeptoren und den intrazellul{\"a}r-markierten Rezeptoren durch eine Mobilit{\"a}ts{\"a}nderung letzterer detektiert werden. Diese Methode wurde mittels eines monomeren (CD86) und kovalent dimeren (CD28) Rezeptors validiert. Es zeigte sich, dass eine spezifische Immobilisierung extrazellul{\"a}r-markierter Proteine nur durch polyklonale, nicht aber durch monoklonale Antik{\"o}rper gegen YFP erreicht werden konnte. Intrazellul{\"a}r-markierte Proteine wurden hierbei in ihrer Mobilit{\"a}t nicht durch die extrazellul{\"a}ren Antik{\"o}rper beeinflusst. Bei Immobilisierung des extrazellul{\"a}r-markierten CD86 war das coexprimierte, intrazellul{\"a}r-markierte CD86-CFP weiterhin voll mobil. Außerdem zeigte das Monomer CD86 eine vom relativen CFP-YFP-Expressionsverh{\"a}ltnis unabh{\"a}ngige Mobilit{\"a}t. Dieses Ergebnis ließ den Schluss zu, dass extra- und intrazellul{\"a}r-markiertes CD86 nicht miteinander interagieren und als Monomer vorliegen. Die Mobilit{\"a}t des kovalenten Dimers CD28 war dagegen abh{\"a}ngig vom CFP-YFP-Expressionsverh{\"a}ltnis und stimmte gut mit theoretisch erwarteten Werten f{\"u}r ein Dimer {\"u}berein. Die Anwendung der Zwei-Farben-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen ß1- und ß2-adrenergen Rezeptoren zeigte Unterschiede zwischen beiden Rezeptor-Subtypen. ß1-AR zeigte eine spezifische transiente Interaktion, ß2-AR dagegen lagen als stabile Oligomere h{\"o}herer Ordnung vor. Die transiente Interaktion zwischen ß1-AR und die stabile Oligomerisierung von ß2-AR wurde nicht nur in HEK 293T-Zellen sondern auch in neonatalen Rattenkardiomyozyten und bei 37 °C beobachtet. Ferner hatte der Aktivierungszustand des jeweiligen Rezeptors keinen Einfluß auf das Ausmaß der Interaktion. Zwischen ß1- und ß2-AR wurde nur eine sehr schwache und instabile Heterointeraktion mittels der Zwei-Farben-FRAP-Methode beobachtet. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob eine direkte Interaktion zwischen den adrenergen Rezeptoren vorliegt, wurde die BRET-Methode verwendet. Mittels BRET wurde eine direkte Interaktion zwischen ß2-AR festgestellt, jedoch konnte nicht zwischen Dimeren und Oligomeren h{\"o}herer Ordnung unterschieden werden. Bei ß1-AR fand bei h{\"o}heren YFP-Rluc-Expressionsverh{\"a}ltnissen ein spezifischer Energietransfer statt. Bei niedrigeren Expressionsverh{\"a}ltnissen lag das Signal jedoch im unspezifischen Bereich. Auch bei Untersuchung der Heterointeraktion zwischen ß1- und ß2-AR konnte keine klare Aussage {\"u}ber eine spezifische Interaktion zwischen beiden Rezeptor-Subtypen getroffen werden.},
  subject      = {Dimerisierung},
  language  = {de}
}