@phdthesis{Blachutzik2012,
  author    = {Blachutzik, J{\"o}rg O.},
  title     = {Visualisierung von Plasmamembran-Dom{\"a}nen in Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodom{\"a}nen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch aufl{\"o}sender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abh{\"a}ngige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine f{\"u}r kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodom{\"a}nen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelett{\"a}ren Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. M{\"o}glicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. F{\"u}r zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Voll{\"a}ngenproteine erneut an der PM zu finden. F{\"u}r die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen k{\"o}nnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandom{\"a}nen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Dom{\"a}nen ausbilden, das m{\"o}glicherweise zur Stabilit{\"a}t und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beitr{\"a}gt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Gr{\"o}ßenverteilung von 97±4nm Durchmesser f{\"u}r PM-st{\"a}ndige Dom{\"a}nen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Dom{\"a}nen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabh{\"a}ngigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabh{\"a}ngige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodom{\"a}nen beschr{\"a}nkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine f{\"u}r Membrandom{\"a}nen.},
  subject      = {Plasmamembran},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Findling2012,
  author    = {Findling, Simone},
  title     = {Untersuchungen zur Relevanz der reversiblen Methylierung von Jasmons{\"a}ure in Solanum lycopersicum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74595},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Jasmonate sind wichtige zellul{\"a}re Mediatoren, die eine essentielle Rolle in der Pflanzen-entwicklung und Abwehr von biotischem und abiotischem Stress spielen. Jasmons{\"a}ure (JA) als zentrales Intermediat kann dabei auf unterschiedlichste Art und Weise metaboli-siert werden. Eine M{\"o}glichkeit der Metabolisierung ist die Veresterung der JA zu Methyljasmonat (MeJA) durch die Jasmons{\"a}ure-Carboxyl-Methyltransferase (JMT). Interessanterweise ist diese Reaktion reversibel, da die Methyljasmonatesterase (MJE) die Hydrolyse zu JA katalysiert. Obwohl die Funktion diverser Metabolite, wie die des biologisch aktivsten Metaboliten JA-Isoleucin, aufgekl{\"a}rt wurde, ist die Rolle der reversiblen Methylierung noch weitestgehend unklar. Aufgrund der differenten physikochemischen Eigenschaften von JA und MeJA wird diskutiert ob MeJA von JA unterschiedliche biologische Eigenschaften aufweist und/oder als transzellul{\"a}res oder systemisches Signal fungiert. Anhand der Generierung transgener Pflanzen, in denen die Umwandlung zwischen JA und MeJA gest{\"o}rt ist, sollten diese Hypothesen {\"u}berpr{\"u}ft werden. Dazu wurden Tomatenlinien hergestellt, die die Enzyme der reversiblen Methylierung (JMT, MJE) {\"u}berexprimieren (JMT-OE, MJE-OE) sowie Linien, in denen durch ,,Post transcriptional gene silencing" die MJE verringert exprimiert wird. Basierend auf MJE-RNAi-Linien, die eine reduzierte in vitro MeJA-Hydrolyseaktivit{\"a}t auf-weisen, sollte durch exogene Applikation von MeJA analysiert werden, ob MeJA selbst biologische Aktivit{\"a}ten aufweist oder zun{\"a}chst mittels MJE in JA umgewandelt werden muss. Es war kein reproduzierbarer Unterschied der Reaktion auf die MeJA-Applikation {\"u}ber die w{\"a}ssrige Phase und {\"u}ber die Gasphase zwischen Kontroll- und MJE-RNAi-Linien festzustellen. Um zu eruieren, ob MeJA als transzellul{\"a}res, parakrines Signal agiert, wurden die Gen-expression und das Oxylipinprofil in verwundeten Bl{\"a}ttern der transgenen Linien unter-sucht. Ob MeJA als systemisches Signal dient, sollte anhand der Verwundung von Pfropfkombinationen aus Kontrolllinie als Unterlage und MJE-RNAi als Spross anhand der Analyse der Genexpression in distalen Bereichen festgestellt werden. Die Ergebnisse der Studien deuten daraufhin, dass MeJA weder als transzellul{\"a}res Signal noch als sys-temisches Signal bei der Verwundungsantwort agiert. Zudem kann ausgeschlossen wer-den, dass die MJE in distalen Bereichen der Pflanze in der Perzeption des systemischen Signals involviert ist. Da Jasmonate an der Abwehr von Pathogenen beteiligt sind, wurde die Empfindlichkeit gegen{\"u}ber dem nekrotrophen Pilz S. sclerotiorum getestet. Alle transgenen Linien mit Ver{\"a}nderung der reversiblen Methylierung wiesen erh{\"o}hte L{\"a}sionsgr{\"o}ßen, st{\"a}rkeres Pilzwachstum und erh{\"o}hte JA-Isoleucin und 12-OH-JA-Isoleucin Spiegel auf. Allerdings war keine Korrelation zwischen den erh{\"o}hten JA-Isoleucin Spiegeln und der Expression von Abwehrgenen wie PINII und JA-Biosyntheseenzymen wie AOC zu verzeichnen. Somit scheint die reversible Methylierung eine Rolle in der Pathogenabwehr gegen{\"u}ber S. sclerotiorum zu spielen jedoch sind die Mechanismen, die zur erh{\"o}hten Suszeptibilit{\"a}t der Linien f{\"u}hren, noch unklar.},
  subject      = {Jasmons{\"a}ure},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Grebner2012,
  author    = {Grebner, Wiebke},
  title     = {Organspezifische Bildung und Funktion von Oxylipinen in Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76730},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Oxylipine sind Signalmolek{\"u}le, welche durch die enzymatische oder nicht-enzymatische Oxidation von Fetts{\"a}uren gebildet werden. Eine bedeutende Gruppe von Oxylipinen in Pflanzen sind die Jasmonate. Dazu z{\"a}hlen Jasmons{\"a}ure (JA), deren Vorstufe 12-Oxophytodiens{\"a}ure (OPDA) sowie deren Metabolite. Ein bedeutender Metabolit von JA ist das Aminos{\"a}ure-Konjugat JA-Isoleucin (JA-Ile), welches hohe biologische Aktivit{\"a}t besitzt. Besonders f{\"u}r die oberirdischen Organe von Pflanzen wurden bisher vielf{\"a}ltige Funktionen von Jasmonaten beschrieben. Sie sind beteiligt an verschiedenen Entwicklungsprozessen wie der Fertilit{\"a}t von Bl{\"u}ten, aber auch an der Abwehr von Pathogenen und Herbivoren und bei der Reaktion von Pflanzen auf abiotische Stressoren wie hohe Salzkonzentrationen oder Trockenheit. {\"U}ber die Bildung und Funktion von Oxylipinen in Wurzeln ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die Gehalte von Galaktolipiden und Jasmonaten in Spross und Wurzel von Arabidopsis thaliana Pflanzen verglichen. Mit Hilfe verschiedener JA Biosynthese-Mutanten konnte zudem die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel und deren biologische Funktion in diesem Pflanzenorgan untersucht werden. Um die Wurzeln der Arabidopsis Pflanzen einfach behandeln zu k{\"o}nnen und um schnell und stressfrei gr{\"o}ßere Mengen von Wurzelmaterial ernten zu k{\"o}nnen, wurde ein hydroponisches Anzuchtsystem etabliert. Die Analyse von Galaktolipiden zeigte, dass in der Wurzel deutlich geringere Galaktolipid Gehalte als im Spross vorhanden sind. Da Galaktolipide den Hauptbestandteil plastid{\"a}rer Membranen ausmachen, in den Wurzeln insgesamt jedoch weniger Plastiden vorkommen als in Bl{\"a}ttern, w{\"a}re dies ein m{\"o}glicher Grund f{\"u}r den beobachteten Unterschied. Das Vorkommen von mit OPDA oder dnOPDA veresterten Galaktolipiden (Arabidopsiden) wird in der Literatur f{\"u}r die Thylakoidmembranen der Chloroplasten beschrieben. Die Analyse der Arabidopsid Gehalte von Wurzeln konnte diese Aussage st{\"u}tzen, da in Wurzeln, welche normalerweise keine Chloroplasten besitzen, nahezu keine Arabidopside detektiert werden konnten. Die Analyse der Jasmonate zeigte anhand von Pfropfungsexperimenten mit der Jasmonat-freien dde2 Mutante, dass die Wurzeln unabh{\"a}ngig vom Spross in der Lage sind Jasmonate zu bilden, obwohl die Expression vieler JA-Biosynthese-Gene in den Wurzeln sehr gering ist. Zudem zeigten diese Experimente, dass es keinen direkten Transport von Jasmonaten zwischen Spross und Wurzel gibt. Die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel konnte durch verschiedene Stresse wie Verwundung, osmotischen Stress oder Trockenheit induziert werden. K{\"a}lte und Salzstress hatten hingegen keinen Jasmonat-Anstieg in den Wurzeln zur Folge. Anders als bei osmotischem Stress und Trockenheit, wo sowohl die Gehalte von OPDA als auch von JA und JA-Ile anstiegen, konnte bei Verwundung keine Zunahme der OPDA-Spiegel detektiert werden. Hier kam es zu einer deutlichen Abnahme, wohingegen die JA und JA-Ile Spiegel sehr stark anstiegen. Dies deutet darauf hin, dass es sehr komplexe und vielf{\"a}ltige Regulationsmechanismen hinsichtlich der Bildung von Jasmonaten gibt. Der erste Schritt der JA-Biosynthese, die Bildung von 13-Hydroperoxyfetts{\"a}uren (HPOTE), wird durch 13-Lipoxygenase (LOX) Enzyme katalysiert. In Arabidopsis sind vier unterschiedliche 13-LOX Isoformen bekannt. Die Untersuchung verschiedener 13-LOX-Mutanten ergab, dass nur die LOX6 an der Biosynthese von Jasmonaten in der Wurzel beteiligt ist. So konnten in Wurzeln der lox6 Mutante weder basal noch nach verschiedenen Stressen bedeutende Mengen von Jasmonaten gemessen werden. Im Spross dieser Mutante war basal kein OPDA vorhanden, nach Stresseinwirkung wurden jedoch {\"a}hnliche Jasmonat Gehalte wie im Wildtyp detektiert. Um Hinweise auf die biologische Funktion von Jasmonaten in Wurzeln zu erhalten, wurden Untersuchungen mit einer lox6 KO Mutante durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigte sich, dass abgeschnittene lox6 Wurzeln, welche keine Jasmonate bilden, im Vergleich zum Wildtyp von saprobiont lebenden Kellerasseln (Porcellio scaber) bevorzugt als Futter genutzt werden. Bl{\"a}tter dieser Mutante, welche nach Stress ann{\"a}hernd gleiche Jasmonat Gehalte wie der Wildtyp aufweisen, wurden nicht bevorzugt gefressen. Von der Jasmonat-freien dde2 Mutante wurden hingegen sowohl die Wurzeln als auch die Bl{\"a}tter bevorzugt gefressen. Neben den Experimenten mit Kellerasseln wurden auch Welke-Versuche mit lox6 und dde2 Pflanzen durchgef{\"u}hrt. Hierbei wiesen die lox6 Pflanzen, nicht aber die dde2 Pflanzen, eine erh{\"o}hte Suszeptibilit{\"a}t gegen{\"u}ber Trockenheit auf. dde2 Pflanzen haben im Gegensatz zu LOX Mutanten unver{\"a}nderte 13-HPOTE Gehalte, aus denen auch andere Oxylipine als Jasmonate gebildet werden k{\"o}nnen. Dies zeigt, dass durch LOX6 gebildete Oxylipine, im Falle von Trockenheit aber nicht Jasmonate, an der Reaktion von Arabidopsis Pflanzen auf biotische und abiotische Stresse beteiligt sind.},
  subject      = {Oxylipine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gueta2012,
  author    = {Gueta, Ronnie},
  title     = {Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Channelrhodopsinen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85693},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine geh{\"o}renden lichtaktivierbaren Ionenkan{\"a}le Channelrhodopsin 1 (ChR1) und Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii sind Bestandteile des visuellen Systems und an der Phototaxis beteiligt. Sie bestehen aus einem zytosolisch gelegenen C Terminus, dessen Funktion noch ungekl{\"a}rt ist und einem, f{\"u}r die Kanalaktivit{\"a}t verantwortlichen, N terminalen Bereich aus sieben Transmembranhelices. Der lichtsensitive Kofaktor all trans Retinal ist kovalent an einen Lysinrest (K257) der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei einer Belichtung mit Blaulicht isomerisiert das Chromophor zur 13 cis Form, was eine Konformations{\"a}nderung und das {\"O}ffnen des Kanals zur Folge hat. Im Zuge dessen str{\"o}men ein und zweiwertige Kationen in die Zelle und eine Depolarisation findet statt. Um einen tieferen Einblick in Struktur und funktionelle Mechanismen zu bekommen, wurden Wildtyp und Mutanten von Ch1 und ChR2 heterolog in Oozyten von X. laevis exprimiert. In Bakteriorhodopsin bilden die Seitenketten von T90 und D115 eine f{\"u}r Stabilit{\"a}t und Funktion wichtige Wasserstoffbr{\"u}cke aus. Durch elektrophysiologische, fluoreszenzmikroskopische und biochemische Verfahren wurden Mutanten der entsprechenden Reste in ChR2 (C128, D156) untersucht. Diese zeigten eine deutlich verlangsamte Kinetik und eine 10 bis 100fache Erh{\"o}hung der Lichtempfindlichkeit. Die identischen Auswirkungen von Mutationen beider Reste deuten auf eine Bindung mit funktioneller Bedeutung zwischen C128 und D156 hin. Im Falle von ChR2 C128T, C128A und D156A konnte der Kanal nach Anregung mit Blaulicht, durch gr{\"u}nes und violettes Licht vorzeitig geschlossen werden. Diese Lichtqualit{\"a}ten entsprechen den Absorptionswellenl{\"a}ngen zweier Intermediate des Photozyklus von ChR2 (P390 und P520). Durch Ver{\"a}nderung des externen pH-Wertes konnten Hinweise auf eine protonenabh{\"a}ngige Gleichgewichtsreaktion dieser Intermediate gefunden werden. Auch in dem f{\"u}r Protonen h{\"o}her leitf{\"a}higen ChR1 konnten Hinweise auf eine Interaktion zwischen den Resten C167 und D195 gefunden werden. Elektrische Messungen von Mutanten zeigten eine deutliche Erh{\"o}hung des Photostroms bei verh{\"a}ltnism{\"a}ßig geringem Anstieg der Schließzeit. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Kinetik war somit weniger ausgepr{\"a}gt als bei ChR2. Einen besonderen Stellenwert unter allen Channelrhodopsin Mutanten nehmen ChR2 D156C und ChR1 D195C ein. Mit einem Photostrom von 5 µA bei ChR1 D195C und bis zu 50 µA bei ChR2 D156C konnten f{\"u}r diese die h{\"o}chsten Photostr{\"o}me aller bisher charakterisierten ChR1 bzw. ChR2 Varianten nachgewiesen werden. Durch fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung konnte f{\"u}r alle im Rahmen dieser Arbeit erstellten ChR1 und ChR2 Mutanten eine erh{\"o}hte Proteinmenge sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit zus{\"a}tzlichen all trans Retinals w{\"a}hrend der Inkubation nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensit{\"a}ten korrelierten hierbei mit der H{\"o}he der Stromamplituden und erreichten ein Maximum bei ChR2 D156C. Biochemische Experimente mit der Gesamtmembranfraktion von ChR2 exprimierenden Oozyten lieferten Hinweise auf eine dimere Quart{\"a}rstruktur von Channelrhodopsinen, was durch die Kristallstruktur einer Chim{\"a}re aus ChR1 und ChR2 von (Kato et al., 2012) best{\"a}tigt wurde. Unter der Annahme, dass die Poren in den Proteomeren gebildet werden, konnte eine gegenseitige Beeinflussung der Regionen in heterodimeren Kan{\"a}len aus ChR2 Wildtyp und Mutanten aufgrund kinetischer Unterschiede bei kurzer und langer Belichtung oder der Verwendung von unterschiedlichen Lichtintensit{\"a}ten nachgewiesen werden. Eine Voraussetzung f{\"u}r diesen Effekt ist eine synchrone Anregung beider Untereinheiten. Die Interaktion von Channelrhodopsin Untereinheiten konnte in vivo mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass die Wechselwirkung nicht nur auf identische Untereinheiten in Homodimeren beschr{\"a}nkt ist, sondern auch bei Heterodimeren aus verschiedenen ChR2 Untereinheiten und sogar zwischen ChR2 und ChR1 m{\"o}glich ist.},
  subject      = {Ionenkanal},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hansjakob2012,
  author    = {Hansjakob, Anton},
  title     = {The role of cuticular waxes in the prepenetration processes of Blumeria graminis f.sp. hordei},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72840},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Der obligat biotrophe Pilz Blumeria graminis f.sp. hordei gilt als Erreger des Gerstenmehltaus, einer destruktiven Erkrankung der Gerste (Hordeum vulgare). Als Folge des Befalls mit B. graminis f.sp. hordei drohen erhebliche Ernteeinbußen. Das kutikul{\"a}re Wachs von Gerstenbl{\"a}ttern besteht haupts{\"a}chlich aus prim{\"a}ren Alkoholen (80\%), Alkylestern (10\%) sowie aus geringf{\"u}gig vorkommenden Bestandteilen wie Fetts{\"a}uren (2\%), Alkanen (2\%) und Aldehyden (1\%). Der initiale Kontakt der asexuellen und durch die Luft verbreiteten Konidien findet auf der Blattoberfl{\"a}che in einer Umgebung statt, die von den kutikul{\"a}ren Wachsen bestimmt ist, welche Keimung und Differenzierung stimulieren. W{\"a}hrend der Keimungs- und Differenzierungsphase durchlaufen die Konidien eine sequenzielle Morphogenese, die so genannten Pr{\"a}penetrationsprozesse. Dabei bilden die Konidien auf der Pflanzenoberfl{\"a}che zun{\"a}chst einen prim{\"a}ren, kurzen und im weiteren Verlauf einen sekund{\"a}ren, elongierten Keimschlauch aus. Im Anschluss daran schwillt dieser an und wird letztlich zu einem septierten Appressorium differenziert. Mit Hilfe des Appressoriums dringt der Pilz dann in die Epidermiszelle der Wirtspflanze ein und bildet ein initiales Haustorium, das die Ern{\"a}hrung des Pilzes sicherstellt. Um den Einfluss von einzelnen Wachsbestandteilen der Wirtspflanze auf die Pr{\"a}penetrationsprozesse systematisch zu untersuchen wurde ein neues in vitro System auf der Basis von Formvar®-Harz etabliert. Dieses System erm{\"o}glicht die Erzeugung homogener Oberfl{\"a}chen als Substrate f{\"u}r den Pilz, bei denen sowohl die aufgelagerten Mengen als auch die Oberfl{\"a}chenhydrophobizit{\"a}t unabh{\"a}ngig von den getesteten Substanzklassen und Kettenl{\"a}ngen der Molek{\"u}le hochgradig reproduzierbar sind. In diesem System haben langkettige Aldehyde die Keimung und die Differenzierung von B. graminis f.sp. hordei Konidien am wirksamsten induziert, wobei die Raten der Appressorienbildung in Abh{\"a}ngigkeit von der Konzentration und der Kettenl{\"a}nge im Vergleich zu n-Hexacosanal (C26), das sich als am effektivsten zeigte, abnahmen (C22<<C24<C26>C28>>C30). Die getesteten gerad- und ungeradzahligen Alkane (C24-C33), Fetts{\"a}uren (C20-C28), Alkylester (C40-C44) und prim{\"a}ren Alkohole (C20-C30) hatten keinen signifikanten Einfluss auf die Keimung und die Appressorienbildung des Pilzes. Der prim{\"a}re Alkohol n-Hexacosanol (C26) stellte hierbei eine Ausnahme dar, da er die Keimung und die Bildung des Appressorium-Keimschlauchs signifikant erh{\"o}hte. Um die Rolle von langkettigen Aldehyden auf einer intakten Pflanzenoberfl{\"a}che in vivo genauer zu untersuchen wurden B. graminis f.sp. hordei Konidien auf Bl{\"a}tter von glossy11 Mutanten der Nicht-Wirtspflanze Mais (Zea mays) inokuliert. Anders als der Wildtyp weisen glossy11 Bl{\"a}tter keine langkettigen Aldehyde auf. Auf glossy11 Bl{\"a}ttern keimten 60\% der B. graminis f.sp. hordei Konidien nicht und nur 10\% der Konidien entwickelten ein reifes Appressorium, was einer dreimal geringeren Rate als auf Wildtyp-Bl{\"a}ttern entspricht. Durch das Bespr{\"u}hen von glossy11 Bl{\"a}tter mit synthetischem n-Hexacosanal oder mit Wachs des Wildtyps wurden die pilzlichen Pr{\"a}penetrationsprozesse wieder vollst{\"a}ndig durchlaufen. Wurden im Gegensatz dazu Bl{\"a}tter des Mais-Wildtyps mit nicht induzierenden n-Alkanen, prim{\"a}ren Alkoholen oder langkettigen Fetts{\"a}uren bespr{\"u}ht, konnte das den Aldehyd-defizienten Ph{\"a}notyp von glossy11 imitieren. W{\"a}hrend der Pr{\"a}penetrationsprozesse wird ein Appressorium gebildet, wobei es sich hierbei um eine neu gebildete Zelle handelt. Die Keimung und die anschließende Morphogenese sind wichtige Schritte in der Etablierung der pilzlichen Infektionsstrukturen. Da diese Prozesse in einigen phytopathogenen Pilzen mit dem Zellzyklus gekoppelt sind wurde untersucht, inwieweit die Pr{\"a}penetrationsprozesse von B. graminis f.sp. hordei mit dem Verlauf des Zellzykluses synchronisiert sind. Hierf{\"u}r wurde eine Methode basierend auf DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) zur F{\"a}rbung der Zellkerne f{\"u}r fixierte Pr{\"a}parate von B. graminis f.sp. hordei Konidien entwickelt. Mittels eines pharmakologischen Ansatzes war es auf diese Weise erstmals m{\"o}glich die Abh{\"a}ngigkeit der Pr{\"a}penetrationsprozesse von der Mitose in vivo und in vitro zu verfolgen. Sechs Stunden nach der Inokulation trat nach Ausbildung des Appressorium-Keimschlauchs eine Mitose in der einkernigen Konidie auf. Die Hemmung der S-Phase mit Hydroxyharnstoff oder die Hemmung der M-Phase mit Benomyl verhinderten eine Bildung des Appressoriums, nicht aber die Entwicklung des Appressorium-Keimschlauchs. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mitose und eine abgeschlossene Zytokinese notwendige Voraussetzungen f{\"u}r die Appressoriumsbildung, jedoch nicht f{\"u}r die Morphogenese der Konidie, sind. Als Reaktion auf bestimmte Wachsbestandteile der Wirtspflanze werden pilzliche Gene, die w{\"a}hrend der Pr{\"a}penetrationsprozesse eine wichtige Rolle spielen k{\"o}nnen, differenziell exprimiert. Um solche Gene zu identifizieren wurden cDNA Klonbibliotheken mittels der suppression subtractive hybridization (SSH) 22 Minuten nach der Inokulation erstellt. Das auf Formvar®-Harz basierende in vitro System erm{\"o}glichte die selektive Anreicherung von cDNA Sequenzen aus B. graminis f.sp. hordei Konidien, die auf n-Hexacosanal beschichteten Oberfl{\"a}chen inokuliert wurden. Aus einer Reihe von Kandidaten wurde eine cDNA-Sequenz identifiziert, die sowohl auf Gerstenbl{\"a}ttern als auch auf mit n-Hexacosanal oder extrahiertem Gerstenwachs beschichteten Oberfl{\"a}chen hochreguliert war. Mittels 3' und 5' RACE wurde das n-Hexacosanal induzierte Transkript kloniert. Diese cDNA-Sequenz wies keine Homologien zu bekannten Genen, die Funktionen in der pilzlichen Entwicklung und der Ausbildung von Pathogenit{\"a}t in Pflanzen haben, auf.},
  subject      = {.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Huth2012,
  author    = {Huth, Antje [geb. Koppelkamm]},
  title     = {Studien zum mRNA profiling an humanem postmortalem Gewebe},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74308},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Frage, inwieweit quantitative Genexpressionsstudien an postmortalen humanen Proben mit erh{\"o}htem Postmortalintervall und somit m{\"o}glicherweise verminderter RNA-Integrit{\"a}t realisierbar sind und in Zukunft als zus{\"a}tzliches diagnostisches Werkzeug zur Determinierung der Todesursache im forensischen Kontext herangezogen werden k{\"o}nnen. Daf{\"u}r wurden in mehreren Teilstudien Faktoren untersucht, die die Verl{\"a}sslichkeit quantitativer Genexpressionsdaten beeinflussen k{\"o}nnen. Es konnte zun{\"a}chst f{\"u}r postmortales Skelettmuskelgewebe festgestellt werden, dass Verstorbene mit erh{\"o}htem BMI statistisch signifikant niedrigere RIN-Werte aufweisen als normalgewichtige Personen. Zudem wurde eine Korrelation zwischen dem Gewebetyp und der Integrit{\"a}t der daraus extrahierten RNA gefunden. Unter Anwendung der in dieser Arbeit gew{\"a}hlten Extraktionsmethode scheint postmortales Skelettmuskelgewebe f{\"u}r Genexpressionsstudien an Autopsiematerial besonders geeignet. Dagegen wurde im vorliegenden Probengut kein Zusammenhang zwischen verminderter RNA-Integrit{\"a}t und Parametern wie Geschlecht, PMI, Sterbealter, Dauer der Agonie und Todesursache gefunden. In einer weiteren Teilstudie wurde anhand von postmortalem Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Gehirngewebe aus einer Auswahl von zehn funktionell verschiedenen endogenen Kontrollgenen HMBS, UBC, SDHA und TBP als die Gene mit der gr{\"o}ßten postmortalen Transkriptstabilit{\"a}t identifiztiert. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Verwendung von vier stabilen endogenen Kontrollen am untersuchten Probenmaterial eine verl{\"a}ssliche Datennormalisierung erlaubt. Die validierten Kontrollgene k{\"o}nnen auch zuk{\"u}nftig f{\"u}r quantitative Genexpressionsstudien eingesetzt werden, solange die untersuchte Probenzusammensetzung der hier vorgestellten {\"a}hnelt. F{\"u}r die Todesursache sowie f{\"u}r den Body Mass Index des Probenspenders wurde in der vorliegenden Arbeit ein statistisch signifikanter Einfluss auf das Expressionslevel instabiler Gene festgestellt. Diese Parameter sind daher geeignet, die gefundenen Instabilit{\"a}ten m{\"o}glicher Kontrollgene zu erkl{\"a}ren. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit lassen des Weiteren darauf schließen, dass das Erstellen von Degradierungslinien aus kommerziell erh{\"a}ltlicher RNA f{\"u}r jedes verwendete qPCR-Assay ein wichtiges Instrument der Qualit{\"a}tspr{\"u}fung ist. Mit der Degradierungslinie kann die Detektionsgrenze des verwendeten qPCR-Assays validiert werden kann. Nur so ist die Festlegung des Bereichs m{\"o}glich, in dem ein ver{\"a}ndertes Expressionslevel tats{\"a}chlich mit dem Einfluss eines spezifischen Parameters in Verbindung gebracht werden kann und klar von einer nur scheinbaren Genexpressions{\"a}nderung unterscheidbar ist, die durch eine Degradierung der Probe vorget{\"a}uscht wird. Zudem scheint es praktikabel, in zuk{\"u}nftigen Studien nur Proben mit {\"a}hnlichen Integrit{\"a}ten miteinander zu vergleichen. Pathologische Prozesse im menschlichen K{\"o}rper, auch solche, die die Funktion von Organen sowie die Morphologie betreffen, sind hoch komplex und k{\"o}nnen interindividuell variieren, weshalb die Genexpression im forensischen Kontext erg{\"a}nzende Hinweise auf die Diagnose liefern k{\"o}nnte. Als erstes anwendungsbezogenes Beispiel wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss von Hypoxie auf das Transkriptlevel von HIF-1α, VEGF und SLC2A1 untersucht. Bei Normalisierung der Daten gegen vier stabile Kontrollgene ergaben sich anhand der untersuchten Gewebeproben Hinweise auf eine todesursachenbezogene Hochregulierung der drei Zielgene. Die Studie unterstrich die besondere Bedeutung der gew{\"a}hlten Normalisierungsstrategie. Wurden die Daten nur gegen GAPDH als einzelnes, nicht validiertes Kontrollgen normalisiert, deuteten die Ergebnisse eine {\"u}berraschende Herunterregulierung der Zielgene an. Als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r diese scheinbare Diskrepanz kommt die im weiteren Verlauf dieser Studie nachgewiesene Instabilit{\"a}t infolge einer Co-Regulation von GAPDH unter hypoxischen Bedingungen in Betracht. Mit dem Fernziel postmortale Genexpressionsstudien als zus{\"a}tzliches Instrument in der forensischen Todesursachenbestimmung einzusetzen, schafft die vorliegende Arbeit durch die Einf{\"u}hrung von validierten Kontrollgenen sowie durch die Analyse weiterer Einfluss nehmender Faktoren eine Basis f{\"u}r die verl{\"a}ssliche Durchf{\"u}hrung k{\"u}nftiger Genexpressionsstudien an humanem Autopsiegewebe.},
  subject      = {Genexpression},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Krause2012,
  author    = {Krause, Diana},
  title     = {Transport der Hauptosmotika an der vakuol{\"a}ren Membran von Schließzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75043},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bez{\"u}glich des Transport-prozesses vakuol{\"a}rer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-str{\"o}me an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpstr{\"o}me konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollst{\"a}ndig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivit{\"a}t auf. Die vakuol{\"a}re Pyrophosphatase-Aktivit{\"a}t der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpstr{\"o}me der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine h{\"o}here Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuol{\"a}ren Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps n{\"a}her untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. {\"U}berdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgef{\"u}hrt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 \% der AtSUC4-{\"U}E unter inversen pH-Gradienten w{\"a}hrend Saccharose-Applikation Str{\"o}me, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen L{\"o}sungsbedingungen ausschließlich Str{\"o}me detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universit{\"a}t Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose {\"u}bernimmt. 4. Dar{\"u}ber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabh{\"a}ngigen „slow-vacuolar-channel" (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgef{\"u}hrt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivit{\"a}t stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erh{\"o}ht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinit{\"a}t bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivit{\"a}t bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ans{\"a}uern des vakuol{\"a}ren Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitf{\"a}higkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgef{\"u}hrten Messungen konnte eine regulatorische, vakuol{\"a}r gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einw{\"a}rtsgerichteten Kationenstrom erm{\"o}glicht. 5. Ferner wurden SV-Kan{\"a}le von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kan{\"a}len verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erh{\"o}hten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine h{\"o}here Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einw{\"a}rtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kan{\"a}le um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgepr{\"a}gtem K+-Einstrom f{\"u}hrt. Dar{\"u}ber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine h{\"o}here Permeabilit{\"a}t von Na+- gegen{\"u}ber K+-Ionen (1,3:1) auf. W{\"a}hrend Schließzell- und Mesophyll-SV-Kan{\"a}le eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivit{\"a}t aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kan{\"a}le eine h{\"o}here cytosoli-sche Ca2+- und vakuol{\"a}re pH-Sensitivit{\"a}t auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Maierhofer2012,
  author    = {Maierhofer, Tobias},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von SLAC1-homologen Anionenkan{\"a}len aus Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85406},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {S-Typ (slow)-Anionenkan{\"a}le vermitteln in Schließzellen den Efflux von Chlorid und Nitrat, welcher letztendlich zum Schließen der Stomata, z.B. als Antwort auf Trockenstress, f{\"u}hrt. Dabei kommt dem Phytohormon Abscisins{\"a}ure (ABA) eine zentrale Rolle zu. Es wird als Antwort auf Trockenheit synthetisiert und vermittelt {\"u}ber eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von S-typ Anionenkan{\"a}len. SLAC1 war die erste Komponente eines S-Typ-Anionenkanals, die in Schließzellen identifiziert wurde. Durch die Expression in Xenopus Oozyten, konnte SLAC1 als S-Typ-Anionenkanal funktionell charakterisiert werden und seine Regulation {\"u}ber Kinasen (OST1, CPK21/23) und Phosphatasen (ABI1, ABI2) beschrieben werden. Mit diesen Untersuchungen gelang ein entscheidender Durchbruch bei der Entschl{\"u}sselung von Netzwerken, welche den Anionentransport in Schließzellen als Antwort auf Trockenstress regulieren. Im Laufe dieser Arbeit konnte in Schließzellen von Arabidopsis auch die Expression des SLAC1 Homolog 3 (SLAH3) nachgewiesen werden. Die Koexpression von SLAH3 mit der Ca2+-abh{\"a}ngigen Proteinkinase CPK21 in Xenopus Oozyten f{\"u}hrte zu Nitrat-induzierten Anionenstr{\"o}men. Dabei wurde die Aktivit{\"a}t dieses S-Typ-Anionenkanals, sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch Kalzium und Nitrat gesteuert. {\"A}hnlich wie bei der Regulation von SLAC1 konnte die Aktivit{\"a}t von SLAH3 durch die Proteinphosphatase ABI1, aus der Familie der PP2Cs, blockiert werden. Diese Eigenschaft von ABI1 passt sehr gut zur bekannten Rolle dieser Phosphatase in Schließzellen: ABI1 ist ein negativer Regulator der ABA-Signalkaskade und wird durch ABA inhibiert. Unsere biophysikalischen Analysen f{\"u}hrten schließlich zur Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges. Die Bindung von ABA an den Komplex aus ABA-Rezeptor (RCAR/PYL/PYR) und ABI1 bewirkt die Inaktivierung von ABI1 und somit die Aktivierung von CPK21. F{\"u}r deren volle Aktivit{\"a}t ist eine ABA-abh{\"a}ngige Erh{\"o}hung der zytosolischen Ca2+-Konzentration notwendig. Die aktivierte Kinase CPK21 ist schließlich in der Lage, den Anionenkanal SLAH3 zu phosphorylieren und in der Anwesenheit von Nitrat zu aktivieren. Somit liefert die Identifizierung und Charakterisierung von SLAH3, als den Nitrat-, Kalzium- und ABA-sensitiven Anionenkanal in Schließzellen, Einblicke in die Beziehung zwischen der Reaktion dieses Zelltyps auf Trockenstress, der Funktion von Nitrat als Signalmolek{\"u}l und dem Nitratmetabolismus. F{\"u}r die meisten h{\"o}heren Pflanzen stellt Nitrat die wichtigste Stickstoffquelle dar. Die Nitrataufnahme {\"u}ber die Wurzel repr{\"a}sentiert daher den entscheidenden Schritt f{\"u}r den Stickstoff-Metabolismus. Ausgehend von den Zellen des Wurzelkortex muss das Nitrat f{\"u}r den Langstreckentransport in die oberen Pflanzenorgane, in die Xylemgef{\"a}ße der Stele eingebracht werden. Die Identifikation von Proteinen und Genen, die f{\"u}r den Nitrattransport verantwortlich sind, ist f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Nitrataufnahme und -verteilung in der Pflanze eine Grundvoraussetzung. Dabei scheinen Protonen-gekoppelte Transporter der NRT1-, bzw. NRT2-Klasse, die Verschiebung von Nitrat aus dem Boden in die Wurzeln zu bewerkstelligen. Aus der Endodermis, bzw. den Xylem-Parenchymzellen muss Nitrat anschließend in das extrazellul{\"a}re Medium der Xylemgef{\"a}ße freigegeben werden, um {\"u}ber den Transpirationssog in den Spross zu gelangen. Auch am Transport dieses Anions in das Xylem ist mit NRT1.5 ein Nitrattransporter der NRT1-Klasse beteiligt, jedoch ergaben Experimente an NRT1.5-Verlustmutanten, dass weitere Transportmechanismen f{\"u}r den Efflux von Nitrat in das Xylem existieren m{\"u}ssen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das SLAC1-Homolog 2 (SLAH2) funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert werden. Mit Hilfe der BIFC-Methode wurde gezeigt, dass dabei die Interaktion mit der Ca2+-abh{\"a}ngigen Proteinkinase CPK21 essentiell ist. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichten, dass SLAH2 einen Nitrat-selektiven S-Typ-Anionenkanal repr{\"a}sentiert, dessen Aktivit{\"a}t gleichzeitig durch die Anwesenheit eben dieses Anions im externen Medium reguliert wird. Durch die Promoter:GUS-Technik gelang es, die Lokalisation von SLAH2 exklusiv in den Zellen der Wurzelstele von Arabidopsis nachzuweisen. Aufgrund des stark negativen Membranpotentials pflanzlicher Zellen und der vorliegenden Anionengradienten, d{\"u}rften Anionenkan{\"a}le in erster Linie den Ausstrom von Anionen vermitteln. Da in Nitrat-Aufnahme-Experimenten an SLAH2-Verlustmutanten, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, ein geringerer Nitratgehalt im Spross, dagegen eine h{\"o}here Konzentration dieses Anions in den Wurzeln zu detektieren war, scheint der S-Typ-Anionenkanal SLAH2 am Transport von Nitrat aus den Wurzeln in die Bl{\"a}tter beteiligt zu sein. Dabei k{\"o}nnte er entweder direkt an der Beladung des Xylems mit Nitrat mitwirken, oder diese durch seine potentielle Funktion als Nitratsensor regulieren.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Scherzer2012,
  author    = {Scherzer, S{\"o}nke},
  title     = {Biophysikalische Analyse und Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges aus Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76199},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {In dieser Arbeit sollte zun{\"a}chst die Frage gekl{\"a}rt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abh{\"a}ngigkeit der Anionenstr{\"o}me in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abh{\"a}ngigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenstr{\"o}me detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die gr{\"o}ßte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gest{\"u}tzt, da OST1 und CPK23 die st{\"a}rkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Str{\"o}me im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabh{\"a}ngigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abh{\"a}ngigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abh{\"a}ngigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinit{\"a}ten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abh{\"a}ngigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom {\"u}ber das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abh{\"a}ngigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration f{\"u}hrt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, ben{\"o}tigen diese einen {\"u}bergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung f{\"u}hrt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivit{\"a}t durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abh{\"a}ngigen Kinasen CPK3 und 21 ben{\"o}tigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen f{\"u}hrt zur Depolarisation der Membran woraufhin der ausw{\"a}rtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entl{\"a}sst. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schulz2012,
  author    = {Schulz, Alexander},
  title     = {Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport {\"u}ber die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierf{\"u}r wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkr{\"a}fte des vakuol{\"a}ren Zuckertransportes erm{\"o}glichten. Zus{\"a}tzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgew{\"a}hlten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgef{\"u}hrt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuol{\"a}re glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazit{\"a}ten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgel{\"o}st werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus f{\"u}r beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinit{\"a}t und hohe Transportkapazit{\"a}t f{\"u}r den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkr{\"a}fte der Zuckertransportaktivit{\"a}t herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abh{\"a}ngigen H+-Pumpaktivit{\"a}t auf die pH-Hom{\"o}ostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant f{\"u}r die Zuckertransporter zu fungieren. Dar{\"u}ber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole n{\"a}her charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich f{\"u}r den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter {\"U}berexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgel{\"o}st und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bez{\"u}glich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaefer2012,
  author    = {Sch{\"a}fer, Barbara},
  title     = {Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivit{\"a}t und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71469},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energietr{\"a}ger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden {\"U}berblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielf{\"a}ltige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ver{\"a}nderungen in der Aktivit{\"a}t durch verschiedene Einfl{\"u}sse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorg{\"a}ngen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem D{\"u}nndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkst{\"a}rke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr {\"a}hnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivit{\"a}t. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol f{\"u}hrt teilweise zu einer erh{\"o}hten Invertaseaktivit{\"a}t und Calystegin B2 verf{\"u}gt nur {\"u}ber ein beschr{\"a}nktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivit{\"a}t. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegen{\"u}ber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. F{\"u}r die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgef{\"u}hrt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten k{\"o}nnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde gr{\"o}ßtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.},
  subject      = {Invertase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Stangl2012,
  author    = {Stangl, Christoph},
  title     = {Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unver{\"o}ffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz {\"u}ber das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einw{\"a}rts-Str{\"o}me gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei ann{\"a}hernd unabh{\"a}ngig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in h{\"o}heren Pflanzen gezeigt werden. Nach Best{\"a}tigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zus{\"a}tzlich und unter der Kontrolle eines {\"o}strogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der M{\"o}glichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums {\"u}ber Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind ph{\"a}notypische Auff{\"a}lligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verz{\"o}gerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verz{\"o}gerte Keimung normal und uneingeschr{\"a}nkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschl{\"a}uche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unver{\"a}ndertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ans{\"a}tzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des {\"o}strogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. {\"U}ber den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsf{\"a}higes Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt.},
  subject      = {Calciumion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wehner2012,
  author    = {Wehner, Nora},
  title     = {Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene f{\"u}r TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufkl{\"a}rung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen f{\"u}r Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen f{\"u}r Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als n{\"u}tzliche Ressourcen f{\"u}r genetische Analysen zur Verf{\"u}gung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden k{\"o}nnen. Ein Mikrotiterplatten-System f{\"u}r Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann {\"u}ber die Luciferaseaktivit{\"a}t bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalit{\"a}t des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie {\"u}berpr{\"u}ft, wobei bekannte Bindungsspezifit{\"a}ten der TF best{\"a}tigt werden konnten. F{\"u}r das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen f{\"u}r Screening-Ans{\"a}tze zur Verf{\"u}gung. F{\"u}r das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Dar{\"u}ber hinaus wurde gezeigt, dass es m{\"o}glich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolek{\"u}len (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ans{\"a}tzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein h{\"o}heres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekund{\"a}rmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zus{\"a}tzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-{\"U}berexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des daf{\"u}r entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue {\"U}berexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erh{\"o}hte Toleranz gegen{\"u}ber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zoeller2012,
  author    = {Zoeller, Maria Simone},
  title     = {Lipidperoxidation in der inkompatiblen Pseudomonas-Arabidopsis Interaktion: Biosynthese von Pimelin- und Azelains{\"a}ure},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71614},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die Biosynthese von fragmentierten Fetts{\"a}uren (kurzkettige Dicarbons{\"a}uren und deren Oxocarbons{\"a}ure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbons{\"a}uren sind Pimelins{\"a}ure (PIM) und Azelains{\"a}ure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanons{\"a}ure (OHA) und 9-Oxononanons{\"a}ure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzukl{\"a}ren, da Fetts{\"a}ure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgekl{\"a}rt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivit{\"a}t von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegen{\"u}ber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fetts{\"a}urefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fetts{\"a}urehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abl{\"a}uft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fetts{\"a}uren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzukl{\"a}ren. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fetts{\"a}uren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fetts{\"a}urefragmenten experimentell {\"u}berpr{\"u}ft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fetts{\"a}urefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach unges{\"a}ttigten Fetts{\"a}uren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fetts{\"a}urefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fetts{\"a}urefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in {\"U}bereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In gr{\"u}nen Pflanzenteilen verl{\"a}uft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool" von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fetts{\"a}ureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool" von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erh{\"o}ht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fetts{\"a}urehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt k{\"o}nnen die in Galactolipiden veresterten Oxocarbons{\"a}uren zu Dicarbons{\"a}uren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorl{\"a}ufer der Fetts{\"a}urefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfetts{\"a}uren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abh{\"a}ngiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-\%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfetts{\"a}urespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-\%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfetts{\"a}uren in den Galactolipiden {\"a}ndert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-\%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fetts{\"a}uren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen.},
  subject      = {Schmalwand},
  language  = {de}
}