@article{TaflerHerbertSchmidtetal.1993, author = {Tafler, R. and Herbert, M. K. and Schmidt, R. F. and Weis, K. H.}, title = {Small reduction of capsaicin-induced neurogenic inflammation in human forearm skin by the glucocorticoid prednicarbate}, series = {Agents Actions}, volume = {38}, journal = {Agents Actions}, number = {Special Conference Issue}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127698}, pages = {C31-34}, year = {1993}, abstract = {No abstract available.}, language = {en} } @article{HerbertTaflerSchmidtetal.1993, author = {Herbert, M. K. and Tafler, R. and Schmidt, R. F. and Weis, K. H.}, title = {Cyclooxygenase inhibitors acetylsalicylic acid and indomethacin do not affect capsaicin-induced neurogenic inflammation in human skin}, series = {Agents Actions}, volume = {38}, journal = {Agents Actions}, number = {Special Conference Issue}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-127666}, pages = {C25-27}, year = {1993}, abstract = {Neurogenic inflammation is evoked by neuropeptides released from primary afferent terminals and, presumably, by other secondarily released inflammatory mediators. This study examines whether prostaglandins might participate in the development of neurogenic inflammation in humans and whether cyclooxygenase inhibitors have any anti-inflammatory effect on this type of inflammation. In healthy volunteers, neurogenic inflammation was elicited by epicutaneously applied capsaicin (1 \%), after systemic pretreatment with acetylsalicylic acid, or topically applied indomethacin compared to pretreatment with saline or vehicle, respectively. The extent of neurogenic inflammation was quantified by planimetry of visible flare size and recording the increase of superficial cutaneous blood flow (SCBF) with a laser Doppler flowmeter. Capsaicin-induced flare sizes and outside SCBF (both representing neurogenically evoked inflammation) were unaffected by acetylsalicylic acid or indomethacin. Only the capsaicin-induced increase; of inside SCBF was attenuated by local pretreatment with indomethacin, reflecting the participation of prostaglandins in the inflammatory response of those areas which were in direct contact with capsaicin.}, language = {en} } @phdthesis{Weinhold2001, author = {Weinhold, Dietmar Thomas}, title = {Transfektion migrierender Nierenepithelzellen mit dem Kalium-Kanal ROMK2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-339}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkan{\"a}len und Transportproteinen ist f{\"u}r die normale Epithelfunktion unerl{\"a}sslich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellk{\"o}rper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkan{\"a}le und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- gef{\"u}hrt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kan{\"a}len in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kan{\"a}len die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es f{\"u}r 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazellul{\"a}re Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt.}, subject = {Zellmigration}, language = {de} } @phdthesis{Neumann2001, author = {Neumann, Arne}, title = {Aktivierung phagozytierender Zellen durch "Advanced Glycation Endproducts" und beta-Amyloid-Implikationen f{\"u}r die Pathogenese der Alzheimer'schen Demenz}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1796}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Typisch f{\"u}r die Alzheimer' schen Erkrankung ist die Bildung unl{\"o}slicher Ablagerungen im Gehirn, sogenannter "seniler Plaques". Diese Plaques bestehen im Wesentlichen aus fibrill{\"a}rem beta-Amyloid, das durch Glykierungen ver{\"a}ndert vorliegen kann. Außerdem beinhalten die Plaques, sogenannte AGEs "Advanced Glycation Endproducts", die aus nichtenzymatisch glykierten Proteinen entstehen. Diese AGE-modifizierten Proteine sowie das fibrill{\"a}re beta-Amyloid sind in der Lage Mikrogliazellen zu aktivieren. Die sessilen Gehirnmakrophagen wirken in aktiviertem Zustand neurotoxisch, wobei es verschiedene Hypothesen gibt, wie die Mikrogliazellen zu dem neuronalen Zelltod f{\"u}hren. Um dieses zu untersuchen wurden murine Mikrogliazellen herangezogen, die als Merkmal ihrer Aktivierung auf die Translokation des Transkriptionsfaktors NF-kappa-B in den Zellkern {\"u}berpr{\"u}ft wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden die Rahmenbedingungen n{\"a}her untersucht, die zu der AGE vermittelten Mikrogliaaktivierung f{\"u}hren. Es wurde in vitro gezeigt, daß die Mikrogliaaktivierung zun{\"a}chst durch eine hochmolekulare Hyalurons{\"a}ure, wie sie nativ in der extrazellul{\"a}ren Matrix vorliegt, verhindert wird. Im Gegensatz dazu konnte NF-kappa-B in Mikrogliazellen aktiviert werden, die in Gegenwart von Hyalurons{\"a}urefragmenten mit AGE behandelt wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde festgestellt, daß die Mikrogliaaktivierbarkeit umgekehrt proportional zu der durchschnittlichen Hyalurons{\"a}uremolek{\"u}lgr{\"o}ße ist. Andere Glykosaminoglykane aus der extrazellul{\"a}ren Matrix, wie D-Glukurons{\"a}ure, N-Azetylglukosamin oder Chondroitin-4-sulfat reduzierten die Aktivierbarkeit der Mikrogliazellen nur geringf{\"u}gig. Sowohl beta-Amyloid, als auch AGEs setzen w{\"a}hrend ihres Entstehungsprozesses reaktive Sauerstoffspezies frei, die Hyalurons{\"a}ure in kleinere Bruchst{\"u}cke zerschneiden k{\"o}nnen. Die Signaltransduktion der AGE-aktivierten Mikrogliazellen wurde mittels unterschiedlicher Inhibitoren gehemmt und die Auswirkung auf die NF-kappa-B Aktivierung untersucht. Hier zeigte sich ein komplexes Netzwerk an aktivierten Signalwegen, so daß kein R{\"u}ckschluß auf einen bestimmten Rezeptor m{\"o}glich war. Daher wurde ein "in vitro Modell" entwickelt, um die ausschlaggebende neurotoxischen Komponenten der Mikrogliareaktion aufzufinden. Darin wurden die Signalkaskaden der aktivierten Mikroglia erneut durch pharmakologische Inhibierung unterbrochen, das zellfreie Medium das von diesen Mikrogliazellen sezerniert wurde, wurde als "konditioniertes Medium" f{\"u}r die Kultur muriner Neuronen eingesetzt. Diese wurden bez{\"u}glich ihrer {\"U}berlebensrate in diesem konditionierten Medium untersucht. Die Hemmung der Transkription oder der Translation in den Mikrogliazellen zeigte keine Reduktion der neurotoxischen Wirkung des konditionierten Mediums. Ebensowenig wirkten Inhibitoren der mitochondrialen Atmungskette, der Radikalquellen Xanthin Oxidase, Lipoxygenase oder Cyclooxygenase. Die Hemmung der NADPH Oxidase reduzierte die Neurotoxizit{\"a}t des konditionierten Mediums auf etwa 30 Prozent. Die NADPH Oxidase ist ein Enzymkomplex, der im Rahmen des "oxidativen bursts" große Mengen Superoxidanionen freisetzt. Um die Bedeutung der NADPH Oxidase Aktivierung f{\"u}r die neurotoxische Wirkung nachzuweisen, wurde eine Untereinheit der NADPH Oxidase, das membranst{\"a}ndige gp91phox in den Mikrogliazellen deaktiviert. Dies f{\"u}hrte dazu, daß diese Zellen kein Superoxid auf die Stimulation mit beta-Amyloid oder AGE hin abgaben, im Gegensatz zu den Mikrogliazellen mit funktioneller NADPH Oxidase. Das konditionierte Medium der NADPH Oxidase defizienten Zellen war nicht mehr neurotoxisch. Die freien Sauerstoffradikale die aufgrund der NADPH Oxidase Aktivierung entstehen, k{\"o}nnen zu einer NF-kappa-B Aktivierung f{\"u}hren. NF-kappa-B wurde erfolgreich in den Mikroglia durch exogenes Wasserstoffperoxid stimuliert, wobei aber keine neurotoxische Wirkung im Modellsystem festgestellt wurde. NF-kappa-B scheint damit nicht f{\"u}r die mikrogliavermittelte Neurotoxizit{\"a}t verantwortlich zu sein, im Gegensatz zu der NADPH Oxidase, deren Aktivit{\"a}t unmittelbar mit der Neurotoxizit{\"a}t korreliert ist.}, subject = {Alzheimer-Krankheit}, language = {de} } @phdthesis{Ebinger2002, author = {Ebinger, Martin}, title = {Histologie und Funktion der Kniegelenksinnervation der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-3745}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Kniegelenksinnervation von 6 M{\"a}usen wurde elektronenmikroskopisch untersucht. Der Mediale Artikul{\"a}re Nerv (MAN) enthielt durchschnittlich 75 Nervenfasern, 63 unmyelinisierte und 12 myelinisierte (Durchmesser 1 bis 8 µm, Maximum zwischen 2 und 5 µm). Der Posteriore Artikul{\"a}re Nerv (PAN) bestand durchschnittlich aus 195 Nervenfasern, 129 unmyelinisierte und 66 myelinisierte (Durchmesser zwischen 1 und 12 µm, Maximum bei 4 bis 5 µm). Diese Daten sprechen f{\"u}r eine weitgehende histologische Vergleichbarkeit der Kniegelenksinnervation bei Maus, Ratte und Katze. Lediglich die Anzahl der Nervenfasern ist bei der im Verh{\"a}ltnis kleineren Maus geringer. Spinalganglienzellen von 10 M{\"a}usen wurden mittels hypoosmolarer L{\"o}sung gedehnt. Schwankungen der intrazellul{\"a}ren Kalzium-Konzentrationen und elektrophysiologische Ver{\"a}nderungen wurden dabei registriert (Calcium-Imaging und Patch-Clamp). Die prim{\"a}r sensorischen Neuronen, die nicht an der Kniegelenksinnervation beteiligt waren, konnten in schnell, langsam und nicht reagierende Subpopulationen unterteilt werden. Die Beobachtungen an den retrograd markierten Kniegelnksafferenzen erlaubten eine solche Differenzierung nicht. Die Reizung mit Capsaicin zeigte, dass es sich bei den mechanosensitiven Kniegelenksafferenzen selten um polymodale Nozizeptoren handelte.}, language = {de} } @phdthesis{Islinger2002, author = {Islinger, Florian}, title = {Untersuchungen zum Wirkmechanismus des klinisch angewandten Schwermetallchelators 2,3-Dimercapto-1-Propansulfons{\"a}ure (DMPS)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6358}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die Niere stellt das wichtigste Zielorgan f{\"u}r die Akkumulation von anorganischem Quecksilber dar. Versuche an Ratten ergaben, dass bereits wenige Stunden nach Injektion einer geringen Menge Quecksilberchlorid 50\% dieser Dosis in den Nieren akkumuliert war. Durch verschiedene Untersuchungen wurden die proximale Tubuli (Pars convoluta et recta) als Ort der Quecksilber-Anreicherung identifiziert. Der Schwermetallchelator DMPS (2,3-Dimercapto-1-Propansulfons{\"a}ure) ist heutzutage das Mittel der Wahl f{\"u}r die Behandlung von Vergiftungen mit anorganischem Quecksilber. DMPS hat sich gegen{\"u}ber dem fr{\"u}her verwendeten BAL aus mehreren Gr{\"u}nden als {\"u}berlegen erwiesen: in klinischen Tests bez{\"u}glich der Quecksilberentgiftung zeigt DMPS die gr{\"o}ßere Wirksamkeit, kann oral angewendet werden und ist zudem weitaus weniger toxisch als sein Vorg{\"a}nger BAL. Jedoch war der Wirkmechanismus von DMPS nicht genau bekannt. Allerdings existieren zahlreiche in-vivo- und in-vitro-Studien, die zeigen, dass das organische Anion DMPS ein Substrat des „klassischen Organische-Anionen-Transportsystems" bzw. des 1997 klonierten, terti{\"a}r aktiven Anionenaustauschers OAT1 sein k{\"o}nnte. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine direkte Interaktion zwischen DMPS und OAT1 stattfindet und DMPS ein Substrat von OAT1 ist. Von entscheidendem Interesse war dabei die Frage, ob der Redoxzustand von DMPS (reduziert-monomer, oxidiert-dimer) einen Einfluß auf einen m{\"o}glichen Transport durch OAT1 hat. Dar{\"u}ber hinaus sollte die Rolle von Albumin, welches unter physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf des Menschen in hoher Konzentration vorhanden ist, bei diesem Vorgang gekl{\"a}rt werden. In einem zweiten Teil lag das Interesse auf den Mechanismen, die DMPS und v.a. den intrazellul{\"a}r gebildeten Quecksilber-DMPS-Komplex (Hg-DMPS-Chelat) aus der Tubuluszelle sezernieren und damit aus dem Organismus eliminieren. Dabei sollte insbesondere die Rolle des apikal lokalisierten, passiven Transporters OAT-K2 („kidney-specific" Organische-Anionen-Transporter 2) gekl{\"a}rt werden. Die Untersuchung der Transportvorg{\"a}nge an hOAT1 (menschliches Ortholog von OAT1) und OAT-K2 wurden an Xenopus laevis Ooztyen, HeLa-Zellen sowie OK-Zellen durchgef{\"u}hrt Das organische Anion DMPS war sowohl in reduzierter als auch in oxidierter Form in der Lage, den Transport von PAH kompetitiv zu hemmen: Ki (reduziertes DMPS) = 22.4 mM bzw. Ki (oxidiertes DMPS) = 66.0 mM DMPS-{\"A}quivalente. Bei Anwesenheit von 0.1mM Albumin erlosch die Hemmung des PAH-Transports durch reduziertes und oxidiertes DMPS vollst{\"a}ndig. Albumin alleine hatte hingegen keinen Einfluß auf den PAH-Transport durch hOAT1. Die Transstimulations-Experimente an hOAT1-transfizierten HeLa-Zellen zeigten, dass reduziertes und oxidiertes DMPS den Efflux von PAH stimulieren konnten: innerhalb von drei Minuten wurden so 10 bzw. 8\% des PAH-Zellgehaltes aktiv {\"u}ber hOAT1 aus der Zelle sezerniert. Das Hg-DMPS-Chelat hatte im Gegensatz zu den beiden Einzelkomponenten Quecksilber und DMPS keinen hemmenden Einfluß auf den PAH-Transport in Oozyten. Damit hat der Komplex auch keine Affinit{\"a}t zu hOAT1, womit der basolaterale Weg f{\"u}r die Elimination des gebundenen Quecksilbers aus der Zelle keine Rolle spielt. Untersuchungen an OAT-K2 konnten aufgrund eines zu niedrigen Expressionsniveaus des Transporters in Oozyten und MDCK-Zellen nicht durchgef{\"u}hrt werden. OK-Zellen, die OAT1 aufgrund ihres Ursprungs aus dem proximalen Tubulus des Opossums endogen exprimieren, waren in der Lage, reduziertes DMPS transzellul{\"a}r zu sezernieren. Ein Teil dieses Transports konnte durch PAH inhibiert werden. Damit zeigte sich nicht nur, dass hOAT1 DMPS als Substrat f{\"u}r den Transport {\"u}ber die basolaterale Membran akzeptiert, sondern dar{\"u}ber hinaus auch, dass in der apikalen Membran der Tubuluszelle Transporter lokalisiert sind, die DMPS in das Tubuluslumen sezernieren k{\"o}nnen. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hOAT1 eine tragende Rolle im Wirkmechanismus des Quecksilberantidots DMPS spielt: hOAT1 ist entscheidend am Transport von DMPS an den Ort der Vergiftung, die proximale Tubuluszelle, beteiligt. Dabei spielt es keine Rolle, ob die reduzierte oder oxidierte Form am Transporter vorliegt, da beide nachweislich Substrate von hOAT1 sind. Von wesentlicher Bedeutung ist die lockere Bindung von DMPS an Albumin, die DMPS einerseits vor einer raschen glomerul{\"a}ren Filtration bewahrt, andererseits aber durch einfaches Abdiffundieren eine rasche Gleichgewichtseinstellung mit dem perivaskul{\"a}ren Intersitium der Niere und anschließenden Transport in die Tubuluszelle erlaubt. Das intrazellul{\"a}r gebildete Hg-DMPS-Chelat hat im Gegensatz zu DMPS keine Affinit{\"a}t zu hOAT1, wodurch eine R{\"u}ckkehr des mobilisierten Quecksilbers in den K{\"o}rperkreislauf auf diesem Weg verhindert wird.}, language = {de} } @phdthesis{Wendland2003, author = {Wendland, Jens Robert}, title = {{\"U}ber den Zusammenhang von Galaninexpression und Capsaicinempfindlichkeit in Spinalganglionneuronen von Ratten mit experimentellen Nervenverletzungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7036}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Die Plastizit{\"a}t von Nozizeptoren kann eine der Ursachen f{\"u}r neuropathische Schmerzen sein. In der vorliegenden Arbeit wurden Ver{\"a}nderungen der Capsaicinempfindlichkeit und der Galaninexpression in einzelnen Spinalganglionneuronen unter verschiedenen Bedingungen untersucht. Diese Eigenschaften wurden gew{\"a}hlt, weil beide nach experimentellen Nervenverletzungen starken Ver{\"a}nderungen unterliegen und weil beide {\"u}ber „nerve growth factor" reguliert werden. Neurone von Ratten mit experimenteller Axotomie oder „chronic constriction injury" des N. ischiadicus wurden mit entsprechenden Neuronen von unverletzten Ratten unter Kulturbedingungen verglichen. Der gleichzeitige Nachweis beider Eigenschaften erfolgte in isolierten Neuronen durch eine Doppelf{\"a}rbung, bei der die Capsaicinempfindlichkeit mittels Kobaltaufnahme und die Galaninexpression immunzytochemisch nachgewiesen wurden. Mit zunehmender Dauer einer Axotomie und mit zunehmender Dauer in Kultur sank der Anteil capsaicinempfindlicher Neurone. Gleichzeitig kam es zu einer starken Hochregulation von Galanin. Diese Effekte waren in vitro durch die Zugabe von „nerve growth factor" oder „glial cell line-derived neurotrophic factor" reversibel. Mit zunehmender Dauer einer „chronic constriction injury" hingegen ver{\"a}nderten sich diese Populationen nicht. Die Analyse doppeltgef{\"a}rbter Neurone ergab, daß nach einer Axotomie kein einziges Neuron gleichzeitig capsaicinempfindlich und galaninerg war. Unter bestimmten Kulturbedingungen sah man jedoch vereinzelt eine Doppelf{\"a}rbung. Die nach einer Axotomie de novo galaninergen Neurone hatten ein Gr{\"o}ßenverteilungsprofil, das demjenigen von unverletzten capsaicinempfindlichen Neuronen stark {\"a}hnelte. Aus der Literatur ist bekannt, daß die Hochregulation von Galanin das Vorhandensein capsaicinempfindlicher Neurone voraussetzt. In dieser Arbeit wird daher die Hypothese aufgestellt, daß die nach einer Axotomie galaninergen Neurone zuvor capsaicinempfindlich gewesen sein m{\"u}ssen. Dies impliziert, daß im einzelnen Neuron die Hochregulation von Galanin erst nach einer Herabregulation der Capsaicinempfindlichkeit geschieht. Ob diese Sequenz eine funktionelle Bedeutung hat, bedarf weiterer Untersuchungen. Es liegt nahe, daß Galanin als Markerpeptid gelten kann, mit dem in k{\"u}nftigen Untersuchungen neuropathischer Zust{\"a}nde der Nozizeption diejenigen Neurone identifiziert werden k{\"o}nnen, die zuvor im unverletzten Zustand capsaicinempfindliche Nozizeptoren waren.}, language = {de} } @phdthesis{Hinkes2003, author = {Hinkes, Bernward Gottfried}, title = {Einfluß des Ca2+-sensitiven Kaliumkanals hIK1 auf die Migration humaner neutrophiler Granulozyten auf Fibronektin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7454}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Die Migration neutrophiler Granulozyten aus dem Gef{\"a}ßsystem in das umgebende Gewebe stellt einen zentralen Schritt bei der Entstehung von akuten Entz{\"u}ndungsherden dar. Es ist bislang vergleichsweise wenig {\"u}ber die Rolle von Ionenkan{\"a}len und Carriermolek{\"u}len wie dem Ca2+-empfindlichen K+-Kanal hIK1 oder den Na+/H+- und Cl-/HCO3 --Austauschern bei der Wanderung von Neutrophilen bekannt. Nach heutigem Wissen ist die Funktion dieser Transportmolek{\"u}le neben zytoskelettalen Umbauvorg{\"a}ngen aber unter anderem in metastasierenden Melanomzellen, Fibroblasten oder auch sogenannten MDCK-F-Zellen f{\"u}r die Migration wichtig. Große {\"U}bereinstimmungen bekannter Migrationsmechanismen zwischen diesen Zelltypen und Neutrophilen, wie auch erste Versuche an Granulozyten legen eine Kanalfunktion auch bei ihnen nahe. In meiner Arbeit untersuchte ich, inwieweit ein Einfluss Ca2+-empfindlicher K+-Kan{\"a}le auf die Migration von humanen neutrophilen Granulozyten bei einer Migration auf dem Matrixprotein Fibronektin nachweisbar ist. Dazu wurden humane neutrophile Granulozyten mit dem Chemotaxin fMLP stimuliert und auf verschieden starken Fibronektinbeschichtungen zur Migration gebracht. Die Neutrophilen wurden dabei mit erw{\"a}rmter Ringerl{\"o}sung {\"u}berstr{\"o}mt, und ihre Migrationsgeschwindigkeit mittels Zeitraffer-Videomikroskopie und computergest{\"u}tzter Auswertung der Migrationstrajektorien bestimmt. Den Einfluss der hIK1-Kan{\"a}le auf die Migration beobachtete ich durch Kanalinhibition mittels Clotrimazol bzw. Kanalaktivierung mittels 1-EBIO. Es stellte sich heraus, dass die Migrationsgeschwindigkeit der neutrophilen Granulozyten stark von der Fibronektinbeschichtung abhing. Die Migrationsgeschwindigkeit hing biphasisch von der Fibronektinkonzentration ab und wies ein Maximum von 6 µm/min bei einer mittleren Beschichtungsst{\"a}rke von 100 µg/ml Fibronektin auf. Unter diesen Bedingungen wanderten die Neutrophilen in einer am{\"o}boiden Weise. Bei Hemmung der Kaliumkan{\"a}le mit Clotrimazol oder Aktivierung mit 1-EBIO zeigten alle Zellen unabh{\"a}ngig von ihrer Morphologie und Geschwindigkeit keine Ver{\"a}nderung der Migrationsgeschwindigkeit. Dies war angesichts vergleichbarer Versuche auf Polylysinbeschichtungen {\"u}berraschend, da diese eine dosisabh{\"a}ngige Verlangsamung der Neutrophilen nach Blockade der Kaliumkan{\"a}le mit Clotrimazol und Charybdotoxin ergebenhatten. Nachdem ausgeschlossen wurde, dass Zellmorphologie oder -geschwindigkeit diesen Unterschied bedingten, spricht dies f{\"u}r einen matrixspezifischen „Crosstalk" zwischen Adh{\"a}sionsmolek{\"u}len der Zelle und Untergrund. Die dabei aktivierten verschiedenartigen Signalkaskaden bzw. alternative in die Zellmembran eingebrachte Kaliumkanaltypen k{\"o}nnten zur Kompensation der hIK1-Blockade auf Fibronektin gef{\"u}hrt haben. Vor dem Hintergrund der sich durch meine Arbeit abzeichnenden hohen Modulationsf{\"a}higkeit kanalvermittelter Migrationsschritte d{\"u}rfte sich die Entwicklung neuer antimigratorisch-antiinflammatorisch wirkender Kaliumkanalhemmstoffe f{\"u}r Neutrophile deutlich schwieriger gestalten, als bislang vermutet.}, language = {de} } @phdthesis{Goessler2003, author = {G{\"o}ßler, Ulrich}, title = {Regulation der Capsaicin-Sensitivit{\"a}t von murinen Spinalganglienzellen durch neurotrophe Faktoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8500}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit konnte anhand von Zellkulturen von Spinalganglienzellen herausgearbeitet werden, dass die Regulation der Capsaicin-Sensitivit{\"a}t in der Maus von vielen Faktoren abh{\"a}ngig ist: Es ließ sich ein komplexes System der Regulation von Capsaicin-induziertem Cobalt-Uptake als Surrogat-Marker f{\"u}r nozizeptive Neurone herausarbeiten: Zum einen konnte gezeigt werden, dass NGF dosisabh{\"a}ngig Einfluss auf die peptiderge Neuronenpopulation nimmt und {\"u}ber den niederaffinen NGF-Rezeptor p75NTR Capsaicin-Empfindlichkeit, CGRP-Expression und VR1-Expression reguliert. Dieser Rezeptor hat dabei keine Bedeutung f{\"u}r den konstitutiven Cobalt-Uptake, jedoch f{\"u}r die Aufrechterhaltung des Cobalt-Uptakes in der Zellkultur. Zum anderen konnte gezeigt werden, dass GDNF dosisabh{\"a}ngig den Anteil der Neurone mit Capsaicin-induziertem Cobalt-Uptake reguliert und dosisabh{\"a}ngig parallel in zwei Gruppen von Spinalganglienzellen den Cobalt-Uptake induziert: einerseits {\"u}ber den GDNF-Rezeptor GFRa2 und die Rezeptortyrosinkinase c-RET in der IB4-Population, andererseits {\"u}ber GFRa1 und SRC-Kinasen in der GFRa1-Population. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Spinalganglienzellen die Sensibilit{\"a}t gegen{\"u}ber noxischen Reizen selbst{\"a}ndig komplex regulieren und damit auf {\"a}ußere Einfl{\"u}sse reagieren k{\"o}nnen. M{\"o}glicherweise ergeben sich in Zukunft neue Ansatzpunkte der Therapie dadurch, dass die Neurone direkt beeinflusst werden k{\"o}nnen.}, language = {de} } @phdthesis{Mittermeier2003, author = {Mittermeier, Agnes Barbara}, title = {Beeinflussung der Migration humaner neutrophiler Granulozyten durch Ca 2+-empfindliche K +-Kan{\"a}le (hIK1)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7172}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass humane neutrophile Granulozyten auf mRNA-Ebene hIK1-Kan{\"a}le exprimieren. Die spezifischen hIK1-Kanalblocker Clotrimazol und Charybdotoxin f{\"u}hrten zu einer dosisabh{\"a}ngigen Verringerung der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Eine Hemmung der hIK1-Kan{\"a}le mittels Clotrimazol und Charybdotoxin f{\"u}rte zu einer signifikanten Zellschwellung. Die mittels Hypotonie erzwungene Zellschwellung f{\"u}hrte zu einer signifikanten Reduktion der Migrationsgeschwindigkeit Neutrophiler. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Migration humaner neutrophiler Granulozyten von der Aktivit{\"a}t der hIK1-Kan{\"a}le abh{\"a}ngig ist.}, language = {de} } @phdthesis{Benesic2003, author = {Benesic, Andreas}, title = {Wirkung nanomolarer Konzentrationen des Mykotoxins Ochratoxin A auf Calciumhom{\"o}ostase, Wachstumsverhalten und hormonelle Signaltransduktion menschlicher proximaler Tubuluszellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6599}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Hintergrund: Der weitverbreitete und karzinogene Pilzmetabolit Ochratoxin A (OTA) beeinflußt die Funktion und das Wachstumsverhalten renaler Zellen. In h{\"o}heren Konzentrationen reduziert OTA auch die Integrit{\"a}t der Zellen. Untersucht wurde die m{\"o}gliche Beteiligung von {\"A}nderungen der zellul{\"a}ren Calciumhom{\"o}ostase an den Wirkungen von OTA in nanomolaren Konzentrationen. Methoden: Immortalisierte menschliche Nierenepithelzellen (IHKE) wurden verwendet, um die Effekte von OTA auf die zytosolische Calciumhom{\"o}ostase ([Ca2+]i), Zellwachstum und und -integrit{\"a}t zu untersuchen. 1 nmol/l OTA potenzierte Ca2+-abh{\"a}ngig die EGF- und Ang II-induzierte Zellproliferation. Ca2+-unah{\"a}ngige Zellunterg{\"a}nge und Reduktion der Zellzahl konnte nur nach 24-st{\"u}ndiger Inkubation mit einer Schwellenkonzentration von >10 nmol/l beobachtet werden. Innerhalb von Sekunden wurden durch OTA reversible und konzentrationsabh{\"a}nige [Ca2+]i-Oszillationen mit einer Schwellenkonzentration von 0.1 nmol/l hervorgerufen. Die Oszillationen wurden durch Reduktion des extrazellul{\"a}ren Ca2+, den Ca2+-Kanalblocker SK\&F 96365 und durch Hemmung der der Phospholipase C verhindert. Der durch OTA hervorgerufene Ca2+-Einstrom war auch nach Entleerung von Ca2+-Speichern durch Schwellenkonzentration das ebenfalls die Oszollationen hemmte, noch vorhanden. Zus{\"a}tzlich steigerte OTA den F{\"u}llungszustand von Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-Speichern und stimulierte die Aktivit{\"a}t der Thapsigargin-empfindlichen Ca2+-ATPase. Eine 10-min{\"u}tige Inkubation mit OTA erh{\"o}hte den zellul{\"a}ren cAMP-Gehalt dosisabh{\"a}ngig. Der Proteinkinase A Inhibitor H-89 unterdr{\"u}ckte die OTA-induzierten Ca2+- Oszillationen. 1 nM OTA potenzierte die Effekte von Angiotensin II und EGF auf [Ca2+]i. Schlußfolgerungen: (i) OTA beeintr{\"a}chtigt in niedrig-nanomolaren Konzentrationen, die im Rahmen der nat{\"u}rlichen Exposition auftreten k{\"o}nnen, reversibel die Ca2+-Hom{\"o}ostase in menschlichen proximalen Tubuluszellen. (ii) OTA verursacht dosis-abh{\"a}ngige [Ca2+]i-Oszillationen die auf OTA-induzierten Ca2+-Einstrom und Thapsigargin-sensitive Ca2+-Speicher angewiesen sind. (iii) Ferner interagieren niedrig-nanomoler Konzentrationen von OTA mit hormonellen Ca2+-Signalen, was z.B. zu einem ver{\"a}nderten zellul{\"a}ren Proliferationsverhalten f{\"u}hrt. (iv) Die Verminderung der Zellintegrit{\"a}t durch h{\"o}here OTA-Konzentrationen h{\"a}ngt nicht von Ver{\"a}nderungen der Ca2+-Hom{\"o}ostase ab. (v) Die durch OTA hervogerufene renale Dysfunktion scheint, zumindest teilweise, auf Wechselwirkungen mit zellul{\"a}ren Signaltransduktionsmechanismen zu beruhen und nicht auf Zellzerst{\"o}rung.}, language = {de} } @phdthesis{Weber2004, author = {Weber, Florian}, title = {Screening der apoptoseinduzierenden Interaktionen von Nephrotoxinen unter besonderer Ber{\"u}cksichtigung von Ochratoxin A}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9821}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {Ochratoxin A ist ein Schimmelpilzmetabolit, der in vielen Nahrungsmitteln des Menschen vorkommt und in <80\% der Blutproben nachweisbar ist. OTA wirkt haupts{\"a}chlich auf die Niere, und hier unter anderem durch Apoptose. Im t{\"a}glichen Leben sind wir jedoch vielen Nephrotoxinen gleichzeitig ausgesetzt. Somit untersuchten wir die apoptoseinduzierende Wirkung verschiedener Substanzen, wie Antibiotika, NO-Donoren, H2O2, CdCl2, Cisplatin, Cyclosporin A und unterschiedliche pH-Werte in Kombination mit OTA. Bedingt durch die hohe Zahl m{\"o}glicher Kombinationen verwendeten wirt ein schnelles und effizienztes Apoptose-Screening. Wir bestimmten Caspase-3 Aktivit{\"a}t und Proteingehalt direkt an Zellen, die in 96-Well Platten anges{\"a}t wurden. Apoptose wurde mittels DNA-Leiterbildung best{\"a}tigt, Nekrose durch die Aufnahme von Trypanblau in die Zelle bestimmt. Die untersuchten Zellinien umfassten: LLC-PK1 und IHKE-Zellen (proximaler Tubulus) und MDCK-C7-Zellen (Sammelrohr). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die apoptoseinduzierende Wirkung von OTA von hom{\"o}ostatischen und nephritogenen Agenzien beeinflusst wird, denen die Zellen simultan mit OAT ausgesetzt werden. So beobachteten wir, abh{\"a}ngig von der Kombination antagonistische, additive und potenzierende Effekte. Potenzierung der Wirkung von OTA wurde u.a. f{\"u}r H2O2, Cadmiuim und Cisplatin b eobachtet, w{\"a}hrend NO-Donoren, Amphotericin B und Angiotensin II eine hemmende Wirkung aof OTA hatten. Cyclosporin A, Cephalexin und Gentamicin zeigten {\"u}berwiegend additive Wirkung. Das Ausmass der INteraktionen war zwischen den einzelnen Zellininen unterschiedlich und somit zelltyp-, konzentrations- und toxinabh{\"a}nigig.}, language = {de} } @phdthesis{Kerl2004, author = {Kerl, Hans Ulrich}, title = {Charakterisierung interagierender Proteine des renalen ATP-abh{\"a}ngigen Kaliumkanals ROMK}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13506}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {ROMK ist ein einw{\"a}rts-gleichrichtender Kaliumkanal, der haupts{\"a}chlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen {\"u}ber die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig {\"u}ber die f{\"u}r den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein m{\"o}glicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene m{\"o}gliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 best{\"a}tigt werden. Ebenso war es m{\"o}glich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte f{\"u}r eine m{\"o}gliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen f{\"u}r den Einbau und die Stabilit{\"a}t von ROMK in der Membran zust{\"a}ndig sein und zum anderen durch Verbindung zu m{\"o}glichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivit{\"a}tssteuerung von ROMK spielen k{\"o}nnten.}, language = {de} } @phdthesis{Roos2005, author = {Roos, Marcel Philipp}, title = {Suche nach Interaktionspartnern mit dem ATP-abh{\"a}ngigen Kaliumkanal der Niere, ROMK, durch "Yeast-Two-Hybrid-Screening"}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11424}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kan{\"a}len, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abh{\"a}ngigen Kaliumkanals ROMK ließ m{\"o}gliche Inter-aktionen mit zellul{\"a}ren und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-f{\"u}hrung dreier „Yeast-Two-Hybrid"-Screens zur Identifizierung m{\"o}glicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abkl{\"a}rung {\"u}brig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschl{\"u}sse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid"-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abh{\"a}ngigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher k{\"o}nnten beide in Punkt 1.5.4. erw{\"a}hnten Theorien der Aktivit{\"a}ts{\"a}nderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kan{\"a}le bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kan{\"a}len in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 ver{\"a}ndern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint f{\"u}r eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele {\"u}ber den m{\"o}glichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und n{\"a}her erl{\"a}utert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschl{\"u}sse {\"u}ber Aktivit{\"a}ts{\"a}nderungen des ATP-ab-h{\"a}ngigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren.}, language = {de} } @phdthesis{Roemer2005, author = {R{\"o}mer, Michael}, title = {Endozytose des Ca2+-sensitiven hIK1-Kanals in migrierenden MDCK-F-Zellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-15750}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {Zellmigration ist ein wichtiges Ph{\"a}nomen im gesamten Leben eines menschlichen Organismus. Erw{\"u}nschte physiologische Bedeutung hat die Zellmigration z. B. im Rahmen der Embryogenese, der Wundheilung und der Immunabwehr, w{\"a}hrend sie pathophysiologisch unter anderem bei der Metastasierung maligner Neoplasien in Erscheinung tritt. F{\"u}r optimale Migration ist eine Beteiligung von Ionenkan{\"a}len, Ionentransportern und zytoskeletalen Mechanismen in streng koordinierter Interaktion notwendig. Bei selektiver Blockade Ca2+-sensitiver K+-Kan{\"a}le (IK1) durch das Skorpiongift Charybdotoxin wird die Migrationsf{\"a}higkeit von Zellen erheblich gest{\"o}rt. Da dies ein m{\"o}glicher thera-peutischer Ansatzpunkt zur Malignit{\"a}tsreduzierung von Tumoren durch Hemmung der Metastasierung sein k{\"o}nnte, galt es in dieser Arbeit, den „Lebenslauf" dieses Kanalproteins genauer zu erforschen. Bisherige Erkenntnisse {\"u}ber Migrationsmechanismen, Membran-Umbau und Integrintransport wurden in einem neuen Modell zusammengefasst, das unter anderem die Theorie des K+-Kanal-Rezirkulierens beinhaltet. Zur {\"U}berpr{\"u}fung dieser Theorie wurde in der vorliegenden Doktorarbeit auf die Endo-zytose der Ca2+-abh{\"a}ngigen K+-Kan{\"a}le als ersten Schritt bei deren Rezirkulation fokussiert. Durch die Insertion eines viralen HA-Epitops in die Gensequenz des hIK1 mit PCR-Technik konnte der Kanal durch monoklonale anti-HA-Antik{\"o}rper [Maus] markierbar und durch Zweitantik{\"o}rper [anti-Maus] detektierbar gemacht werden. Nach der Transfektion des hIK1-HA-34-Plasmids in migrierende MDCK-F-Zellen war aufgrund der extrazellul{\"a}ren Lage des HA-34-Epitops im Kanalprotein eine Markierung der Kan{\"a}le mit Antik{\"o}rpern in lebenden Zellen m{\"o}glich. Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte nach 37°C-in vivo-Inkubation der Zellen mit extrazellul{\"a}rer hIK1-HA-34-Markierung die Bildung von vesikel{\"a}hnlichen Strukturen, die auf Endozytose hindeuten konnten. Untransfizierte Kontrollzellen blieben ungef{\"a}rbt - die Aufnahme der Antik{\"o}rper in die Zellen mit hIK1-HA-34 musste also spezi-fisch {\"u}ber Endozytose der Antik{\"o}rper-Kanal-Komplexe geschehen sein. In der in vivo-Inkubation bei 4°C waren die Versuchszellen nur schemenhaft zu erkennen und auch das bei den 37°C-Experimenten deutlich sichtbare „ruffling" an der Lamellipodiumspitze stellte sich nicht dar. Dies erh{\"a}rtete den Verdacht auf eine Ansammlung von Vesikeln an der Lamellipodiumvorderkante. Mit dem Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) konnte die K+-Kanalpr{\"a}senz in der Plasmamembran quantifiziert werden. Gegen{\"u}ber den untransfizierten Kontrollzellen waren die Peroxidase-Werte um das achtfache erh{\"o}ht. Dies weist ebenfalls auf eine spezifische Endozytose der hIK1-markierenden Antik{\"o}rper hin. Zudem zeigte sich bei der 37°C-Inkubation im Zeitverlauf {\"u}ber 60 Minuten eine S{\"a}ttigungskinetik, die ebenfalls f{\"u}r ein Rezirkulieren des hIK1 sprechen k{\"o}nnte. Zusammengefasst scheinen die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungstechniken die Endozytose Ca2+-empfindlicher K+-Kan{\"a}le als ersten Schritt eines vermuteten Rezirkulierens der Kanalproteine zu best{\"a}tigen.}, language = {de} } @phdthesis{LeipoldBuettner2005, author = {Leipold-B{\"u}ttner, Carsten}, title = {Immunhistochemische Darstellung von spannungsabh{\"a}ngigen Calciumkan{\"a}len an peripheren afferenten Nervenfasern im Kniegelenk der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17894}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2005}, abstract = {The afferent function (excitability) and efferent function (release of neuropeptides) of primary afferent nerve fibres is based on Ca2+-influx. Aim of the present study was to examine the presence of L-and N-type Ca2+-channels at sensory nerve fibres in the mouse knee joint capsule. Specific fluorescent labelled channel blocker and antisera against these channel subtypes were combined with an immunhistochemical staining for calcitonin gene-related peptide (CGRP), a neuropeptide that is wildly distributed in primary afferents. There was nearly complete colocalisation of calcitonin gene-related peptide immunoreactivity and the binding of conotoxin GVIA or BODIPY- verapamil demonstrating the presence of N-type and L-type Ca2+-channels, respectively. These data were further confirmed by identical results obtained after an immunohistochemical demonstration of the two channel subtypes at the peptidergic nerve fibres.}, language = {de} } @phdthesis{Schmalfuss2006, author = {Schmalfuss, Andreas}, title = {Protonensensitivit{\"a}t des Hitzerezeptors von prim{\"a}r afferenten Neuronen der K{\"u}ken in vitro}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-24973}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Aus vorherigen Ver{\"o}ffentlichungen der Arbeitsgruppe war bekannt, dass der TRPV1 Hitzerezeptor im Vogel sich vom TRPV1 der S{\"a}ugetiere hinsichtlich der Capsaicinsensitivit{\"a}t und der Regulation der Expression durch NGF unterscheidet. Unterschiede in den Eigenschaften zwischen beiden Hitzerezeptorsubtypen k{\"o}nnten R{\"u}ckschl{\"u}sse auf funktionelle Strukturen des S{\"a}ugetier TRPV1 erlauben. In der vorliegenden Arbeit war die {\"u}bergreifende Fragestellung, ob sich beide Hitzerezeptorsubtypen auch hinsichtlich ihrer Protonensensitivit{\"a}t unterscheiden. F{\"u}r die Untersuchungen wurden Spinalganglienneurone von K{\"u}ken isoliert und kultiviert. Mit Hilfe der Cobalt-uptake Methode wurde der Anteil der Neurone bestimmt, die funktionell den Hitzerezeptor TRPV1 exprimieren. Diese Experimente wurden nach 1, 2 und 3 Tagen unter Kulturbedingungen durchgef{\"u}hrt, um eine m{\"o}gliche Ver{\"a}nderung mit der Zeit zu erfassen. Weiterhin wurde untersucht, ob durch Protonen der Anteil hitzesensitiver Neurone beeinflusst wird. Hierf{\"u}r wurden die Somata nach einem Tag unter Kulturbedingungen in Kombination von Hitze und Protonen stimuliert. Um eine Sensibilisierung der Hitzeantwort durch Protonen in einzelnen Neuronen zu untersuchen, wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik in der whole-cell Konfiguration die Amplitude von Hitze-und protoneninduzierten Gesamteinw{\"a}rtsstr{\"o}men untersucht. Zun{\"a}chst wurde mit der Cobalt-uptake Methode untersucht, ob der Anteil hitzesensitiver Neurone durch Protonen von der Zeit unter Kulturbedingungen beeinflusst wird. Bei einer Temperatur von 44°C stieg der Prozentsatz hitzesensitiver Neurone innerhalb der ersten 3 Tage unter Kulturbedingungen an, unabh{\"a}ngig von der Protonenkonzentration (pH 7,4, pH 6,6 und pH 5,8). Die n{\"a}chste Frage war, wie hoch der Anteil protonensensitiver Neurone bei Raumtemperatur ist. Hierf{\"u}r wurden die Zellen nach einem Tag in Zellkultur mit einem Medium von pH 7,4, pH 6,6, pH 6,2 oder pH 5,8 stimuliert. Es zeigte sich ein Anstieg von 3,3\% ± 0,5\% bei pH 7,4 auf 35,0\% ± 4,0\% bei pH 5,8. Im Folgenden wurde der Frage nachgegangen, ob dieser Anstieg temperaturabh{\"a}ngig ist. Hierf{\"u}r wurden entsprechende Experimente bei 37°C, 40°C und 44°C nach einem Tag unter Kulturbedingeungen durchgef{\"u}hrt. Im Vergleich war bei 37°C der Anteil positiver Neurone bereits bei 6,2 so hoch wie bei Raumtemperatur bei pH 5,8. Mit weiter zunehmender Temperatur verringerte sich jedoch der Anteil positiver Neurone mit steigendem pH. So war bei 44°C und pH 5,8 nur noch ein geringer Anstieg zu verzeichnen. Im letzten Teil der Arbeit wurde mit Hilfe der Patch-clamp Technik hitze- und protoneninduzierte Einw{\"a}rtsstr{\"o}me gemessen. Es konnte exemplarisch gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduziereten Einw{\"a}rtsstroms temperaturabh{\"a}ngig ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Amplitude des hitzeinduzierten Einw{\"a}rtsstroms bei einem Medium von pH 6,6 im Vergleich zu pH 7,4 deutlich ansteigt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der K{\"u}ken TRPV1 {\"a}hnlich wie der der S{\"a}ugetiere durch Protonen in Konzentrationen, die im entz{\"u}ndlichen Gewebe vorkommen, sensibilisiert werden kann. Es kommt sowohl zu einer Rekrutierung von weiteren hitzesensitiven Neuronen also auch zu einer verst{\"a}rkten Antwort bereits hitzesensitiver Neurone.}, subject = {K{\"u}ken}, language = {de} } @phdthesis{Hesse2006, author = {Hesse, Britta Dorothea}, title = {Modulation des renalen organischen Anionentransporters hOAT1 durch EGF}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18901}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung k{\"o}rpereigener und k{\"o}rperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen geh{\"o}rt zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einfl{\"u}ssen unterliegen k{\"o}nnen. K{\"u}rzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem f{\"u}r organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identit{\"a}t der beteiligten Transportproteine aufgekl{\"a}rt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein f{\"u}r organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivit{\"a}t der transfizierten Zellen f{\"u}r organische Anionen, und nach einer zehnmin{\"u}tigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivit{\"a}t. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut {\"u}ber das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazellul{\"a}re Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss {\"u}ber die Mechanismen der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 f{\"u}r weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen f{\"u}hrte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivit{\"a}t f{\"u}r Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivit{\"a}t des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls {\"u}ber die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegens{\"a}tzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden F{\"a}llen wird jedoch die Wirkung {\"u}ber die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Kl{\"a}rung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark {\"u}berexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegen{\"u}ber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt {\"u}ber eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabh{\"a}ngig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, l{\"a}sst sich nur vermuten. Denkbar w{\"a}re jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des R{\"u}cktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen {\"u}ber EGF vermittelt auch bei entz{\"u}ndlicher Sch{\"a}digung des Nierencortex oder im Falle einer Isch{\"a}mie gew{\"a}hrleistet bleibt.}, language = {de} } @phdthesis{Seitz2006, author = {Seitz, Steffen}, title = {Untersuchung des Epsilon-Toxins und Mutanten des Epsilon-Toxins aus Clostridium perfringens auf Kanalbildung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18793}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war die biophysikalische Charakterisierung der Bindekomponente des Epsilon-Toxins und der Epsilon-Toxin-Mutanten mit Hilfe k{\"u}nstlicher Lipid-Bilayer-Messungen. Es galt herauszufinden, welcher Teil des Epsilon-Toxins f{\"u}r die Kanalbildung verantwortlich ist, um somit die kanalbildende Dom{\"a}ne definieren zu k{\"o}nnen. Um diese ermitteln k{\"o}nnen, wurden in der Arbeit vier Epsilon-Toxin Mutanten untersucht, bei denen in dieser potentiellen Porendom{\"a}ne Punktmutationen eingef{\"u}gt worden sind. Diese werden Epsilon-Toxin 700, 701, 702 und 703 genannt. Im Vergleich von Wildtyp und Mutanten hat sich gezeigt, dass sich die Werte der Einzelkanalleitf{\"a}higkeit, der Selektivit{\"a}t und der Spannungsabh{\"a}ngigkeit ver{\"a}ndert haben. Damit wurde bewiesen, dass die Punktmutationen genau in dem Bereich des Toxins durchgef{\"u}hrt wurden, der f{\"u}r die Kanalbildung verantwortlich sein muss.}, language = {de} } @phdthesis{Engert2006, author = {Engert, Sabine}, title = {Antwortverhalten Galanin-immunoreaktiver isolierter Spinalganglienzellen der Ratte auf Hitze- und Capsaicinstimulation in Abh{\"a}ngigkeit von neurotrophen Faktoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17337}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Aus der Literatur ist bekannt, dass das Neuropeptid Galanin in Verhaltensexperimenten an Galanin-KO M{\"a}usen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer thermischen Hyperalgesie spielt. Welche Membrankan{\"a}le noxische thermische Reize in galaninergen Nozizeptoren transduzieren, wurde nicht nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass es Galanin-immunoreaktive sensorische Neurone in der Ratte gibt, die gleichzeitig Hitze-sensitiv sind. Hierf{\"u}r wurden Spinalganglienneurone der Ratte bis zu 6 d in Medium ohne NGF kultiviert. Mit Hilfe einer Doppelf{\"a}rbung, bestehend aus Hitze- bzw. Capsaicin-induzierter Cobalt-Aufnahme mit anschließendem immunocytochemischen Nachweis von Galanin konnte durch Analyse der Kolokalisation {\"u}berraschenderweise ein deutlicher Unterschied zwischen der Anzahl Hitze/GAL-IR und der Anzahl CAP/GAL-IR doppeltgef{\"a}rbter Neurone festgestellt werden, vor allem ab Tag 4 der Zellkultur. Dies l{\"a}sst vermuten, dass es sich hier um einen anderen Hitze-sensitiven Rezeptor als den Capsaicin- und Hitze-sensitiven TRPV1 handelt, der in Galanin-positiven Neuronen exprimiert wird. Es konnte best{\"a}tigt werden, dass der Wachstumsfaktor LIF eine positive Regulation der Expression von Galanin bewirkt. Die Analyse der Kolokalisation ergab hier, dass LIF den Anstieg der Hitze/GAL-IR doppeltgef{\"a}rbten Neurone verhindert. LIF inhibiert gleichzeitig den Abfall der Anzahl der Neurone mit Kolokalisation CAP/GAL-IR. Da in den PCR-Experimenten eine gesteigerte Expression des TRPV1 mit LIF im Medium zu beobachten war, k{\"o}nnte diese {\"A}nderung der Kolokalisation auf eine gesteigerte Expression des TRPV1 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren sein. Um eine gr{\"o}ßere Anzahl Cobalt-positiver Neurone zur Beurteilung der Kolokalisation zu erhalten, wurden Experimente mit dem PKC Aktivator PMA durchgef{\"u}hrt. W{\"a}hrend sich mit PMA die Zahl Capsaicin-positiver Neurone wegen der schon maximalen Stimulierung nicht weiter steigern ließ, f{\"u}hrte die Zugabe von PMA zu einem Anstieg der Hitze-positiven Neurone nach 6 d unter Kulturbedingungen ohne NGF. Allerdings blieb der gleichzeitige Anstieg der Anzahl Hitze/GAL-IR doppeltgef{\"a}rbter Neurone aus. Unter Versuchsbedingungen mit NGF ließ sich durch PMA, aufgrund der durch NGF bereits maximal aktivierten PKC, bei keinem der untersuchten Parameter eine signifikante Ver{\"a}nderung feststellen.}, language = {de} } @phdthesis{Grossmann2006, author = {Großmann, Claudia}, title = {Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor f{\"u}r G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise f{\"u}r eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So k{\"o}nnen Mineralocorticoide nach zerebraler Isch{\"a}mie zu einem vermehrten vaskul{\"a}ren Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration f{\"u}hren und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verst{\"a}rken. Daher w{\"a}re eine m{\"o}gliche Erkl{\"a}rung f{\"u}r die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu {\"u}berpr{\"u}fen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erh{\"o}ht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Prim{\"a}rkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen best{\"a}tigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. {\"U}ber den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung ausl{\"o}sen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders f{\"u}r therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivit{\"a}t des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivit{\"a}t im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Dom{\"a}ne f{\"u}r die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Dom{\"a}nen C, D, E und F gen{\"u}gt nicht, um den EGFR-Promoter vollst{\"a}ndig zu aktivieren. Um Hinweise f{\"u}r die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellul{\"a}rmatrix in glatten Gef{\"a}ßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt f{\"u}r die vermehrte Bildung von extrazellul{\"a}rer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterst{\"u}tzt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskul{\"a}ren und renalen System kommt es {\"u}ber eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, n{\"a}mlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion {\"u}ber den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und k{\"o}nnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zus{\"a}tzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron f{\"u}hren diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und f{\"u}hrt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte k{\"o}nnen folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron f{\"u}hrt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabh{\"a}ngig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabh{\"a}ngig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen f{\"u}r eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorg{\"a}ngen.}, subject = {Aldosteron}, language = {de} } @phdthesis{Oehrlein2006, author = {Oehrlein, Katharina Barbara}, title = {Untersuchungen zur Interaktion des Inhalationsan{\"a}sthetikums Halothan mit Kalium-Kan{\"a}len mit zwei Porendom{\"a}nen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23784}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Kernpunkt dieser Arbeit ist die interessante pharmakologische Regulation der 2PDK+- Kan{\"i}?'½le durch Inhalationsan{\"i}?'½sthetika. {\"i}?'½ber die molekularen Grundlagen dieser Interaktion und deren Bedeutung in vivo ist noch immer sehr wenig bekannt. Am Beispiel von Halothan, das in der aktuellen Literatur in diesem Zusammenhang am h{\"i}?'½ufigsten verwendete Inhalationsan{\"i}?'½sthetikum, soll im Hauptteil der Arbeit mit elektrophysiologischen Methoden die Wirkung der Inhalationsan{\"i}?'½sthetika auf den Aktivit{\"i}?'½tszustand der unterschiedlichen Subgruppen der 2PD-K+-Kan{\"i}?'½le beschrieben werden. Die in Xenopus-Oozyten exprimierten 2PD-K+-Kan{\"i}?'½le dienen hierbei als Modell nativer 2PD-K+-Kan{\"i}?'½le. Es wird eine pharmakologische Konzentrations-Wirkungs-Beziehung erstellt, mit der anschlie{\"i}?'½end R{\"i}?'½ckschl{\"i}?'½sse auf die Bedeutung der 2PD-K+-Kan{\"i}?'½le f{\"i}?'½r die Vermittlung der Narkose gezogen werden k{\"i}?'½nnen. Es soll auch untersucht werden, ob diese Halothanwirkung durch andere physiologische Regulatoren der 2PD-K+- Kan{\"i}?'½le beeinflusst wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit soll anhand von Mutagenese bestimmter Kanalabschnitte der molekulare Wirkmechanismus von Halothan genauer charakterisiert werden: Liegt dem beobachteten Ph{\"i}?'½nomen eine Ligandenbindung nach dem Schl{\"i}?'½ssel-Schloss-Prinzip zugrunde oder vermitteln kompliziertere Mechanismen, etwa ein Ionenkanal-Gate oder komplexe intrazellul{\"i}?'½re Signalwege, die Wirkung von Halothan auf die 2PD-K+-Kan{\"i}?'½le?}, language = {de} } @phdthesis{Wach2006, author = {Wach, Julia}, title = {Die Antwort von K{\"u}ken-Spinalganglienneuronen auf Hitze wird NGF-unabh{\"a}ngig reguliert}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21583}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Der erste klonierte Hitzerezeptor in S{\"a}ugetieren ist der TRPV1. Er wird durch noxische Hitzereize ab 43° C und durch chemische Substanzen wie das Vanilloid Capsaicin aktiviert. Die Expression des TRPV1 wird durch das Neurotrophin „Nerve Growth Factor" (NGF) gesteuert, welches in nichtneuronalen Zellen im Innervationsgebiet der Nozizeptoren gebildet und von dort retrograd zu den Somata der Neurone transportiert wird. Im Gegensatz zu S{\"a}ugern reagieren V{\"o}gel nicht auf Capsaicin, aber auf Hitze ab 42° C. Der hierf{\"u}r zust{\"a}ndige Rezeptor im K{\"u}ken wurde kloniert und cTRPV1 genannt. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Expression des TRPV1 von K{\"u}ken ebenso wie bei S{\"a}ugern von NGF reguliert wird. Hierf{\"u}r erfolgte (i) eine Isolation von Spinalganglienneurone aus Ratten und K{\"u}ken und deren Zellkultur f{\"u}r bis zu drei Tagen mit und ohne NGF und (ii) eine Ligation des Nervus ischiadicus des K{\"u}kens und die anschließende Isolation der korrespondierenden Spinalganglienneurone. Anschließend erfolgte die Stimulation mit 44 °C und der Anteil capsaicin- bzw. hitzesensitiver Neurone wurde mit Hilfe der Cobalt-Uptake-Methode ermittelt. Es zeigte sich, dass sowohl der Anteil der capsaicinsensitiven als auch der hitzesensitiven Spinalganglienneurone der Ratte bei Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur abnimmt. Im Unterschied dazu nimmt in K{\"u}ken der Anteil hitzesensitiver Spinalganglienneurone unabh{\"a}ngig von der An- oder Abwesenheit von NGF im Kulturmedium mit der Zeit in Zellkultur zu. Auch unter in vivo-Bedingungen nach Ligation des Nervus ischiadicus zeigte sich beim K{\"u}ken ein Anstieg der Proportion hitzesensitiver Spinalganglienneurone. Somit konnte gezeigt werden, dass der K{\"u}ken-TRPV1 im Gegensatz zum TRPV1 der Ratten unabh{\"a}ngig von NGF reguliert wird. Die vorliegenden Ergebnisse tragen zur weiteren Charakterisierung des K{\"u}ken-TRPV1 und zur Kl{\"a}rung pathologisch ver{\"a}nderter Hitzeempfindungen im Rahmen von Erkrankungen, die mit einer {\"A}nderung des NGF-Gehaltes im Innervationsgebiet von Nozizeptoren einhergehen, bei.}, language = {de} } @phdthesis{Kugler2008, author = {Kugler, Sabrina}, title = {Wirkung von Cannabinoiden auf die Tandemporenkaliumkan{\"a}le TASK-1 und TASK-3}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27922}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In dieser Arbeit wurde die Wirkung der unges{\"a}ttigten Fetts{\"a}ure Arachidons{\"a}ure, des Endocannabinoids Anandamid und des synthetischen Cannabinoid-Rezeptor-Agonisten WIN55,212-2 auf die Tandemporenkaliumkan{\"a}le TASK-1 und TASK-3 untersucht. Dazu wurden an Xenopus Oozyten, denen die entsprechende Kanal-RNA injiziert wurde, in der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme elektrophysiologische Messungen durchgef{\"u}hrt. Zun{\"a}chst wurden f{\"u}r alle drei Substanzen Dosis-Wirkungs-Beziehungen bestimmt. Diese f{\"u}hrten zu folgenden Ergebnissen: • TASK-1 wird durch WIN55,212-2 um bis zu ca. 81\% gehemmt. Die IC50 betr{\"a}gt 0,83 µM. Anandamid besitzt eine IC50 von 1,92 µM und hemmt den Strom um bis zu ca. 71\%. Bei WIN55,212-2 bzw. bei Anandamid liegt mit einem Hill-Koeffizienten (nH) von 1,65 bzw. von 1,42 positive Kooperativit{\"a}t vor. Arachidons{\"a}ure hingegen inhibiert den Strom nur um bis zu ca. 63\%. Die IC50 betr{\"a}gt 11,3 µM. Der Hill-Koeffizient von 0,9 ergibt negative Kooperativit{\"a}t. • TASK-3 wird durch alle drei Substanzen deutlich weniger inhibiert. Die maximale Inhibition durch WIN55,212-2 [10µM] betr{\"a}gt 32,4\% (± 9,7). F{\"u}nf µM Anandamid bzw. 80 µM Arachidons{\"a}ure verursachen eine Hemmung um 32,1\% (± 5,4) bzw. um 20,3\% (± 5,5). Bei beiden Kanalproteinen wurde außerdem untersucht, welche Bedeutung den Aminos{\"a}uren in Position 243-248, die bei TASK-1 und TASK-3 mit Ausnahme einer Aminos{\"a}ure {\"u}bereinstimmen, bei der Wirkung von Cannabinoiden zukommt. Dazu wurden Mutationsstudien im Bereich des C-Terminus von TASK-1 und TASK-3 durchgef{\"u}hrt. • Es wurden die sechs Aminos{\"a}uren in Position 243-248 aus TASK-1 bzw. TASK-3 entfernt (TASK-1 [243-248] bzw. TASK-3 [243-248]). Die inhibitorische Wirkung von WIN55,212-, Anandamid und Arachidons{\"a}ure war bei TASK-1 [243-248] deutlich vermindert, w{\"a}hrend es bei TASK-3 [243-248] zu unterschiedlichen Effekten kam. • Der gesamte C-Terminus des TASK-1 wurde entfernt, mit Ausnahme der sechs Aminos{\"a}uren in Position 243-248. Außerdem wurden die endst{\"a}ndigen Aminos{\"a}uren RSSV an das Restprotein angef{\"u}gt, da diese f{\"u}r einen gut funktionierenden Transport in die Membran notwendig sind (TASK-1 [249-390RSSV]. Die Wirkungen von WIN55,212-2, Anandamid und Arachidons{\"a}ure entsprachen bei dieser Mutante denen, die beim TASK-1 [Wildtyp] beobachtet wurden. • Durch Punktmutation wurde beim TASK-3 Leucin an Position 247 durch Methionin ersetzt (TASK-3 [L247M]. Diese Mutante besitzt dadurch in Position 243-248 das gleiche Sequenzmotiv wie der TASK-1. Im Vergleich zum TASK-3 [Wildtyp] waren die Wirkungen der Cannabinoide bei dieser Mutante jedoch unver{\"a}ndert. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die untersuchten Cannabinoide eine rezeptorunabh{\"a}ngige, spezifische und reversible inhibitorische Wirkung auf die Tandemporenkaliumkan{\"a}le TASK-1 und TASK-3 haben. Die Aminos{\"a}uren in Position 243-248 sind f{\"u}r diese Wirkung der Cannabinoide von wesentlicher Bedeutung.}, subject = {Kaliumkanal}, language = {de} } @phdthesis{Wuttke2009, author = {Wuttke, Martin}, title = {Die Kommunikation zwischen Aldosteron, dem humanen Mineralokortikoidrezeptor und der cAMP/CRE - Signalkaskade}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48072}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Doktorarbeit {\"u}ber den Einfluss von Aldosteron auf den intrazellul{\"a}ren Betarezeptorsignalweg. Erkl{\"a}rungsansatz f{\"u}r profibrotische Effekte von Aldosteron.}, subject = {Aldosteron}, language = {de} } @phdthesis{Pfau2009, author = {Pfau, Anja}, title = {Modulation der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors - Rolle von Calcium, Proteinkinase C, PI-3-Kinase sowie H2O2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47491}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Aldosteron ist ein Steroidhormon, das eine zentrale Rolle in der Regulation der Salz- und Wasserhom{\"o}ostase des menschlichen K{\"o}rpers spielt. In den letzten Jahren konnte gezeigt werden, dass Aldosteron außderdem fibrotische Vorg{\"a}nge im Herz-Kreislaufsystem beg{\"u}nstigt, indem es beteiligt ist an endothelialer Dsyfunktion oder das sog „cardia redmodelling" negativ beeinflusst. Aldosteron enth{\"u}llte aber noch ein anderes Geheimnis: Bisher wusste man, dass Aldosteron an den Mineralokortikoidrezeptor bindet, der als Liganden-abh{\"a}ngiger Transkriptionsfaktor fungiert; auf diese Art und Weise beeinflusste Aldosteron die Proteinsynthese; nun konnte aber gezeigt werden, dass Aldosteron unabh{\"a}ngig von seinem Rezeptor und unabh{\"a}ngig von der Proteinsynthese zu schnellen Reaktionen f{\"u}hren kann, z.B. zu einer Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Calcium-Konzentration oder zu einer Ver{\"a}nderung des intrazellul{\"a}ren pH-Wertes. Die Interaktionen zwischen Aldosteron, dem Mineralokortikoidrezeptor und anderen Signalwegen scheinen komplexer zu sein als bisher angenommen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezielt der Einfluss von Calcium, Proteinkinase C, der PI-3-Kinase sowie von H2O2 auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors untersucht. Im Rahmen der Zellkultur wurden HEK-Zellen (human embryonic kidney cells) benutzt; als Techniken kamen haupts{\"a}chlich Reportergen-Assay, ELISA, Fluoreszenzmessungen und Fluoreszenzmikroskopie zum Einsatz. Folgende Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden: 1. Calcium ist an der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors beteiligt: die Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Calcium-Konzentration f{\"u}hrt zu einer Abnahme der Aktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors. Da Aldosteron selbst zu einer Erh{\"o}hung der intrazellul{\"a}ren Calcium-Konzentration f{\"u}hrt, k{\"o}nnte Calcium im Sinne eines negativen Feedback-Mechanismus im Rahmen der Aldosteron-induzierten Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors fungieren. 2. Die Proteinkinase C {\"u}bte in den hier durchgef{\"u}hrten Experimenten keinen Einfluss aus auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors. Weder Inhibierung noch Aktivierung der Proteinkinase C zeigten Wirkung. 3. Einen klaren oder direkten Einfluss auf die Aldosteron-induzierte Transaktivierungsaktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors zeigte sich auch bei der PI-3-Kinase nicht. 4. H2O2 f{\"u}hrt - ab einer Konzentration > 500 µmol/l - zu einer deutlichen Herunterregulierung der Aktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors. Diese Herunterregulierung ist unabh{\"a}ngig von Aldosteron, und findet z.B. auch in Gegenwart von anderen Steroidhormonen statt bzw. auch in v{\"o}lliger Abwesenheit eines Mineralokortikoidrezeptor-aktivierenden Hormons. Daher ist anzunehmen, dass H2O2 nicht direkt die Interaktion des Mineralokortikoidrezeptors mit seinem Hormon Aldosteron st{\"o}rt, sondern dass die Einflussnahme von H2O2 auf die Aktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors an einem anderen Punkt der Regulierung der Aktivit{\"a}t des Mineralokortikoidrezeptors stattfinden muss.}, subject = {Aldosteron}, language = {de} } @phdthesis{Fuchs2009, author = {Fuchs, Lorenz}, title = {Interaktion von Kir2-Kan{\"a}len mit 7-Helix-Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39000}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Einw{\"a}rtsgleichrichtende Kaliumkan{\"a}le (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von K{\"o}rperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gef{\"a}ßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. F{\"u}r die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitf{\"a}higkeit dieser Kan{\"a}le beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (fr{\"u}her GIRK f{\"u}r G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einw{\"a}rts gleichrichtenden Kan{\"a}le der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein k{\"o}nnen. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifit{\"a}t der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazellul{\"a}re Signalweg bislang nicht hinreichend gekl{\"a}rt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kan{\"a}le Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme" der Strom {\"u}ber die Kir-Kan{\"a}le vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellul{\"a}rregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kan{\"a}len abweichende Aminos{\"a}uresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikul{\"a}ren Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler {\"U}berstimulation fungiert.}, subject = {Ionenkanal}, language = {de} } @phdthesis{Langenbruch2010, author = {Langenbruch, Lisa Marie}, title = {Biolumineszenz Resonanz Energietransfer (BRET) zur Untersuchung der Dimerisierung des Mineralokortikoidrezeptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-64957}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Das Mineralokortikoid Aldosteron ist ein wichtiger Regulator der Salz- und Wasserhom{\"o}ostase und damit auch des Blutdrucks. Seine physiologische Wirkung entfaltet es {\"u}ber den Mineralokortikoidrezeptor (MR), indem es zu einer Homodimerisierung bzw. Heterodimerisierung mit dem Glukokortikoidrezeptor f{\"u}hrt. Zudem sind die pathophysiologischen Wirkungen des Aldosterons beispielsweise auf das Herz-Kreislauf-System in den Focus ger{\"u}ckt, welche zumindest teilweise auch vom MR abh{\"a}ngig sind. Zur weiteren Charakterisierung dieser Signalwege sollen Interaktionen des MR mit m{\"o}glichen Zielproteinen untersucht werden. Biolumineszenz Resonanz Energietransfer (BRET) ist eine Methode zur Untersuchung von Proteininteraktionen. Um ein BRET-System f{\"u}r den MR zu erstellen, wurde der MR an eine Renilla Luciferase (Rluc) einerseits und das enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) andererseits gekoppelt. Beide Fusionsproteine wurden auf ihre Funktionalit{\"a}t und Interaktion hin {\"u}berpr{\"u}ft. Befinden sich die Fusionsproteine in r{\"a}umlicher N{\"a}he, regt das von der Luciferase emittierte Licht das fluoreszierende Protein an. Das aus Fluoreszenz und Lumineszenz berechnete BRET-Signal steigt und weist damit auf eine Proteininteraktion hin. Ans{\"a}tze ohne fluoreszierenden Akzeptor korrigieren unspezifische Signal{\"a}nderungen. Wir untersuchten den Effekt von Aldosteron und dem Aldosteronantagonisten Spironolacton sowie von Geldanamycin, das eine Dissoziation des MR von den Hitzeschockproteinen im Zytoplasma bewirkt. Aldosteron f{\"u}hrte zu einer Steigerung des BRET-Signals, was die bereits bekannte Interaktion der Fusionsrezeptoren auch im BRET-System best{\"a}tigt. Geldanamycin bewirkte ebenfalls eine Signalsteigerung. Die gleichzeitige Gabe der beiden Substanzen sowie die Gabe von Spironolacton bewirkte keine Ver{\"a}nderung des BRET-Signals. Als Negativkontrolle verwendeten wir ein System mit an EYFP gekoppeltem MR und ungekoppelter Luciferase, also ohne Interaktionspartner f{\"u}r den EYFP-MR. Keine der oben genannten Substanzen f{\"u}hrte hier zu einer {\"A}nderung des BRET-Signals. Das BRET-System kann damit die Grundlage f{\"u}r die Untersuchung der Interaktionen des MR mit weiteren Zielproteinen darstellen.}, subject = {Aldosteron}, language = {de} } @phdthesis{Eder2010, author = {Eder, Elisabeth Christiane}, title = {Die Wirkung von Sildenafil auf das kardiovaskul{\"a}re System in zwei murinen Modellen der Myokardhypertrophie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54515}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Myokardhypertrophie stellt einen Adaptationsmechanismus des Herzens an erh{\"o}hte Belastungen wie chronische arterielle Hypertonie, Myokardinfarkt, Koronare Herzkrankheit, Myokarditis und Kardiomyopathien dar. Sowohl biomechanische als auch neurohumorale Stimuli f{\"u}hren auf einer Reihe von Signalwegen zur Myokardhypertrophie, die als Gr{\"o}ßenzunahme postmitotischer Kardiomyozyten definiert ist. Zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat ist ein ubiquit{\"a}rer intrazellul{\"a}rer Signaltr{\"a}ger, der im kardiovaskul{\"a}ren System auf mindestens drei bekannten Wegen aus Guanosintriphosphat durch Abspaltung von Pyrophosphat synthetisiert wird. Die Synthese erfolgt unter anderem durch Aktivierung der partikul{\"a}ren, membranst{\"a}ndigen Guanylylzyklase A durch Atriales Natriuretisches Peptid oder „B-Typ" Natriuretisches Peptid und der Guanylyzyklase B, durch „C-Typ" Natriuretisches Peptid. Des Weiteren wird {\"u}ber neuronale, endotheliale, oder induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase Stickstoffmonoxid synthetisiert, welches die l{\"o}sliche, vorwiegend zytosolisch lokalisierte Guanylyzyklase aktiviert, die wiederum aus Guanosintriphosphat zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat synthetisiert. Das intrazellul{\"a}re zyklische 3´5´-Guanosinmonophosphat l{\"a}sst sich durch Behandlung mit Sildenafilcitrat, einem unter dem Markennamen Viagra® zur Therapie der Erektilen Dysfunktion und Revatio® zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie zugelassenem Pharmakon, erh{\"o}hen. Sildenafil hemmt die Phosphodiesterase 5A, ein unter anderem in Lunge, Kardiomyozyten, Kleinhirn und glatter Muskulatur vorkommendes Isoenzym. In der vorliegenden Dissertation wurden die kardialen Effekte des Phosphodiesterase 5-Inhibitors Sildenafil an zwei Mausmodellen mit funktionell gut kompensierter Herzhypertrophie getestet. Die mittlere Tagesdosis betrug 150 (Studie 1) bzw. 240 (Studie 2) mg/kg K{\"o}rpergewicht Sildenafil, in Anlehnung an publizierte Studien mit Nagern (Takimoto et al., 2005b). Diese Dosis wurde oral {\"u}ber vier (Studie 1) bzw. neun Wochen (Studie 2) zugef{\"u}hrt. Die mittlere Plasmakonzentration von Sildenafil lag mit 60 nM weit {\"u}ber dessen IC 50 (3,5 nM) zur Hemmung der PDE 5 in vitro. Studie 1 In der ersten Studie wurde die Nachlast des Herzens mittels operativer transverser Aortenkonstriktion um ca. 25 - 35 mmHg {\"u}ber vier Wochen erh{\"o}ht. Vergleichbare Anstiege des systolischen Blutdrucks werden in Patienten mit ausgepr{\"a}gter essenzieller arterieller Hypertonie gemessen. Nekropsie, echokardiographische, histologische und morphometrische Untersuchungen zeigten {\"u}bereinstimmend die Entwicklung einer konzentrischen Herzhypertrophie ohne interstitielle Fibrose. Echokardiographische Bestimmungen der linksventrikul{\"a}ren Funktion zeigten einen leichten Anstieg der Ejektionsfraktion bei unver{\"a}nderter fraktioneller Verk{\"u}rzung der Wand des linken Ventrikels. Proteinchemische Analysen an linksventrikul{\"a}ren Gewebeproben zeigen die Aktivierung von Signalwegen der Herzypertrophie, insbesondere der Mitogen-Aktivierten Protein Kinase ERK 1 / 2. Zusammengenommen belegen diese morphologischen, funktionellen und biochemischen Analysen, dass durch die moderate operative Aortenstenose die Entwicklung einer ausgepr{\"a}gten, aber funktionell gut kompensierten Linksherzhypertrophie induziert wurde. Die Entwicklung dieser Herzhypertrophie wurde durch Sildenafil nicht verhindert. Im Gegenteil, es zeigte sich unter der Gabe des Pharmakons sogar eine leichte Tendenz zur funktionellen Verschlechterung des linken Ventrikels, mit leicht reduzierter Ejektionsfraktion und gesteigertem Lungenfeuchtgewicht. Auch die kardiale Aktivierung des Hypertrophiesignalweges MAPK / ERK wurde durch Sildenafil nicht beeinflusst. Studie 2 In der zweiten Studie wurden die Effekte von Sildenafil an einem monogenetischen Mausmodell mit globaler Deletion der Guanylylzyklase-A (GC-A -/-), dem Rezeptor f{\"u}r Atriales natriuretisches Peptid, getestet. Wie zuvor in publizierten Studien gezeigt wurde, haben GC-A -/- M{\"a}use eine chronische arterielle Hypertonie, mit Anstiegen des systolischen Blutdrucks um 20 - 25 mmHg. Nekropsie, Echokardiographie, Histologie und Morphometrie ergaben {\"u}bereinstimmend, dass diese arterielle Hypertonie von einer ausgepr{\"a}gten globalen, funktionell gut kompensierten Herzhypertrophie mit leichter interstitieller Fibrose begleitet wurde. Unter der neunw{\"o}chigen Behandlung mit Sildenafil kam es zu einem signifikanten aber inkomplettem R{\"u}ckgang der systemischen arteriellen Hypertonie (um ca 8 - 10 mmHg). Trotz dieser hypotensiven Effekte wurden die Rechts- und Linksherzhypertrophie und die kardiale Fibrose der GC-A -/- Tiere durch Sildenafil nicht beeinflusst. Dagegen zeigte sich auch hier mittels Echokardiographie eine leichte Verschlechterung der linksventrikul{\"a}ren Funktion unter Sildenafil, mit Abnahmen der Ejektionsfraktion und der fraktionellen Verk{\"u}rzung des linken Ventrikels sowie einer Zunahme des endsystolischen Kammerdurchmessers. Zusammenfassend wurden die in der Literatur beschriebenen protektiven, kardialen antihypertrophen Effekte von Sildenafil in der vorliegenden experimentellen Dissertation nicht best{\"a}tigt.}, subject = {Linksherzhypertrophie}, language = {de} } @phdthesis{Boerner2010, author = {B{\"o}rner, Juliane}, title = {Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekund{\"a}ren Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erh{\"o}ht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-{\"u}berexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen k{\"o}nnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Dom{\"a}ne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten {\"u}bereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war als bei der ANP-abh{\"a}ngigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivit{\"a}t und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse best{\"a}tigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivit{\"a}t des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle tr{\"a}gt zum Verst{\"a}ndnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zus{\"a}tzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen m{\"o}glich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben k{\"o}nnen.}, subject = {Guanylatcyclase}, language = {de} } @phdthesis{MuellerBotz2010, author = {M{\"u}ller-Botz, Stephan}, title = {Mechanismus der schnellen Geninduktion von Egr-1 durch {\"O}strogen am Herzen : Ein Steroidhormon geht neue Wege}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51730}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {{\"O}strogen bewirkt in physiologischer Konzentration in Kardiomyozyten eine schnelle Induktion des Egr-1-Promotors. Dieser Effekt wird {\"u}ber die {\"O}strogenrezeptoren ER alpha und ER beta vermittelt. {\"U}berraschenderweise erfolgt die {\"o}strogenabh{\"a}ngige Genregulation von Egr-1 aber nicht {\"u}ber den klassischen Signalweg mittels Bindung des {\"O}strogenrezeptors an {\"o}strogenresponsive Elemente (ERE), sondern findet unter Bindung von Serumfaktor an serumresponsive Elemente (SRE) des Egr-1-Promotors unter Mitbeteiligung des ERK1/2-Signalweges statt. Am Beispiel der Egr-1-Induktion durch {\"O}strogen ließ sich die Bedeutung serumresponsiver Elemente (SRE) f{\"u}r die Genregulation durch {\"O}strogen aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit konnte damit ein neuartiger Signalweg bei der {\"o}strogenabh{\"a}ngigen schnellen Genaktivierung in Kardiomyozyten gezeigt werden.}, subject = {{\"O}strogene}, language = {de} } @phdthesis{Wohlfarth2010, author = {Wohlfarth, Verena}, title = {Albuminurie st{\"o}rt die Kollagenhom{\"o}ostase der proximalen Tubuluszellen des Opossums}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Ur{\"a}mie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinr{\"u}ckresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhom{\"o}ostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: F{\"u}r unsere Untersuchungen verwendeten wir {\"u}berwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche - wie auch die LLC-PK1 Zellen - die f{\"u}r die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - n{\"a}mlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 - besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erh{\"o}hter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. F{\"u}r Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivit{\"a}t (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhom{\"o}ostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivit{\"a}t der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition f{\"u}hrte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivit{\"a}t (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivit{\"a}t (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem R{\"u}ckgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellul{\"a}ren Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivit{\"a}t nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin f{\"u}hrte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhom{\"o}ostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus st{\"o}rt. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. F{\"u}r PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht daf{\"u}r nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gest{\"o}rte Matrixhom{\"o}ostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz f{\"u}hrt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose.}, subject = {Proteinurie}, language = {de} } @phdthesis{Stock2011, author = {Stock, Patrick Maria}, title = {Binding site contribution in high resolution records of nicotinic receptor channel currents}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71769}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the 'primed states' model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently.}, subject = {Nicotinischer Acetylcholinrezeptor}, language = {en} } @phdthesis{Fetting2011, author = {Fetting, Doreen [verh: Korb]}, title = {Novel Cav1.2 and PMCA4b interacting PDZ domain containing proteins}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66440}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {The voltage -gated calcium channel, Cav1.2, and the plasma membrane calcium ATPase, PMCA4b, play important roles in excitable and non-excitable cells. The central function of Cav1.2 is to regulate the calcium entry into cells upon depolarization, while PMCA4b is responsible for calcium extrusion and has an influence on cellular calcium homeostasis. Both proteins control fundamental functions in the heart and brain, but the specific functions and the precise mechanisms are still investigated. In order to identify new interaction partners that may regulate the activities of the Cav1.2 and the PMCA4b, we used three independent assays and co-localization studies. The assays, which were used are PDZ domain arrays (testing 124 different PDZ domains), GST pull-downs, and conventional immunoprecipitation assays. In the PDZ arrays, strongest interactions with Cav1.2 and PMCA4b were found for the PDZ domains of MAST-205, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3, and ZO-1. Additionally, we established interactions between Cav1.2 and the PDZ domains of NHERF1/2, Mint-2, and CASK. PMCA4b was observed to interact with Mint-2, and its interactions with Chapsyn-110 and CASK were confirmed. Furthermore, we validated interaction of Cav1.2 and PMCA4b with NHERF1, CASK, MAST-205 and MAGI-3 via immunoprecipitation. We also demonstrated direct interaction of the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS. We assumed that nNOS overexpression would reduce Ca2+ influx through Cav1.2. To address this question, we measured Ca2+ currents in stably transfected HEK 293 cells expressing the Cav1.2 (α1b and β2a subunit of the smooth muscle L-type calcium channel) and nNOS. It has been shown that NO modulates ion channel activity by nitrosylation of sulfhydryl groups on the channel protein. So we propose that the interaction between the C-terminus of Cav1.2 and the PDZ domain of nNOS inhibits the currents by an S-nitrosylation of the channel protein. All these interactions connect both proteins to signaling networks involved in signal transmission, cell adhesion, and apoptosis, which may help provide new hints about the physiological functions of Cav1.2 and PMCA4b in intra- and intercellular signaling.}, subject = {Calciumkanal}, language = {en} } @phdthesis{Eckert2011, author = {Eckert, Michaela Brigitte}, title = {Die Wirkung von Antidepressiva auf neuronale und kardiale Tandemporen-Kaliumkan{\"a}le}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65804}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Wirkung von Antidepressiva auf K2P-Kan{\"a}le. Sie stellen wie spannungsabh{\"a}ngige Ca2+, Na+ und K+-Kan{\"a}le als neuronale Ionenkan{\"a}le aufgrund ihrer Expressionsmuster und physiologischen Eigenschaften potentielle Zielproteine f{\"u}r Antidepressiva dar. Darum werden K2P-Kan{\"a}le in heterologen Expressionssystemen von klinisch verabreichten Antidepressiva inhibiert. Die K2P-Kan{\"a}le TREK-1, TASK-1 und THIK-1 zeigten sich in dieser Arbeit alle sensitiv auf das Antidepressivum Fluoxetin, welches die Kaliumstr{\"o}me der Kan{\"a}le unterschiedlich stark inhibierte. Hierbei lieferten die vorliegenden Untersuchungen den Nachweis, dass TREK-1 auf Fluoxetin am meisten, THIK-1 am wenigsten sensitiv reagiert. Der humane TREK-1 wird durch Fluoxetin in den Expressionssystemen Oozyten und HEK-Zellen zu fast 80\% inhibiert, wobei bei der humanen Zelllinie nur ein Zehntel der vorher eingesetzten Antidepressivakonzentration f{\"u}r die gleiche Inhibition des Ausw{\"a}rtsstroms notwendig war. Die vorliegende Arbeit weist Inhibitionen des Kanals bei einer Fluoxetinkonzentration von 1 µM nach, was der Serumkonzentration von depressiven Patienten entspricht. Zudem wird TREK-1 durch die Antidepressiva Maprotilin, Mirtazapin, Citalopram, Doxepin und Venlafaxin inhibiert, wobei letzteres kaum eine Wirkung zeigt. Alle verwendeten Antidepressiva nutzen die gleichen Angriffspunkte am Kanalprotein, da es bei einer Koapplikation mit einem weiteren Antidepressivum oder Benzodiazepin zu keiner Inhibitionsverst{\"a}rkung kommt. Die Interaktion zwischen Antidepressivum und Kanalprotein verl{\"a}uft mit großer Wahrscheinlichkeit direkt und ohne „second-messenger-Wege". Hierbei konnten die porenformende Region und der C-Terminus des Kanals als Interaktionspartner ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Translations-Initiaton generiert zwei unterschiedliche Proteinprodukte aus einem TREK-1 Transkript, eine lange Version des Proteins mit 426 Aminos{\"a}uren und zus{\"a}tzlich eine kurze Version mit 374 Aminos{\"a}uren, welcher die ersten 52 N-terminalen Aminos{\"a}uren fehlen. Die Fluoxetin-Sensitivit{\"a}t von TREK-1 [N52] verringert sich um 70\%. Dies verdeutlicht, dass die ersten 52 Aminos{\"a}uren essentiell zur TREK-1 Interaktion mit Antidepressiva beitragen.}, subject = {Kaliumkanal}, language = {de} } @phdthesis{Merkel2011, author = {Merkel, Carla Jennifer}, title = {Characterisation of Mena Promoter Activity and Protein Expression in Wild-type and Gene-trapped Mice}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-70414}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Proteins of the Ena/VASP protein family are important regulators of actin and participate in cell-cell and cell-matrix adhesions. To date, the physiological importance of Ena/VASP proteins for integrity of the cardiovascular system has remained unclear. To study cardiovascular functions of Mena and VASP, we used an established VASP knockout mouse in combination with a novel gene-trap-based model to ablate Mena function. In the mutated Mena mouse, the endogenous Mena gene is disrupted by the insertion of a β-galactosidase construct and β-galactosidase expression is under the control of the endogenous Mena promoter. X-gal staining of mouse organs revealed Mena promoter activity in smooth muscle layers of vessels, intestines and bronchioles, but also in cells of the brain, in cardiomyocytes and in the respiratory epithelium of bronchioles. In wild-type mice, Western blotting revealed differing protein expression patterns of VASP and Mena. Mena expression was observed in almost every tissue, predominantly in heart, lung, stomach, large intestine, testis, brain and eye. Additionally, the neuronalspecific Mena isoform was expressed in brain, eye, and slightly in heart and stomach. VASP protein, in contrast, was predominantly detected in spleen and thrombocytes. In gene-trapped mice, Mena expression was largely reduced in heart, lung and stomach but only slightly decreased in brain and testis. Immunofluorescence microscopy revealed colocalisation of Mena and F-actin at intercalated discs of cardiomyocytes and strong colocalisation of Mena and α- smooth-muscle-actin in vessels and bronchioles. Functional analysis of Mena/VASP-mutated and wild-type mice using electrocardiography suggested that the depletion of either Mena or VASP does not interfere with normal heart function. However, in double-deficient mice, the resting heart rate was significantly increased, probably reflecting a mechanism to compensate defects in ventricle contraction and to maintain a normal cardiac output. In agreement, cardiac catheter investigations suggested dilated cardiomyopathy in doubledeficient mice. Thus, although Western blot analysis showed differing protein expression patterns of Mena and VASP, these findings suggest that Mena and VASP mutually compensate for each other. Concerning Mena, we propose an important role of the protein in vessel walls, cardiomyocytes and bronchioles.}, subject = {Spectrin}, language = {en} } @phdthesis{Bauer2011, author = {Bauer, Boris Alexander}, title = {Induktion von NF-κB durch Albumin in immortalisierten humanen proximalen Tubuluszellen (IHKE-1)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56996}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Hintergurnd: Erh{\"o}hte glomerul{\"a}re Filtration von Proteinen im Rahmen chronoischer Nierenenerkrankungen geht mit tubulointerstitiellem Schaden einschließlich Entz{\"u}ndung und fortschreitendem Funktionsverlust der Nierenfunktion einher. Proteine wie Albumin scheinen dabei per se eine pathogenetische Rolle zu spielen. Der Transkriptionsfaktor nuclear factor kappa B (NF-kB) scheint an den durch Protein{\"u}berladung verursachten Pathomechanismen der Nierenentz{\"u}ndung beteiligt zu sein. Um die Albumin-induzierte Expression von NF-kB sowie die Expression des NF-kB-regulierten proinflammatorischen Zytokins Tumor Necrosis Faktor alpha (TNF-a) nach Exposition mit Albumin in humanen proximalen Tubuluszellen zu {\"u}berpr{\"u}fen, exponierten wir humane, von proximalen Tubuluszellen abstammende Zellen (IHKE-1) mit bovinem Serumalbumin (BSA: 50 und 500 microg/ml). Die NF-KB- und TNF-a-spezifische mRNA-Expression wurde durch RT-PCR bestimmt. NF-kB-spezifische Proteinexpression wurde mit Western-Blot-Verfahren analysiert. Ergebnisse: Albumin-induziert einen Anstieg der NF-kB-spezifischen mRNA-Expression und NF-kB-spezifischen Proteinexpression. Diese Effekte werden durch den Protein Kinase C-Inhibitor Bisindolylmaleimid und den Tyrosin Kinase Inhibitor Herbimycin A gehemmt. Ein Albumin.induzierter Anstieg der TNF-a-spezifischen mRNA-Expression als biologischer inflammatorischer Parameter war als mit der NF-B-Aktivit{\"a}t assoziiert messbar.}, subject = {Nierenfunktion}, language = {de} } @phdthesis{Dobler2011, author = {Dobler, Tina Melanie}, title = {Tandemporenkaliumkan{\"a}le in der Amygdala}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57043}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Neurone der medialen Amygdala spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von unkonditionierter Angst und aggressivem Verhalten (Nelson and Trainor, 2007). Ihre Erregbarkeit wird h{\"o}chstwahrscheinlich durch eine Hintergrundleitf{\"a}higkeit von K2P-Kan{\"a}len und ihrem molekularen Korrelat reguliert. Bisher sind 15 dieser K2P-Kan{\"a}le bekannt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Expression und die physiologische Funktion des TASK-3, einem s{\"a}ure-sensitivem K2P-Kanal, in dieser Gehirnregion untersucht. Bisher konnte die TASK-3-Expression durch in situ-Hybridisierungen in erwachsenen Ratten gezeigt werden (Karschin et al., 2001). Entsprechend konnten wir einen, dem TASK-3 {\"a}hnlichen Strom, durch elektrophysiologische Ganzzellmessungen in akuten Hirnschnitten nachweisen. Um die Beteiligung des TASK-3 an diesem Gesamtstrom zu {\"u}berpr{\"u}fen, verwendeten wir den selektiven TASK-3 Antagonisten Ruthenium Rot oder ver{\"a}nderten den extrazellul{\"a}ren pH-Wert auf pH 6,4. Ruthenium-Rot- bzw. pH-sensitive Neurone zeigten ein negativeres Ruhemembranpotential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) als die Neurone, die nicht sensitive f{\"u}r Ruthenium-Rot oder pH-Ver{\"a}nderungen waren (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). Zus{\"a}tzlich verst{\"a}rkte Ruthenium Rot die Aktionspotenzialfrequenz und die Aktionspotenzialbreite bei Stromapplikation in den Zellen mit einem positiveren Ruhemembranpotenzial. Unsere in situ-Hybridisierungen in C57/Bl6 M{\"a}usen zeigten eine starke Expression des TASK-3-Kanals in den Neuronen der medialen Amygdala. Darum wurde die Erregbarkeit von TASK-3 Wildtypneuronen mit denen von TASK-3-Knockoutneurone verglichen. Wir konnten einen s{\"a}uresensitiven Kaliumstrom in den TASK-3 Wildtypzellen identifizieren, welche in den TASK-3 Knockoutzellen abwesend war. {\"U}berraschenderweise tauchten keine Unterschiede in der Aktionspotenzialform, dem Ruhemembranpotenzial oder des Rheobasestrom auf. Verhaltenstests zeigten, dass TASK-3 Wildtyp M{\"a}use auf die Pr{\"a}sentation von TMT, ein Duftstoff aus den F{\"a}kalien von F{\"u}chsen, st{\"a}rker freezen, als TASK-3 Knockoutm{\"a}use. Dies zeigt, dass ein Fehlen des TASK-3 zu einer geringeren Furchtantwort beitr{\"a}gt. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass TASK-3 bei der zellul{\"a}ren Erregbarkeit von Neuronen der medialen Amygdala von Ratten eine große Rolle spielt. Diese TASK-3-Kan{\"a}le sind in der medialen Amygdala von M{\"a}usen ebenso exprimiert, wo sie zur Verarbeitung von Furchtverhalten beitragen.}, subject = {Kaliumkanal}, language = {de} } @phdthesis{Froehlich2011, author = {Fr{\"o}hlich, Matthias}, title = {Die funktionelle Bedeutung der Heteromerisierung von Serotonin-1A und Serotonin-7 Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55508}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Heterodimerisierung von G- Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) stellt ein aktuelles Forschungsgebiet dar, das molekulare Erkl{\"a}rungsm{\"o}glichkeiten f{\"u}r die Vielfalt der Signalwege {\"u}ber solche Rezeptoren aufzeigt. Die genauen Funktionen diese Konstrukte in vivo sind bisher erst in Ans{\"a}tzen erforscht, ebenso wenig die molekularbiologischen Mechanismen. F{\"u}r die beiden Serotoninrezeptoren 5-HT1A und 5-HT7 konnte Heterodimerisierung molekular nachgewiesen werden, in ihren physiologischen Mechanismen und Effekten sollte daher eine Charakterisierung vorgenommen werden. Mittels elektrophysiologischer Messverfahren wurden Str{\"o}me an dem heterologen Expressionsmodell der Oozyten des Krallenfrosches Xenopus laevis mittels Voltage-Clamp Technik an Kaliumionenkan{\"a}len (Kir3 und TASK-1) gemessen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die heterodimere Koexpression beider Rezeptoren eine signifikante Reduktion des Rezeptor-aktivierten Kanalstroms im Vergleich zur homomeren Expression zur Folge hatte. Weitere Experimente konnten dann zeigen, dass diese Effekte spezifisch f{\"u}r dieses Rezeptorheterodimer sind, und dass die Effekte von der Dosis bzw. dem Verh{\"a}ltnis der exprimierten cRNA abh{\"a}ngen. In Fluoreszenzmessung konnte zudem gezeigt werden, dass die Reduktion der Stromamplitude in der heterodimeren Expression nicht auf eine Reduktion von Kanalproteinen in der Zellmembran zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Zur weiteren Charakterisierung des bisher erst in Ans{\"a}tzen erforschten 5-HT7 Rezeptors wurde dieser abschließend mit einem ß- adrenergen Rezeptor verglichen, der {\"u}ber den gleichen Signalweg bzw. Ionenkanal funktioniert. Auch hier zeigte sich eine signifikante Reduktion des Kanalstroms beim 5-HT7 Rezeptor. Die physiologische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begr{\"u}ndet, dass ein weiterf{\"u}hrendes Verst{\"a}ndnis von 5-HT Rezeptor vermittelten Signalwegen, insbesondere von der Bedeutung und den Mechanismen ihrer Heterodimersierung, neue pathophysiologische Zusammenh{\"a}nge verdeutlicht. Speziell im Hinblick auf Erkrankungen, die mit den 5-HT Rezeptoren assoziiert sind, wie etwa Depressionen und Angstst{\"o}rungen, soll sich hieraus die M{\"o}glichkeit spezifischerer Therapien ergeben.}, subject = {Heteromerisierung}, language = {de} } @phdthesis{Erxleben2011, author = {Erxleben, Franziska}, title = {cDNA-Microarray-Analyse von ZNS-Kaliumkanal defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65640}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips", die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchf{\"u}hrung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen f{\"u}r die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen M{\"o}glichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach m{\"o}glichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsverm{\"o}gen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkan{\"a}len mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkan{\"a}le und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse m{\"o}glich macht. Die Tatsache, dass S{\"a}ugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkan{\"a}len entwickelt haben und im st{\"a}ndigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kan{\"a}len so interessant und wichtig f{\"u}r die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verf{\"u}gung, die es erm{\"o}glicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und m{\"o}gliche Kompensationsvorg{\"a}nge aufzudecken. Damit k{\"o}nnen Zusammenh{\"a}nge ermittelt werden, die die Grundlage f{\"u}r weitere Forschungen sein k{\"o}nnen, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln k{\"o}nnen.}, subject = {Maus}, language = {de} } @phdthesis{Kraeussling2011, author = {Kr{\"a}ußling, Michael}, title = {Analysis on division patterns and transcriptional activity in embryos from medaka "Oryzias latipes" before the midblastula transition}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-66911}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Das Studium der Entwicklung von Tieren ist eine der {\"a}ltesten Disziplinen in der Biologie. Die gesammelten Daten von unz{\"a}hligen Untersuchungen an den verschiedensten Spezies wurden dazu benutzt, um ein generelles Verst{\"a}ndnis des tierischen Lebenszykluses zu formulieren. Ein wichtiges Ergebnis der intensiven Untersuchungen war vor etwa einem Jahrhundert die Entdeckung spezifischer morphologischer Ver{\"a}nderungen, die sich w{\"a}hrend der Teilungsphase, der Zeitperiode die der Befruchtung und Aktivierung des Eies am Anfang der Embryogenese folgt, vollziehen. Diese Befunde f{\"u}hrten schlussendlich zur Formulierung des Konzepts einer „Mid-Blastula Transition" (MBT). Bisher gibt es nur eine Theorie die die Regulierung der MBT in befriedigender Weise erkl{\"a}rt. Dies ist das Model des Kern/Plasma-Verh{\"a}ltnis, welches sich aus dem Verh{\"a}ltnis DNA-Menge zu Zytoplasmavolumen ableitet. Es erkl{\"a}rt die MBT-Aktivierung durch bisher unbekannte, maternal deponierte Faktoren im Ei, welche die MBT Aktivierung kontrollieren, deren Konzentration allerdings mit jeder Zellteilung verd{\"u}nnt wird, bis sie schließlich ihre blockierende Funktion verloren haben. Zwar wurde die Existenz dieses Mechanismuses schon in zahlreichen Spezies experimentell bewiesen, allerdings bleibt er nur eine ungenaue Beschreibung der ablaufenden Prozesse und l{\"a}sst weiterhin viele Fragen unbeantwortet. Vor diesem Hintergrund hat diese Arbeit gezeigt, dass die Zellzyklen in Embryonen von Medaka (Oryzias latipes) ihre Synchronit{\"a}t schon nach dem vierten oder f{\"u}nften Teilung verlieren, und diese durch ein Teilungsmuster ersetzt wird, das als „metasynchron" bezeichnet wird. In diesem Teilungsmuster verlaufen die Zellteilungen in Wellen, die im Zentrum des Embryos beginnen und sich von dort nach außen hin radial ausbreiten. Noch ist der Sinn einer auf diese Art verlaufenden Zellteilung unbekannt, auch wenn es verschiedene Theorien gibt die versuchen den zugrunde liegenden Mechanismus zu erkl{\"a}ren. Allen voran steht die Theorie eines unterschiedlichen Zugangs zu Faktoren innerhalb des Dotters. Allerdings wird diese Theorie durch die Beobachtungen in verformten Embryonen wiederlegt, in denen sich die Teilungswellen von einer Seite des Embryos zur gegen{\"u}berliegenden Seite ausgebreitet haben. Somit bleibt der Mechanismus f{\"u}r diese Art der Zellteilung weiterhin unklar. Nicht zu vergessen ist, dass diese deformierten Embryonen eine der m{\"o}glichen Konsequenzen asymmetrischer Furchung w{\"a}hrend einer fr{\"u}hen Zellteilung sind. Asymmetrische Teilungen treten in Medaka in einer erheblichen Anzahl von Embryonen auf und haben einen direkten Einfluss auf die gleichm{\"a}ßige Verteilung des Zytoplasma. Leider war es nicht m{\"o}glich die Auswirkungen einer solchen ungleichm{\"a}ßigen Verteilung aufzudecken, auch wenn man davon ausgehen kann, dass ein ausreichend großes Ungleichgewicht zu unterschiedlichen Zeitpunkten der MBT-Aktivierung in verschiedenen Zellgruppen f{\"u}hren m{\"u}sste. {\"A}hnliche Beobachtungen wurden bereits in anderen Spezies gemacht, und es wurde vermutet, dass diese in ungleichm{\"a}ßigen Zellteilungen begr{\"u}ndet lagen. Weiterhin wurde bewiesen, dass die zygotische Transkription schon wesentlich vor dem bisher angenommenen fr{\"u}hesten Zeitpunkt aktiv ist. Dar{\"u}ber hinaus wurden Hinweise gefunden, die darauf hindeuten, dass die Transkription in Embryonen von Medaka in zwei Schritten einsetzt. Der erste Zeitpunkt ist das 16-Zellen-Stadium, in dem die ersten Zellen identifiziert wurden, die Phosphorylierung f{\"u}r RNAPII zeigten, und der zweite das64-Zellen Stadium, in dem der Anteil an p-RNAPII positiven Zellen signifikant anstieg. Ein schrittweiser Anstieg der Transkription wurde bereits in anderen Spezies beobachtet, auch wenn in diesen F{\"a}llen nur eine Erh{\"o}hung der mRNA-Menge festgestellt wurde, und nicht die unterschiedliche Anzahl an transkriptionell aktiven Zellen untersucht wurde.Zusammenfassend best{\"a}tigen und erweitern die hier gezeigten Daten die grundliegenden Kenntnisse {\"u}ber die Prozesse vor und w{\"a}hren der MBT, liefern dar{\"u}ber hinaus aber auch Anzeichen f{\"u}r viele Prozesse vor und w{\"a}hrend der MBT, die nur wenig oder gar nicht verstanden sind.}, subject = {Japank{\"a}rpfling}, language = {en} } @phdthesis{Klaiber2011, author = {Klaiber, Michael}, title = {Bedeutung der cGMP-abh{\"a}ngigen Protein Kinase I f{\"u}r die kardialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69990}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an M{\"a}usen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellul{\"a}ren Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie beg{\"u}nstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zun{\"a}chst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Str{\"o}me (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum f{\"u}r Molekulare Neurobiologie, Universit{\"a}t Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellul{\"a}ren Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilit{\"a}t (Zellverk{\"u}rzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilit{\"a}t isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II f{\"u}r die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ...}, subject = {Atriales natriuretisches Hormon}, language = {de} } @phdthesis{Groneberg2011, author = {Groneberg, Dieter}, title = {Funktion der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der glatten Muskulatur}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67689}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die Stickstoffmonoxid (NO)-cGMP-Signalkaskade spielt eine entscheidende Rolle in der Kontrolle des glatten Muskeltonus. NO ist einer der wichtigsten vaskul{\"a}ren Faktoren f{\"u}r die Relaxation der Blutgef{\"a}ße sowie f{\"u}r die Regulation des Blutdruckes und fungiert ebenfalls als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter im gastrointestinalen Trakt. Es wirkt haupts{\"a}chlich {\"u}ber die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Deletion der ß1-Untereinheit in M{\"a}usen f{\"u}hrt zu einem vollst{\"a}ndigen NO-GC-Knockout (GCKO). GCKO-M{\"a}use zeigen keine NO-induzierte Relaxation der vaskul{\"a}ren und gastrointestinalen glatten Muskulatur. Die M{\"a}use zeigen eine arterielle Hypertonie und eine verl{\"a}ngerte Magen-Darm-Transportzeit, die in eine gastrointestinale Dysfunktion m{\"u}ndet. Allerdings erlaubt eine vollst{\"a}ndige Deletion der NO-GC in den M{\"a}usen keine Identifikation des Zell- bzw. Gewebe-Typs, der f{\"u}r den erh{\"o}hten Blutdruck und die gastrointestinale Dysfunktion verantwortlich ist. Um die relative Beteiligung der glatten Muskelzellen an der Hypertonie und der gest{\"o}rten Darm-Motilit{\"a}t zu bestimmen, wurden Glattmuskel-spezifische Knockout-M{\"a}use f{\"u}r die ß1-Untereinheit der NO-GC (SM-GCKO) generiert. Die SM-GCKO-M{\"a}use entwickelten im Verlauf der Deletion eine arterielle Hypertonie in Kombination mit einem Verlust der NO-induzierten Glattmuskelrelaxation. Diese Daten zeigen, dass die Deletion der NO-GC in den glatten Muskelzellen v{\"o}llig ausreichend ist, eine Hypertonie zu erzeugen. {\"U}berraschenderweise ist die Darm-Motilit{\"a}t der SM-GCKO-M{\"a}use im Vergleich zu den WT-M{\"a}usen unver{\"a}ndert. In gastrointestinaler Muskulatur exprimieren neben den glatten Muskelzellen auch die interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) die NO-GC. Mithilfe einer Cre-spezifischen Maus f{\"u}r ICC wurde eine Mauslinie generiert, der die NO-GC in beiden Zelltypen fehlt. Der gastrointestinale Ph{\"a}notyp dieser Doppel-Knockouts {\"a}hnelt dem der totalen GCKO-Tiere: Die nitrerge Relaxation fehlt und die Magen-Darm-Transportzeit ist verl{\"a}ngert. Zusammenfassend f{\"u}hrt eine Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und gleichzeitig in den ICC zu einer vollst{\"a}ndigen Unterbrechung der nitrergen Relaxation in GI Trakt.}, subject = {Knockout }, language = {de} } @phdthesis{Pauli2012, author = {Pauli, Martin}, title = {Bildgebung Aktiver Zonen : Lichtmikroskopische Methoden zur Darstellung pr{\"a}synaptischer AktiverZonen in lebendem und fixiertem Gewebe}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77630}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Ziel dieser Arbeit war es, strukturelle Ver{\"a}nderungen pr{\"a}synaptischer Aktiver Zonen als m{\"o}gliches Korrelat synaptischer Plastizit{\"a}t zu detektieren. Damit soll die Hypothese getestet werden, dass strukturelle Plastizit{\"a}t Aktiver Zonen eine zentrale Rolle bei der Informationsverarbeitung im Gehirn und bei Lern- und Ged{\"a}chtnisprozessen spielt. Dazu war es notwendig Methoden zu etablieren, die die strukturelle Analyse Aktiver Zonen und deren Ver{\"a}nderung in vitalem Gewebe erm{\"o}glichen. Um die Untersuchungen in einem Gewebe mit plastischen Eigenschaften durchzuf{\"u}hren, wurden Methoden zur Herstellung organotypischer hippocampaler Hirnschnittkulturen etabliert, da hippokampale Moosfasersynapsen ausgepr{\"a}gte pr{\"a}synaptische Plastizit{\"a}t aufweisen (Bliss und Collingridge, 1993). Durch Einzelzellelektroporation wurde es m{\"o}glich, individuelle Neurone mit Transgenen zur Markierung der gesamten Zelle (DsRed) und synaptischer Substrukturen wie Aktive Zonen (z.B.: GFP-CAST, einem Fluorophor-markierten AZ-Protein) zu transfizieren. Mit konfokaler Bildgebung transfizierter Zellen konnten strukturierte Anreicherungen von GFP-CAST in Moosfaserboutons dargestellt werden. Konfokale Bildgebung von Doppelimmunfluoreszenzf{\"a}rbungen zur detaillierten Analyse der Proteinlokalisation zeigte ein diffraktionsbedingtes Aufl{\"o}sungsdefizit, das auch durch die Anwendung von STED-Mikroskopie nicht zufriedenstellend gel{\"o}st werden konnte. Um eine pr{\"a}zise Karte synaptischer Proteine zu erstellen, wurde hochaufl{\"o}sende Mikroskopie (dSTORM) mit einer lateralen r{\"a}umlichen Aufl{\"o}sung von 20 nm etabliert. Dabei erwiesen sich die ausgepr{\"a}gte Plastizit{\"a}t, die hohe Dichte an Aktiven Zonen und die variable Gestalt der Boutons im hippokampalen Pr{\"a}parat als problematisch. Aus diesem Grund wurde die elektronenmikroskopisch gut charakterisierte neuromuskul{\"a}re Endplatte mit ihrer symmetrischen molekularen Struktur als Pr{\"a}parat f{\"u}r dSTORM verwendet. An der Endplatte konnte die molekulare Organisation der Aktiven-Zonen-Proteine Piccolo und Bassoon dargestellt werden. Zudem konnten erstmals die M{\"u}ndungen postsynaptischer Falten lichtmikroskopisch aufgel{\"o}st werden. So gelang es Werkzeuge zu etablieren, die mit lichtmikroskopischen Methoden die Darstellung der Architektur Aktiver Zonen mit molekularer Aufl{\"o}sung erm{\"o}glichen. Die Herausforderung wird es sein, diese neue Dimension in funktionellem Kontext zu nutzen. Die experimentellen Grundlagen dazu wurden durch eine spezielle Badkammer und die Etablierung von Rollertubekulturen bereits gelegt. Dabei erm{\"o}glicht dSTORM die Adressierung quantitativer Fragestellungen bis hin zur Bestimmung der Molek{\"u}lanzahl.}, subject = {Hippokampus}, language = {de} } @article{ThomaWischmeyerOffenetal.2012, author = {Thoma, Eva C. and Wischmeyer, Erhard and Offen, Nils and Maurus, Katja and Sir{\´e}n, Anna-Leena and Schartl, Manfred and Wagner, Toni U.}, title = {Ectopic expression of Neurogenin 2 alone is sufficient to induce differentiation of embryonic stem cells into mature neurons}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75862}, year = {2012}, abstract = {Recent studies show that combinations of defined key developmental transcription factors (TFs) can reprogram somatic cells to pluripotency or induce cell conversion of one somatic cell type to another. However, it is not clear if single genes can define a cells identity and if the cell fate defining potential of TFs is also operative in pluripotent stem cells in vitro. Here, we show that ectopic expression of the neural TF Neurogenin2 (Ngn2) is sufficient to induce rapid and efficient differentiation of embryonic stem cells (ESCs) into mature glutamatergic neurons. Ngn2-induced neuronal differentiation did not require any additional external or internal factors and occurred even under pluripotency-promoting conditions. Differentiated cells displayed neuron-specific morphology, protein expression, and functional features, most importantly the generation of action potentials and contacts with hippocampal neurons. Gene expression analyses revealed that Ngn2-induced in vitro differentiation partially resembled neurogenesis in vivo, as it included specific activation of Ngn2 target genes and interaction partners. These findings demonstrate that a single gene is sufficient to determine cell fate decisions of uncommitted stem cells thus giving insights into the role of key developmental genes during lineage commitment. Furthermore, we present a promising tool to improve directed differentiation strategies for applications in both stem cell research and regenerative medicine.}, subject = {Physiologie}, language = {en} } @phdthesis{Boerner2012, author = {B{\"o}rner, Sebastian}, title = {Die endothelialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) sind an der akuten Regulation des arteriellen Blutdrucks und des Blutvolumens beteiligt}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85351}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ANP {\"u}ber die Aktivierung der endothelialen Guanylyl Cyklase A (GC-A) akut die Permeabilit{\"a}t f{\"u}r Albumin an postkapill{\"a}ren Venolen stimuliert. Durch diesen Mechanismus ist ANP neben der chronischen auch an der akuten Reduktion des Plasmavolumens und des systolischen arteriellen Blutdrucks beteiligt. Aufgrund der wichtigen extrarenalen endothelialen Effekte stellt ANP das einzige hypovol{\"a}mische Hormon im Organismus dar und ist somit ein bedeutender physiologischer Regulator der transvaskul{\"a}ren Volumenhom{\"o}ostase. Jedoch sind diese Effekte deutlich von denen der vasoaktiven Substanzen, wie z. B. Histamin oder Thrombin und anderer diuretisch wirkender Substanzen, wie z. B. Schleifendiuretika, abzugrenzen. Vermutlich wird der permeabilit{\"a}tssteigernde Effekt von ANP durch die beobachtete gesteigerte PKG- und PKA-abh{\"a}ngige Phosphorylierung von VASP vermittelt, wodurch m{\"o}glicherweise die parazellul{\"a}re Permeabilit{\"a}t selektiv f{\"u}r Albumin gesteigert wird. Den gegenregulatorischen Mechanismus zur endothelialen GC-A stellt der NPR-C dar. Durch diesen erfolgt eine verminderte PKA- und PKG-abh{\"a}ngige Phosphorylierung von VASP, was durch die ANP-Infusion an EC GC-A KO M{\"a}usen beobachtet wurde und zu einer Reduktion der physiologischen Permeabilit{\"a}t f{\"u}r Albumin an den postkapill{\"a}ren Venolen f{\"u}hren k{\"o}nnte. Somit wird wahrscheinlich durch diesen Mechanismus das Plasmavolumen, aber nicht der systolische arterielle Blutdruck in vivo gesteigert und eine {\"u}bersteigerte Reaktion der GC-A verhindert. Aufgrund der enormen Bedeutung des ANP/GC-A Systems f{\"u}r die Modulation der endothelialen Permeabilit{\"a}t und die akuten sowie chronischen Regulation des Plasmavolumens und arteriellen Blutdrucks besitzt es bei Dysfunktion eine bedeutende klinische Relevanz. Denn durch eine verminderte Sekretion von ANP oder der Dysfunktion des endothelialen GC-A-Rezeptors, durch verschiedene Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) oder Desensitisierung, kann dieses System an der Entstehung der essentiellen Hypertonie oder der Hypervol{\"a}mie bzw. Hypernatri{\"a}mie bei herzinsuffizienten Patienten beteiligt sein.}, subject = {Atriales natriuretisches Hormon}, language = {de} } @article{FrantzKlaiberBabaetal.2013, author = {Frantz, Stefan and Klaiber, Michael and Baba, Hideo A. and Oberwinkler, Heinz and V{\"o}lker, Katharina and Gaßner, Birgit and Bayer, Barbara and Abeßer, Marco and Schuh, Kai and Feil, Robert and Hofmann, Franz and Kuhn, Michaela}, title = {Stress-dependent dilated cardiomyopathy in mice with cardiomyocyte-restricted inactivation of cyclic GMP-dependent protein kinase I}, series = {European Heart Journal}, volume = {34}, journal = {European Heart Journal}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134693}, pages = {1233-1244}, year = {2013}, abstract = {Aims: Cardiac hypertrophy is a common and often lethal complication of arterial hypertension. Elevation of myocyte cyclic GMP levels by local actions of endogenous atrial natriuretic peptide (ANP) and C-type natriuretic peptide (CNP) or by pharmacological inhibition of phosphodiesterase-5 was shown to counter-regulate pathological hypertrophy. It was suggested that cGMP-dependent protein kinase I (cGKI) mediates this protective effect, although the role in vivo is under debate. Here, we investigated whether cGKI modulates myocyte growth and/or function in the intact organism. Methods and results: To circumvent the systemic phenotype associated with germline ablation of cGKI, we inactivated the murine cGKI gene selectively in cardiomyocytes by Cre/loxP-mediated recombination. Mice with cardiomyocyte-restricted cGKI deletion exhibited unaltered cardiac morphology and function under resting conditions. Also, cardiac hypertrophic and contractile responses to β-adrenoreceptor stimulation by isoprenaline (at 40 mg/kg/day during 1 week) were unaltered. However, angiotensin II (Ang II, at 1000 ng/kg/min for 2 weeks) or transverse aortic constriction (for 3 weeks) provoked dilated cardiomyopathy with marked deterioration of cardiac function. This was accompanied by diminished expression of the \([Ca^{2+}]_i\)-regulating proteins SERCA2a and phospholamban (PLB) and a reduction in PLB phosphorylation at Ser16, the specific target site for cGKI, resulting in altered myocyte \(Ca^{2+}_i\) homeostasis. In isolated adult myocytes, CNP, but not ANP, stimulated PLB phosphorylation, \(Ca^{2+}_i\)-handling, and contractility via cGKI. Conclusion: These results indicate that the loss of cGKI in cardiac myocytes compromises the hypertrophic program to pathological stimulation, rendering the heart more susceptible to dysfunction. In particular, cGKI mediates stimulatory effects of CNP on myocyte \(Ca^{2+}_i\) handling and contractility.}, language = {en} } @article{KorbTngMilenkovicetal.2013, author = {Korb, Doreen and Tng, Priscilla Y. and Milenkovic, Vladimir M. and Reichhart, Nadine and Strauss, Olaf and Ritter, Oliver and Fischer, Tobias and Benz, Peter M. and Schuh, Kai}, title = {Identification of PDZ domain containing proteins interacting with \(Ca_v1.2\) and PMCA4b}, series = {ISRN Cell Biology}, journal = {ISRN Cell Biology}, number = {Article ID 265182}, doi = {10.1155/2013/265182}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-130585}, pages = {16}, year = {2013}, abstract = {PDZ (PSD-95/Disc large/Zonula occludens-1) protein interaction domains bind to cytoplasmic protein C-termini of transmembrane proteins. In order to identify new interaction partners of the voltage-gated L-type \(Ca^{2+}\) channel Cav1.2 and the plasma membrane \(Ca^{2+}\) ATPase 4b (PMCA4b), we used PDZ domain arrays probing for 124 PDZ domains. We confirmed this byGST pulldowns and immunoprecipitations. In PDZ arrays, strongest interactionswith \(Ca_v1.2\) and PMCA4b were found for the PDZ domains of SAP-102, MAST-205, MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3, and ZO-1. We observed binding of the \(Ca_v1.2\) C-terminus to PDZ domains of NHERF1/2, Mint-2, and CASK. PMCA4b was observed to interact with Mint-2 and its known interactions with Chapsyn-110 and CASK were confirmed. Furthermore, we validated interaction of \(Ca_v1.2\) and PMCA4b with NHERF1/2, CASK,MAST-205 and MAGI-3 viaimmunoprecipitation. We also verified the interaction of \(Ca_v1.2\) and nNOS and hypothesized that nNOS overexpression might reduce \(Ca^{2+}\) influx through \(Ca_v1.2\). To address this, we measured \(Ca^{2+}\) currents in HEK 293 cells co-expressing \(Ca_v1.2\) and nNOS and observed reduced voltage-dependent \(Ca_v1.2\) activation. Taken together, we conclude that \(Ca_v1.2\) and PMCA4b bind promiscuously to various PDZ domains, and that our data provides the basis for further investigation of the physiological consequences of these interactions.}, language = {en} } @article{LjaschenkoEhmannKittel2013, author = {Ljaschenko, Dmitrij and Ehmann, Nadine and Kittel, Robert J.}, title = {Hebbian Plasticity Guides Maturation of Glutamate Receptor Fields In Vivo}, series = {Cell Reports}, volume = {3}, journal = {Cell Reports}, number = {5}, doi = {10.1016/j.celrep.2013.04.003}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-128804}, pages = {1407-1413}, year = {2013}, abstract = {Synaptic plasticity shapes the development of functional neural circuits and provides a basis for cellular models of learning and memory. Hebbian plasticity describes an activity-dependent change in synaptic strength that is input-specific and depends on correlated pre- and postsynaptic activity. Although it is recognized that synaptic activity and synapse development are intimately linked, our mechanistic understanding of the coupling is far from complete. Using Channelrhodopsin-2 to evoke activity in vivo, we investigated synaptic plasticity at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation increased postsynaptic sensitivity by promoting synapse- specific recruitment of GluR-IIA-type glutamate receptor subunits into postsynaptic receptor fields. Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses whose activity failed to evoke substantial postsynaptic depolarization. Uniting these results with developmental GluR-IIA dynamics provides a comprehensive physiological concept of how Hebbian plasticity guides synaptic maturation and sparse transmitter release controls the stabilization of the molecular composition of individual synapses.}, language = {en} } @article{RittnerHackelPflueckeetal.2013, author = {Rittner, Heike Lydia and Hackel, Dagmar and Pfl{\"u}cke, Diana and Neumann, Annick and Viebahn, Johannes and Mousa, Shaaban and Wischmeyer, Erhard and Roewer, Norbert and Brack, Alexander}, title = {The Connection of Monocytes and Reactive Oxygen Species in Pain}, series = {PLoS ONE}, journal = {PLoS ONE}, doi = {10.1371/journal.pone.0063564}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96669}, year = {2013}, abstract = {The interplay of specific leukocyte subpopulations, resident cells and proalgesic mediators results in pain in inflammation. Proalgesic mediators like reactive oxygen species (ROS) and downstream products elicit pain by stimulation of transient receptor potential (TRP) channels. The contribution of leukocyte subpopulations however is less clear. Local injection of neutrophilic chemokines elicits neutrophil recruitment but no hyperalgesia in rats. In meta-analyses the monocytic chemoattractant, CCL2 (monocyte chemoattractant protein-1; MCP-1), was identified as an important factor in the pathophysiology of human and animal pain. In this study, intraplantar injection of CCL2 elicited thermal and mechanical pain in Wistar but not in Dark Agouti (DA) rats, which lack p47phox, a part of the NADPH oxidase complex. Inflammatory hyperalgesia after complete Freund's adjuvant (CFA) as well as capsaicin-induced hyperalgesia and capsaicin-induced current flow in dorsal root ganglion neurons in DA were comparable to Wistar rats. Macrophages from DA expressed lower levels of CCR2 and thereby migrated less towards CCL2 and formed limited amounts of ROS in vitro and 4-hydroxynonenal (4-HNE) in the tissue in response to CCL2 compared to Wistar rats. Local adoptive transfer of peritoneal macrophages from Wistar but not from DA rats reconstituted CCL2-triggered hyperalgesia in leukocyte-depleted DA and Wistar rats. A pharmacological stimulator of ROS production (phytol) restored CCL2-induced hyperalgesia in vivo in DA rats. In Wistar rats, CCL2-induced hyperalgesia was completely blocked by superoxide dismutase (SOD), catalase or tempol. Likewise, inhibition of NADPH oxidase by apocynin reduced CCL2-elicited hyperalgesia but not CFA-induced inflammatory hyperalgesia. In summary, we provide a link between CCL2, CCR2 expression on macrophages, NADPH oxidase, ROS and the development CCL2-triggered hyperalgesia, which is different from CFA-induced hyperalgesia. The study further supports the impact of CCL2 and ROS as potential targets in pain therapy.}, language = {en} } @article{SirenStetterHirschbergetal.2013, author = {Sir{\´e}n, Anna-Leena and Stetter, Christian and Hirschberg, Markus and Nieswandt, Bernhard and Ernestus, Ralf-Ingo and Heckmann, Manfred}, title = {An experimental protocol for in vivo imaging of neuronal structural plasticity with 2-photon microscopy in mice}, series = {Experimental \& Translational Stroke Medicine}, journal = {Experimental \& Translational Stroke Medicine}, doi = {10.1186/2040-7378-5-9}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96908}, year = {2013}, abstract = {Introduction Structural plasticity with synapse formation and elimination is a key component of memory capacity and may be critical for functional recovery after brain injury. Here we describe in detail two surgical techniques to create a cranial window in mice and show crucial points in the procedure for long-term repeated in vivo imaging of synaptic structural plasticity in the mouse neocortex. Methods Transgenic Thy1-YFP(H) mice expressing yellow-fluorescent protein (YFP) in layer-5 pyramidal neurons were prepared under anesthesia for in vivo imaging of dendritic spines in the parietal cortex either with an open-skull glass or thinned skull window. After a recovery period of 14 days, imaging sessions of 45-60 min in duration were started under fluothane anesthesia. To reduce respiration-induced movement artifacts, the skull was glued to a stainless steel plate fixed to metal base. The animals were set under a two-photon microscope with multifocal scanhead splitter (TriMScope, LaVision BioTec) and the Ti-sapphire laser was tuned to the optimal excitation wavelength for YFP (890 nm). Images were acquired by using a 20×, 0.95 NA, water-immersion objective (Olympus) in imaging depth of 100-200 μm from the pial surface. Two-dimensional projections of three-dimensional image stacks containing dendritic segments of interest were saved for further analysis. At the end of the last imaging session, the mice were decapitated and the brains removed for histological analysis. Results Repeated in vivo imaging of dendritic spines of the layer-5 pyramidal neurons was successful using both open-skull glass and thinned skull windows. Both window techniques were associated with low phototoxicity after repeated sessions of imaging. Conclusions Repeated imaging of dendritic spines in vivo allows monitoring of long-term structural dynamics of synapses. When carefully controlled for influence of repeated anesthesia and phototoxicity, the method will be suitable to study changes in synaptic structural plasticity after brain injury.}, language = {en} } @phdthesis{Lies2013, author = {Lies, Barbara Christiane}, title = {Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85499}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung f{\"u}r das vaskul{\"a}re System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht haupts{\"a}chlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in M{\"a}usen resultiert in einem vollst{\"a}ndigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-{\"a}hnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges f{\"u}r die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskul{\"a}ren Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) f{\"u}hrt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. {\"U}berraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterf{\"u}hrende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie n{\"a}hergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, w{\"a}hrend sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungekl{\"a}rt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivit{\"a}t der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollst{\"a}ndigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivit{\"a}t: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die St{\"a}rke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren k{\"o}nnen. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis f{\"u}r cGMP unabh{\"a}ngige Effekte nutzen sollte.}, subject = {Glatte Muskulatur}, language = {de} } @phdthesis{Karlisch2013, author = {Karlisch, Kaja}, title = {Die Rolle der PDE3 im cGMP/cAMP-Crosstalk in NO-GC-defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-98857}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist der wichtigste Rezeptor f{\"u}r das freigesetzte Signalmolek{\"u}l NO und katalysiert die Bildung des second Messenger cGMP. Die NO/cGMP Signalkaskade ist im kardiovaskul{\"a}ren System essentiell f{\"u}r die Hemmung der Thrombozytenaggregation und des Tonus der glatten Gef{\"a}ßmuskulatur und tr{\"a}gt damit zur Regulation des Blutdrucks bei. In der Arbeitsgruppe wurden Mauslinien generiert, bei denen die NO-GC ubiquit{\"a}r (GCKO) oder spezifisch in glatten Muskelzellen (SM-GCKO) ausgeschaltet ist. Beide Mausst{\"a}mme zeigen eine arterielle Hypertonie mit einem Anstieg des systolischen Blutdrucks um 30 mmHg im Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren. Neben cGMP ist auch cAMP als weiterer second messenger in einer Reihe von Regulationsprozessen im kardiovaskul{\"a}ren System involviert. Die Intensit{\"a}t und Dauer eines cAMP-Signals wird zum einen durch seine Synthese durch die Adenylyl-Cyclasen, zum anderen durch seine Hydrolyse durch die Phosphodiesterasen (PDE) bestimmt. Dabei spielt die PDE3 als cGMP-inhibierte, cAMP-abbauende PDE eine wichtige Rolle im sogenannten cGMP/cAMP-Crosstalk. Ein wichtiges Instrument zur Untersuchung PDE3-abh{\"a}ngiger Prozesse ist der spezifische Hemmstoff Milrinon. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PDE3-Expression abh{\"a}ngig ist von der Expression des cGMP-produzierenden Enzyms NO-GC: So zeigte sich in Thrombozyten wie auch in glatten Gef{\"a}ßmuskelzellen nach Deletion der NO-GC im Vergleich zu den Kontrolltieren eine Reduktion der PDE3 um die H{\"a}lfte. Diese Reduktion der PDE3-Expression war sowohl in den glatten Muskelzellen von GCKO wie auch von SM-GCKO-M{\"a}usen zu finden. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass die Down-Regulation der PDE3 in glatter Gef{\"a}ßmuskulatur in SM-GCKO-M{\"a}usen parallel zur Reduktion der NO-GC und nicht parallel zum daraus resultierenden Anstieg des Blutdrucks verl{\"a}uft. Die Reduktion der PDE3-Expression ging mit einer Verminderung der Aktivit{\"a}t in den Thrombozyten und glatten Muskelzellen des GCKOs einher. In Herzmuskelgewebe dagegen {\"a}nderten sich Expression und Aktivit{\"a}t der PDE3 nicht. Der spezifische PDE3-Hemmstoff Milrinon f{\"u}hrte zu einem weiteren Anstieg des systolischen Blutdrucks in den KO-Linien, nicht aber in Kontrolltieren. Zusammenfassend spielt die PDE3 eine wichtige Rolle im cGMP/cAMP-Crosstalk sowohl in Thrombozyten als auch in glatten Gef{\"a}ßmuskelzellen von M{\"a}usen.}, subject = {cGMP}, language = {de} } @phdthesis{Dankworth2013, author = {Dankworth, Beatrice}, title = {Charakterisierung der dynamischen Interaktion des Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptors mit den Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6)-Kan{\"a}len und Generierung von β-Zell-spezifischen GC-A-knock-out-M{\"a}usen sowie die Analyse der Bedeutung von ANP f{\"u}r die Insulin-Hom{\"o}ostase unter pathophysiologischen Bedingungen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78650}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Das atriale natriuretische Peptid (ANP) beeinflusst den arteriellen Blutdruck und das intravasale Volumen durch Stimulation der intrazellul{\"a}ren Produktion von cGMP {\"u}ber den membranst{\"a}ndigen Guanylyl Cyclase-A (GC-A)-Rezeptor. ANP stimuliert außerdem die Angiogenese und ist am Wachstum der Kardio-myozyten beteiligt. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die dynamische Interaktion zwischen den rezeptoraktivierten Kationenkan{\"a}len Transient Receptor Potential Canonical Type 3 und Type 6 (TRPC3/C6) und dem GC-A-Rezeptor untersucht. Erst k{\"u}rzlich konnte gezeigt werden, dass ANP {\"u}ber GC-A den TRPC-vermittelten Ca2+-Einstrom in Kardiomyozyten auf cGMP-unabh{\"a}ngige Weise stimuliert. Um eine m{\"o}gliche direkte Interaktion von TRPC3/C6 und GC-A zu zeigen, wurde TRPC3 oder C6 mit Flag-GC-A in HEK293-Zellen koexprimiert. Die Membranfraktion der Zellen wurde nach Immunpr{\"a}zipitation mit einem anti-Flag-Antik{\"o}rper im Western Blot untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass TRPC3/C6 unabh{\"a}ngig von ANP mit GC-A ko-immunpr{\"a}zipitieren. Die Interaktion erfolgte auch mit einem modifizierten GC-A-Rezeptor, dem die Cyclase-Dom{\"a}ne fehlt. Um die Interaktion in Kardiomyozyten zu untersuchen, wurde ein transgenes Mausmodell mit einer {\"U}berproduktion von HA-GC-A in Kardiomyozyten verwendet. Auch bei diesem Modell konnte mittels anti-HA- Antik{\"o}rper die Koimmunpr{\"a}zipitation von GC-A und TRPC3/C6 nachgewiesen werden. Schließlich wurden FRET-basierte Untersuchungen durchgef{\"u}hrt, um die lokale N{\"a}he von GC-A und TRPC3 zu beweisen und eine m{\"o}gliche ANP-induzierte Konformations{\"a}nderung zu untersuchen. Die Koexpression von GC-A-CFP und TRPC3-YFP in HEK293 Zellen f{\"u}hrte zu einem FRET-Signal, welches durch ANP konzentrationsabh{\"a}ngig (1-100 nM) gesenkt wurde. Die Gabe des membranpermeablen cGMP-Analagons 8-Br-cGMP f{\"u}hrte dagegen zu keiner Ver{\"a}nderung des FRET-Signals. Die Ergebnisse best{\"a}tigen das Vorhandensein eines stabilen Proteinkomplexes von GC-A und TRPC3, der f{\"u}r den neuen cGMP-unabh{\"a}ngigen Signalweg von GC-A ausschlaggebend ist. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt die Rolle von ANP/GC-A f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung der pankreatischen β-Zellen. Es ist bereits bekannt, dass GC-A in den β-Zellen exprimiert wird und dass ANP an isolierten Langerhans'schen Inseln das β-Zell-Wachstum und die Insulinsekretion moduliert. Um langfristig die Bedeutung von ANP f{\"u}r die systemische Glukose-Hom{\"o}ostase zu ergr{\"u}nden, wurde ein Mausmodell mit einer β-Zell-spezifischen GC-A-Deletion generiert. Der Nachweis des konditionellen GC-A knock out (KO) erfolgte mittels genomischer PCR und Immunhistochemie. Eine Detektion von GC-A in den Langerhans'schen Inseln auf Proteinebene war leider nicht m{\"o}glich. Aber es konnte gezeigt werden, dass der β-Zell-spezifische KO zu keiner Expressions{\"a}nderung von GC-A in anderen Geweben f{\"u}hrte. Auch der Blutdruck und das Herzgewicht der KO M{\"a}use blieb unauff{\"a}llig. Zur Untersuchung der Bedeutung von ANP f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung unter pathologischen Bedingungen wurden KO- und Kontrolltiere f{\"u}r 12 Wochen einer fettreichen Ern{\"a}hrung (60\% Fett) ausgesetzt um einen Pr{\"a}diabetes auszul{\"o}sen. Zu verschiedenen Zeitpunkten der Studie wurden orale Glukose-Toleranz-Tests (oGTT), Blutdruckmessungen und Gewichtsbestimmungen durchgef{\"u}hrt. Bereits vor der Studie wurde beobachtet, dass der N{\"u}chternglukosewert in den weiblichen KO-M{\"a}usen leicht erh{\"o}ht ist. Daher wurden die oGTT's in der Studie geschlechtsspezifisch ausgewertet. Am Ende der Studie zeigten alle M{\"a}use eine vergleichbare insuffiziente Blutzuckerregulierung. Der Blutdruck war sowohl in KO- als auch in Kontrolltieren um ca. 60\% erh{\"o}ht. Einigen Tieren wurde das Pankreas entnommen und f{\"u}r immunhistologische Zwecke pr{\"a}pariert. Die morphometrische Auswertung der Pankreas-Schnitte ergab eine signifikant vergr{\"o}ßerte durchschnittliche Inselfl{\"a}che und eine erh{\"o}hte durchschnittliche β-Zellfl{\"a}che der KO-Tiere im Vergleich zu den Kontrollen. Die β-Zellen der KO-Tieren waren im Vergleich zu den Kontrollen hypertroph. Die Studie zeigt also, dass die Deletion von GC-A in den β-Zellen unter pathologischen Bedingungen zu einer Hypertrophie der β-Zellen f{\"u}hrt und zu einem geringeren Schutz gegen die Ausbildung eines Pr{\"a}diabetes beitr{\"a}gt. Eine m{\"o}gliche verst{\"a}rkte periphere Insulinresistenz in den KO-Tieren ist auch nicht auszuschließen. Weitere Studien an dem neuen Mausmodell k{\"o}nnten die Bedeutung des ANP/GC-A-Systems f{\"u}r die Insulinaussch{\"u}ttung n{\"a}her ergr{\"u}nden und dadurch eventuell neue Therapieans{\"a}tze f{\"u}r Diabetes mellitus Typ 2 bringen.}, subject = {Atriales natriuretisches Hormon}, language = {de} } @phdthesis{Ljaschenko2013, author = {Ljaschenko, Dmitrij}, title = {Hebbian plasticity at neuromuscular synapses of Drosophila}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-90465}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Synaptic plasticity determines the development of functional neural circuits. It is widely accepted as the mechanism behind learning and memory. Among different forms of synaptic plasticity, Hebbian plasticity describes an activity-induced change in synaptic strength, caused by correlated pre- and postsynaptic activity. Additionally, Hebbian plasticity is characterised by input specificity, which means it takes place only at synapses, which participate in activity. Because of its correlative nature, Hebbian plasticity suggests itself as a mechanism behind associative learning. Although it is commonly assumed that synaptic plasticity is closely linked to synaptic activity during development, the mechanistic understanding of this coupling is far from complete. In the present study channelrhodopsin-2 was used to evoke activity in vivo, at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation led to increased incorporation of GluR-IIA-type glutamate receptors into postsynaptic receptor fields, thus boosting postsynaptic sensitivity. This phenomenon is input-specific. Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses at which neurotransmitter release failed to evoke substantial postsynaptic depolarisation. This mechanism might be responsible to tame uncontrolled receptor field growth. Combining these results with developmental GluR-IIA dynamics leads to a comprehensive physiological concept, where Hebbian plasticity guides growth of postsynaptic receptor fields and sparse transmitter release stabilises receptor fields by preventing overgrowth. Additionally, a novel mechanism of retrograde signaling was discovered, where direct postsynaptic channelrhodopsin-2 based stimulation, without involvement of presynaptic neurotransmitter release, leads to presynaptic depression. This phenomenon is reminiscent of a known retrograde homeostatic mechanism, of inverted polarity, where neurotransmitter release is upregulated, upon reduction of postsynaptic sensitivity.}, subject = {Synapse}, language = {en} } @phdthesis{Hoehne2013, author = {H{\"o}hne, Christian}, title = {Das atriale natriuretische Peptid hemmt den vasokonstriktorischen Effekt von Angiotensin II in der Mikrozirkulation durch die Aktivierung des Regulators des G-Protein Signalweges 2}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85229}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Interaktion von ANP und Ang II im Bereich der blutdruckbestimmenden Widerstandsgef{\"a}ße zu untersuchen. Ein besonderer Augenmerk wurde hierbei auch auf die Bedeutung von RGS2 gerichtet. Durch das Zusammenspiel der beiden funktionellen Antagonisten ANP und Ang II wird der Blutdruck reguliert. ANP und Ang II {\"u}ben hierbei jeweils gegenteilige Effekte aus. Ang II hat vasokonstriktorische Effekte auf die Blutgef{\"a}ße, vermindert die Natriurese und Diurese und erh{\"o}ht den Sympathikustonus. ANP hingegen besitzt blutdruckmindernde Effekte, hervorgerufen durch Vasodilatation, gesteigerte Diurese, die Erh{\"o}hung der endothelialen Durchl{\"a}ssigkeit und der Hemmung des Sympathikustonus. Da nichts {\"u}ber die Interaktion dieser beiden Hormone in der Mikrozirkulation bekannt ist, wurden im Rahmen der Dissertation intravitalmikroskopische Studien der Mikrozirkulation des Musculus cremaster der Maus, in Anlehnung an der von Baez (1973) publizierten Methode, durchgef{\"u}hrt. Dar{\"u}ber hinaus wurden auch die Effekte von Ang II und ANP auf den Blutdruck durch invasive Blutdruckmessung untersucht. Der Durchmesser von pr{\"a}kapill{\"a}ren Arteriolen des M. cremaster wurde vor und w{\"a}hrend lokaler Superfusion von Ang II oder ANP gemessen. Ang II l{\"o}ste eine konzentrationsabh{\"a}ngige stabile Konstriktion aus. Bei der ausschließlichen Superfusion von ANP in verschiedenen Konzentrationen hingegen, zeigte sich kein Effekt auf den basalen Vasotonus. ANP war jedoch in der Lage, an Ang II vorkontrahierten Arteriolen, den konstriktorischen Effekt von Ang II aufzuheben und sogar dar{\"u}ber hinaus eine ausgepr{\"a}gte Vasodilatation zu bewirken. Dieser Effekt konnte auch bei der invasiven Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks nachgewiesen werden. Der durch Ang II ausgel{\"o}ste Blutdruckanstieg wurde durch die zus{\"a}tzliche Infusion von ANP gemindert. Ang II aktiviert die Kontraktion von glatten Gef{\"a}ßmuskelzellen durch den Gαq-gekoppelten AT1-Rezeptor. RGS2 hingegen ist ein negativer Regulator von Gαq. Da von RGS2 bekannt ist, dass er von cGKI phosphoryliert und stimuliert wird (Osei-Owusu et al., 2007), stellte sich die Frage, ob ANP {\"u}ber RGS2 dem vasokonstriktiven Effekt von Ang II entgegenwirkt. Bei den Versuchen an RGS2-KO M{\"a}usen zeigt sich hierbei, dass ANP nicht mehr in der Lage ist, den vasokonstriktiven Effekt von Ang II aufzuheben. Daraus ist nun der Schluss zu ziehen, dass RGS2 eine bedeutende Rolle f{\"u}r die Wechselwirkung zwischen ANP und Ang II in der Mikrozirkulation spielt und somit eine wichtige Aufgabe bei der Regulation des peripheren Widerstands und des Blutdrucks hat.}, subject = {ANP}, language = {de} } @phdthesis{Paul2014, author = {Paul, Mila Marie}, title = {Vesikelverkehr in Aktiven Zonen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-110791}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Aktive Zonen (AZs) sind hoch spezialisierte, subzellul{\"a}re Kompartimente von Neuronen, die der synaptischen {\"U}bertragung dienen. Sie enthalten Ger{\"u}stproteine wie RIM (Rab3 interacting molecule) sowie elektronendichte Projektionen bestehend aus Bruchpilot bei Drosophila melanogaster oder Bassoon im S{\"a}uger, welche Schl{\"u}sselkomponenten des Vesikelverkehrs darstellen. Bei der Fliege sind Anzahl und Verteilung von Bruchpilot-Molek{\"u}len in AZs relevant f{\"u}r die funktionelle Differenzierung. Ihre Anordnung wird im Abstand von weniger als einem Mikrometer innerhalb einer pr{\"a}synaptischen Endigung reguliert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden elektrophysiologische Ableitungen und konfokale sowie h{\"o}chstaufl{\"o}sende, immunhistochemische Bildgebung mit dem dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) Verfahren an larvalen, neuromuskul{\"a}ren Synapsen von Drosophila durchgef{\"u}hrt. Dabei wurde das genetische Potenzial des Modellorganismus genutzt, um relevante Proteinfunktionen und -interaktionen zu analysieren. RIM als zentrale Komponente Aktiver Zonen ist relevant f{\"u}r synaptische Plastizit{\"a}t. Eine als CORD7 (cone-rod dystrophy type 7) bezeichnete Punktmutation (Arginin zu Histidin) innerhalb der 310 Helix der C2A-Dom{\"a}ne von RIM wurde mit erh{\"o}hten kognitiven F{\"a}higkeiten einer Patientengruppe in Verbindung gebracht. Weil die Drosophila C2A-Dom{\"a}ne eine hohe Homologie zur S{\"a}ugerdom{\"a}ne aufweist, konnte der Einfluss dieser Mutation auf Struktur und Funktion von Synapsen untersucht werden. Es zeigte sich, dass der Aminos{\"a}ureaustausch der CORD7-Position und des benachbarten Arginin-Restes die synaptische Organisation und Transmission beeinflussen. In einer Reihe weiterer Experimente wurde das Zusammenspiel von Bruchpilot und Synaptotagmin, dem Calciumsensor der evozierten Transmitterfreisetzung, analysiert. W{\"a}hrend AZs ohne Bruchpilot auch ohne Synaptotagmin funktionieren, f{\"u}hrt dessen Reduktion zu einer Umverteilung von Bruchpilot-Molek{\"u}len innerhalb von AZs und zu dramatischen {\"A}nderungen in ihrer Anzahl. Abschließend wurde so ein Beitrag zum Verst{\"a}ndnis der molekularen Organisation synaptischer Informationsverarbeitung und Plastizit{\"a}t geleistet, wobei zu kl{\"a}ren bleibt, wie die zuverl{\"a}ssige Speicherung von Informationen an AZs erreicht werden kann.}, subject = {Aktive Zonen}, language = {de} } @phdthesis{Bettaga2014, author = {Bettaga, Noomen}, title = {Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gef{\"a}ßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gef{\"a}ßsystem wird haupts{\"a}chlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gew{\"a}hrleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkr{\"a}fte und Zytokine wie der vaskul{\"a}re endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird w{\"a}hrend dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor f{\"u}r NO produziert die NO-GC den sekund{\"a}ren Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und f{\"u}hrt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in M{\"a}usen resultiert in einer vollst{\"a}ndigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zus{\"a}tzlich zellspezifische Knockout-M{\"a}use f{\"u}r glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur {\"a}ußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine st{\"a}rkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-M{\"a}use eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erh{\"o}hte Tuft-Bildung. {\"A}hnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-M{\"a}use zeigten eine gegen{\"u}ber den Kontroll-Tieren unver{\"a}nderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gef{\"a}ßkapillaren der Mausretina. Daher k{\"o}nnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich f{\"u}r die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Isch{\"a}mie-Modells durchgef{\"u}hrt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterl{\"a}ufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell f{\"u}r den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst f{\"u}hrt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese.}, subject = {Guanylylcyclase}, language = {de} } @phdthesis{Ullrich2014, author = {Ullrich, Melanie}, title = {Identification of SPRED2 as a Novel Regulator of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis Activity and of Body Homeostasis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107355}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {SPRED proteins are inhibitors of the Ras/ERK/MAPK signaling pathway, an evolutionary highly conserved and very widespread signaling cascade regulating cell proliferation, differentiation, and growth. To elucidate physiological consequences of SPRED2 deficiency, SPRED2 KO mice were generated by a gene trap approach. An initial phenotypical characterization of KO mice aged up to five months identified SPRED2 as a regulator of chondrocyte differentiation and bone growth. Here, the loss of SPRED2 leads to an augmented FGFR-dependent ERK activity, which in turn causes hypochondroplasia-like dwarfism. However, long term observations of older KO mice revealed a generally bad state of health and manifold further symptoms, including excessive grooming associated with severe self-inflicted wounds, an abnormally high water uptake, clear morphological signs of kidney deterioration, and a reduced survival due to sudden death. Based on these observations, the aim of this study was to discover an elicitor of this complex and versatile phenotype. The observed kidney degeneration in our SPRED2 KO mice was ascribed to hydronephrosis characterized by severe kidney atrophy and apoptosis of renal tubular cells. Kidney damage prompted us to analyze drinking behavior and routine serum parameters. Despite polydipsia, which was characterized by a nearly doubled daily water uptake, the significantly elevated Na+ and Cl- levels and the resulting serum hyperosmolality could not be compensated in SPRED2 KOs. Since salt and water balance is primarily under hormonal control of aldosterone and AVP, we analyzed both hormone levels. While serum AVP was similar in WTs and KOs, even after experimental water deprivation and an extreme loss of body fluid, serum aldosterone was doubled in SPRED2 KO mice. Systematic investigation of contributing upstream hormone axes demonstrated that hyperaldosteronism developed independently of an overactivated Renin-Angiotensin system as indicated by halved serum Ang II levels in KO mice. However, aldosterone synthase expression in the adrenal gland was substantially augmented. Serum corticosterone, which is like aldosterone released from the adrenal cortex, was more than doubled in SPRED2 KOs, too. Similar to corticosterone, the production of aldosterone is at least in part under control of pituitary ACTH, which is further regulated by upstream hypothalamic CRH release. In fact, stress hormone secretion from this complete hypothalamic-pituitary-adrenal axis was upregulated because serum ACTH, the mid acting pituitary hormone, and hypothalamic CRH, the upstream hormonal inductor of HPA axis activity, were also elevated by 30\% in SPRED2 KO mice. This was accompanied by an upregulated ERK activity in paraventricular nucleus-containing hypothalamic brain regions and by augmented hypothalamic CRH mRNA levels in our SPRED2 KO mice. In vitro studies using the hypothalamic cell line mHypoE-44 further demonstrated that both SPRED1 and SPRED2 were able to downregulate CRH promoter activity, CRH secretion, and Ets factor-dependent CRH transcription. This was in line with the presence of various Ets factor binding sites in the CRH promoter region, especially for Ets1. Thus, this study shows for the first time that SPRED2-dependent inhibition of Ras/ERK/MAPK signaling by suppression of ERK activity leads to a downregulation of Ets1 factor-dependent transcription, which further results in inhibition of CRH promoter activity, CRH transcription, and CRH release from the hypothalamus. The consecutive hyperactivity of the complete HPA axis in our SPRED2 KO mice reflects an elevated endogenous stress response becoming manifest by excessive grooming behavior and self-inflicted skin lesions on the one hand; on the other hand, in combination with elevated aldosterone synthase expression, this upregulated HPA hormone release explains hyperaldosteronism and the associated salt and water imbalances. Both hyperaldosteronism and polydipsia very likely contribute further to the observed kidney damage. Taken together, this study initially demonstrates that SPRED2 is essential for the appropriate regulation of HPA axis activity and of body homeostasis. To further enlighten and compare consequences of SPRED2 deficiency in mice and particularly in humans, two follow-up studies investigating SPRED2 function especially in heart and brain, and a genetic screen to identify human SPRED2 loss-of-function mutations are already in progress.}, subject = {Renin-Angiotensin-System}, language = {en} } @phdthesis{Hartmann2014, author = {Hartmann, Michael}, title = {Charakterisierung inaktivierender posttranslationaler Modifikationen des GC-A-Rezeptors f{\"u}r das atriale natriuretische Peptid (ANP)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97959}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Das atriale natriuretische Peptid (ANP) wird infolge einer Zunahme des atrialen Drucks aus den Myozyten des Atriums sezerniert. Es spielt lokal eine bedeutende, protektive Rolle und wirkt der Entstehung von Herzhypertrophie und Fibrose entgegen. Dar{\"u}ber hinaus kommt ANP vor allem eine wichtige Rolle als endokrines Hormon zu, das den arteriellen Blutdruck und das Blutvolumen regelt. Diese physiologischen Effekte vermittelt das Herzhormon durch seinen Rezeptor, das Transmembranprotein Guanylatzyklase A (GC-A). Durch Bindung von ANP an die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der GC-A wird intrazellul{\"a}r, durch die katalytische Dom{\"a}ne des Rezeptors, der sekund{\"a}re Botenstoff cGMP gebildet. Patienten mit einer, durch Bluthochdruck verursachten Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz weisen erh{\"o}hte ANP-Konzentrationen im Plasma auf. Die durch ANP vermittelten, protektiven Effekte sind allerdings vermindert. Zahlreiche Studien haben in vitro gezeigt, dass die chronische Inkubation der GC-A mit ihrem Liganden, sowie die Behandlung von GC-A exprimierenden Zellen mit Hormonen wie Angiotensin II, zur Desensitisierung des Rezeptors f{\"u}hren. Der Verlust der Funktionsf{\"a}higkeit geht einher mit der Dephosphorylierung des Rezeptors an spezifischen, intrazellul{\"a}r lokalisierten Aminos{\"a}uren. Durch die Erforschung dieses Mechanismus und Identifizierung m{\"o}glicher Interaktionspartner in vivo k{\"o}nnte der Grundstein f{\"u}r neue oder verbesserte Therapieformen gelegt werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine k{\"u}rzlich identifizierte Isoform des GC-A-Rezeptors identifiziert, die durch alternatives Spleißen des Exons 4 entsteht und in einer Vielzahl untersuchter Gewebe der Maus vorkommt. Die Deletion umfasst 51 Basenpaare und resultiert in einem um 17 Aminos{\"a}uren verk{\"u}rzten GC-A-Rezeptor (GC-AΔLys314-Gln330). Molekulare Modellierungen der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen des wildtypischen GC-A-Rezeptors und der Isoform zeigten, dass sich die Deletion im membrannahen Bereich der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne und damit deutlich entfernt von der ANP-Bindungsdom{\"a}ne befindet. Oberfl{\"a}chenbiotinylierungs- und Zellfraktionierungsversuche zeigten, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors an der Oberfl{\"a}che von Zellmembranen transient transfizierter HEK 293-Zellen pr{\"a}sentiert wird. Jedoch zeigten die ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-Radioimmunassay (cGMP-RIA) und F{\"o}rster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Messungen, dass die Isoform nicht zur ANP-vermittelten intrazellul{\"a}ren cGMP-Bildung stimuliert werden kann. Im Rahmen von ANP-Bindungsstudien mit 125I-ANP wurde gezeigt, dass GC-AΔLys314-Gln330 die F{\"a}higkeit zur Bindung des Liganden ANP verloren hat. Jedoch zeigten die Koimmunpr{\"a}zipitationsversuche, dass die Isoform des GC-A-Rezeptors Heterodimere mit dem wildtypischen GC-A-Rezeptor bilden und dadurch die ligandeninduzierte Bildung von cGMP reduzieren kann. In vivo konnte gezeigt werden, dass unter Angiotensin II-induzierter Hypertonie die mRNA-Expression f{\"u}r GC-AΔLys314-Gln330 in der Lunge gesteigert, und gleichzeitig die ANP-vermittelte cGMP-Bildung deutlich reduziert ist. Daher kann davon ausgegangen werden, dass das alternative Spleißen ein regulierender Mechanismus ist, der auf den ANP/GC-A-Signalweg Einfluss nimmt. Angiotensin II-induziertes alternatives Spleißen des GC-A-Gens kann daher einen neuen Mechanismus f{\"u}r die Verringerung der Sensitivit{\"a}t des GC-A-Rezeptors gegen{\"u}ber ANP darstellen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden transgene Tiere mit kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression eines Epitop-getaggten GC-A-Rezeptors generiert. Durch dieses Modell sollte es erm{\"o}glicht werden, den Rezeptor aus murinem Gewebe anreichern und aufreinigen zu k{\"o}nnen um danach Analysen zu posttranslationalen Ver{\"a}nderungen und m{\"o}glichen Interaktionspartnern durchzuf{\"u}hren. Zun{\"a}chst wurde in eine FLAG-Epitop-getaggte GC-A zus{\"a}tzlich ein HA-tag, sowie eine Erkennungssequenz f{\"u}r die Protease des tobacco etch virus (TEV) eingef{\"u}gt. Die Expression und Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors wurde durch ANP-Stimulationsexperimente unter Anwendung von cGMP-RIA und FRET-Messungen verifiziert. Die Funktionsf{\"a}higkeit der TEV-Erkennungssequenz wurde durch die Elution mittels TEV-Protease nach Immunpr{\"a}zipitation (IP) nachgewiesen. In vivo wurde an M{\"a}usen die Expression und Lokalisation der GC-A auf Proteinebene, unter Anwendung von Zellfraktionierungsexperimenten und Immunpr{\"a}zipitationen, {\"u}berpr{\"u}ft. Die entstandenen transgenen Tiere zeigten eine deutliche, in den Zellmembranen von Kardiomyozyten lokalisierte, {\"U}berexpression des Rezeptors. Dieser konnte {\"u}ber das HA-tag angereichert und aufgereinigt werden. Um die Funktionsf{\"a}higkeit des modifizierten Rezeptors in vivo nachzuweisen, wurde in zwei Versuchsreihen kardiale Hypertrophie durch chronische Applikation von Angiotensin II induziert. Es wurde postuliert, dass die {\"U}berexpression funktionsf{\"a}higer GC-A im Herzen die Tiere vor Herzhypertrophie sch{\"u}tzt. Die Ergebnisse der Studien zeigen allerdings, dass die generierten transgene Tiere trotz kardiomyozytenspezifischer {\"U}berexpression des Rezeptors nicht den erwarteten Schutz vor Herzhypertrophie aufwiesen, sondern {\"a}hnlich wie ihre wildtypischen Geschwistertiere reagieren. Jedoch gelang es mit Hilfe des {\"U}berexpressionsmodells zusammen mit anderen Mitarbeitern der AG Kuhn eine zuvor in vitro beschriebene Interaktion des GC-A-Rezeptors mit den Kationenkan{\"a}len TRPC3 und TRPC6 in vivo nachzuweisen. Somit besteht die M{\"o}glichkeit die Epitope und das murine {\"U}berexpressionsmodell auch zuk{\"u}nftig zu nutzen, um Interaktionspartner der GC-A zu identifizieren.}, subject = {Guanylatzyklase}, language = {de} } @article{BahnikStuchlik2015, author = {Bahn{\´i}k, Štěp{\´a}n and Stuchl{\´i}k, Aleš}, title = {Temporal and spatial strategies in an active place avoidance task on Carousel: a study of effects of stability of arena rotation speed in rats}, series = {PeerJ}, volume = {3}, journal = {PeerJ}, number = {e1257}, doi = {10.7717/peerj.1257}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-141931}, year = {2015}, abstract = {The active place avoidance task is a dry-arena task used to assess spatial navigation and memory in rodents. In this task, a subject is put on a rotating circular arena and avoids an invisible sector that is stable in relation to the room. Rotation of the arena means that the subject's avoidancemust be active, otherwise the subject will be moved in the to-be-avoided sector by the rotation of the arena and a slight electric shock will be administered. The present experiment explored the effect of variable arena rotation speed on the ability to avoid the to-be-avoided sector. Subjects in a group with variable arena rotation speed learned to avoid the sector with the same speed and attained the same avoidance ability as rats in a group with a stable arena rotation speed. Only a slight difference in preferred position within the room was found between the two groups. No difference was found between the two groups in the dark phase, where subjects could not use orientation cues in the room. Only one rat was able to learn the avoidance of the to-be-avoided sector in this phase. The results of the experiment suggest that idiothetic orientation and interval timing are not crucial for learning avoidance of the to-be-avoided sector. However, idiothetic orientation might be sufficient for avoiding the sector in the dark.}, language = {en} } @article{PaulPauliEhmannetal.2015, author = {Paul, Mila M. and Pauli, Martin and Ehmann, Nadine and Hallermann, Stefan and Sauer, Markus and Kittel, Robert J. and Heckmann, Manfred}, title = {Bruchpilot and Synaptotagmin collaborate to drive rapid glutamate release and active zone differentiation}, series = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, volume = {9}, journal = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, number = {29}, doi = {10.3389/fncel.2015.00029}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148988}, year = {2015}, abstract = {The active zone (AZ) protein Bruchpilot (Brp) is essential for rapid glutamate release at Drosophila melanogaster neuromuscular junctions (NMJs). Quantal time course and measurements of action potential-waveform suggest that presynaptic fusion mechanisms are altered in brp null mutants (brp\(^{69}\)). This could account for their increased evoked excitatory postsynaptic current (EPSC) delay and rise time (by about 1 ms). To test the mechanism of release protraction at brp\(^{69}\) AZs, we performed knock-down of Synaptotagmin-1 (Syt) via RNAi (syt\(^{KD}\)) in wildtype (wt), brp\(^{69}\) and rab3 null mutants (rab3\(^{rup}\)), where Brp is concentrated at a small number of AZs. At wt and rab3\(^{rup}\) synapses, syt\(^{KD}\) lowered EPSC amplitude while increasing rise time and delay, consistent with the role of Syt as a release sensor. In contrast, syt\(^{KD}\) did not alter EPSC amplitude at brp\(^{69}\) synapses, but shortened delay and rise time. In fact, following syt\(^{KD}\), these kinetic properties were strikingly similar in wt and brp\(^{69}\), which supports the notion that Syt protracts release at brp\(^{69}\) synapses. To gain insight into this surprising role of Syt at brp\(^{69}\) AZs, we analyzed the structural and functional differentiation of synaptic boutons at the NMJ. At tonic type Ib motor neurons, distal boutons contain more AZs, more Brp proteins per AZ and show elevated and accelerated glutamate release compared to proximal boutons. The functional differentiation between proximal and distal boutons is Brp-dependent and reduced after syt\(^{KD}\). Notably, syt\(^{KD}\) boutons are smaller, contain fewer Brp positive AZs and these are of similar number in proximal and distal boutons. In addition, super-resolution imaging via dSTORM revealed that syt\(^{KD}\) increases the number and alters the spatial distribution of Brp molecules at AZs, while the gradient of Brp proteins per AZ is diminished. In summary, these data demonstrate that normal structural and functional differentiation of Drosophila AZs requires concerted action of Brp and Syt.}, language = {en} } @article{KollertDombertDoeringetal.2015, author = {Kollert, Sina and Dombert, Benjamin and D{\"o}ring, Frank and Wischmeyer, Erhard}, title = {Activation of TRESK channels by the inflammatory mediator lysophosphatidic acid balances nociceptive signalling}, series = {Scientific Reports}, volume = {5}, journal = {Scientific Reports}, number = {12548}, doi = {10.1038/srep12548}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148312}, year = {2015}, abstract = {In dorsal root ganglia (DRG) neurons TRESK channels constitute a major current component of the standing outward current IK\(_{SO}\). A prominent physiological role of TRESK has been attributed to pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociception. We demonstrate co-expression of TRESK and LPA receptors in DRG neurons. Heterologous expression of TRESK and LPA receptors in Xenopus oocytes revealed augmentation of basal K\(^{+}\) currents upon LPA application. In DRG neurons nociception can result from TRPV\(_{1}\) activation by capsaicin or LPA. Upon co-expression in Xenopus oocytes LPA simultaneously increased both depolarising TRPV\(_{1}\) and hyperpolarising TRESK currents. Patch-clamp recordings in cultured DRG neurons from TRESK[wt] mice displayed increased IK\(_{SO}\) after application of LPA whereas under these conditions IK\(_{SO}\) in neurons from TRESK[ko] mice remained unaltered. Under current-clamp conditions LPA application differentially modulated excitability in these genotypes upon depolarising pulses. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and, in contrast, augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. Hence excitation of sensory neurons is strongly controlled by the activity of TRESK channels, which therefore are good candidates for the treatment of pain disorders.}, language = {en} } @article{BeckEhmannAndlaueretal.2015, author = {Beck, Katherina and Ehmann, Nadine and Andlauer, Till F. M. and Ljaschenko, Dmitrij and Strecker, Katrin and Fischer, Matthias and Kittel, Robert J. and Raabe, Thomas}, title = {Loss of the Coffin-Lowry syndrome-associated gene RSK2 alters ERK activity, synaptic function and axonal transport in Drosophila motoneurons}, series = {Disease Models \& Mechanisms}, volume = {8}, journal = {Disease Models \& Mechanisms}, doi = {10.1242/dmm.021246}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-145185}, pages = {1389-1400}, year = {2015}, abstract = {Plastic changes in synaptic properties are considered as fundamental for adaptive behaviors. Extracellular-signal-regulated kinase (ERK)-mediated signaling has been implicated in regulation of synaptic plasticity. Ribosomal S6 kinase 2 (RSK2) acts as a regulator and downstream effector of ERK. In the brain, RSK2 is predominantly expressed in regions required for learning and memory. Loss-of-function mutations in human RSK2 cause Coffin-Lowry syndrome, which is characterized by severe mental retardation and low IQ scores in affected males. Knockout of RSK2 in mice or the RSK ortholog in Drosophila results in a variety of learning and memory defects. However, overall brain structure in these animals is not affected, leaving open the question of the pathophysiological consequences. Using the fly neuromuscular system as a model for excitatory glutamatergic synapses, we show that removal of RSK function causes distinct defects in motoneurons and at the neuromuscular junction. Based on histochemical and electrophysiological analyses, we conclude that RSK is required for normal synaptic morphology and function. Furthermore, loss of RSK function interferes with ERK signaling at different levels. Elevated ERK activity was evident in the somata of motoneurons, whereas decreased ERK activity was observed in axons and the presynapse. In addition, we uncovered a novel function of RSK in anterograde axonal transport. Our results emphasize the importance of fine-tuning ERK activity in neuronal processes underlying higher brain functions. In this context, RSK acts as a modulator of ERK signaling.}, language = {en} } @phdthesis{Lausenmeyer2015, author = {Lausenmeyer, Eva Maria}, title = {Einfluss von Fractalkin und mfg-e8 auf die Thrombozytenaktivierung und ihre Interaktion mit pharmakologischen Thrombozytenaggregationshemmern}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-134469}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Die genauen Mechanismen der fr{\"u}hen Atheroskleroseentstehung sind Thema intensiver Forschungsarbeit. Hierbei hat sich in den letzten Jahren eine zunehmend wichtige Rolle f{\"u}r Thrombozyten herauskristallisiert. Sie spielen nicht nur in der H{\"a}mostase, sondern auch bei immunologischen und entz{\"u}ndlichen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Aktivierte Blutpl{\"a}ttchen interagieren auf vielf{\"a}ltige Weise mit unterschiedlichen Zellen ihrer Umgebung - Endothelzellen, glatten Muskelzellen oder Leukozyten - wodurch es auf beiden Seiten zur Freisetzung von Botenstoffen und nachfolgend zur Aktivierung diverser Signalwege kommt. Auf der Thrombozytenoberfl{\"a}che finden sich u.a. Rezeptoren f{\"u}r das Chemokin Fractalkin (CX3CL1). Dieses wurde bereits mit Thrombozytenaktivierung und Leukozytenadh{\"a}sion am Endothel in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der thrombozyt{\"a}re ADP-Rezeptor P2Y12 und der Rezeptor f{\"u}r Fractalkin, CX3CR1, eine {\"a}hnliche intrazellul{\"a}re G-Protein-Kopplung und Signalkaskade aufweisen, die in der Aktivierung der PI3K m{\"u}ndet. Der Effekt ist unabh{\"a}ngig von einer ADP-Zugabe und wird {\"u}ber G vermittelt, so dass hier{\"u}ber eine Blockung des P2Y12-Rezeptors durch z.B. Clopidogrel umgangen werden k{\"o}nnte. Des Weiteren ist bekannt, dass Fractalkin die Expression des Glykoproteins mfg-e8 beeinflusst. Inwiefern mfg-e8 einen Einfluss auf Thrombozyten hat, ist bislang nur unzureichend erforscht. In der vorliegenden Arbeit konnte eine proaktivierende Wirkung von mfg-e8 auf Thrombozyten nachgewiesen werden: Sowohl im Western blot (Aktivierung der PI3K) wie auch durchflusszytometrisch (Aktivierung des GPIIb/IIIa). Unter arteriellen Flussbedingungen schw{\"a}chte mfg-e8 die Bindung von Thrombozyten an Fibrinogen-beschichtete Oberfl{\"a}chen ab. Welche Rezeptoren an dieser Interaktion beteiligt sind, ist derzeit nicht gekl{\"a}rt. Sowohl mfg-e8 als auch Fractalkin stellen interessante, thrombozytenaktivierenden Substanzen dar, deren Einfluss aufeinander und auf das Gef{\"a}ßsystem weiterf{\"u}hrender Untersuchung bedarf.}, subject = {Thrombozytenaggregationshemmung}, language = {de} } @article{ScholzGehringGuanetal.2015, author = {Scholz, Nicole and Gehring, Jennifer and Guan, Chonglin and Ljaschenko, Dmitrij and Fischer, Robin and Lakshmanan, Vetrivel and Kittel, Robert J. and Langenhan, Tobias}, title = {The adhesion GPCR Latrophilin/CIRL shapes mechanosensation}, series = {Cell Reports}, volume = {11}, journal = {Cell Reports}, doi = {10.1016/j.celrep.2015.04.008}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148626}, pages = {866-874}, year = {2015}, abstract = {G-protein-coupled receptors (GPCRs) are typically regarded as chemosensors that control cellular states in response to soluble extracellular cues. However, the modality of stimuli recognized through adhesion GPCR (aGPCR), the second largest class of the GPCR superfamily, is unresolved. Our study characterizes the Drosophila aGPCR Latrophilin/dCirl, a prototype member of this enigmatic receptor class. We show that dCirl shapes the perception of tactile, proprioceptive, and auditory stimuli through chordotonal neurons, the principal mechanosensors of Drosophila. dCirl sensitizes these neurons for the detection of mechanical stimulation by amplifying their input-output function. Our results indicate that aGPCR may generally process and modulate the perception of mechanical signals, linking these important stimuli to the sensory canon of the GPCR superfamily.}, language = {en} } @article{EhmannSauerKittel2015, author = {Ehmann, Nadine and Sauer, Markus and Kittel, Robert J.}, title = {Super-resolution microscopy of the synaptic active zone}, series = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, volume = {9}, journal = {Frontiers in Cellular Neuroscience}, number = {7}, doi = {10.3389/fncel.2015.00007}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-148997}, year = {2015}, abstract = {Brain function relies on accurate information transfer at chemical synapses. At the presynaptic active zone (AZ) a variety of specialized proteins are assembled to complex architectures, which set the basis for speed, precision and plasticity of synaptic transmission. Calcium channels are pivotal for the initiation of excitation-secretion coupling and, correspondingly, capture a central position at the AZ. Combining quantitative functional studies with modeling approaches has provided predictions of channel properties, numbers and even positions on the nanometer scale. However, elucidating the nanoscopic organization of the surrounding protein network requires direct ultrastructural access. Without this information, knowledge of molecular synaptic structure-function relationships remains incomplete. Recently, super-resolution microscopy (SRM) techniques have begun to enter the neurosciences. These approaches combine high spatial resolution with the molecular specificity of fluorescence microscopy. Here, we discuss how SRM can be used to obtain information on the organization of AZ proteins}, language = {en} } @article{HoffmannEtzrodtWillkommetal.2015, author = {Hoffmann, Linda S. and Etzrodt, Jennifer and Willkomm, Lena and Sanyal, Abhishek and Scheja, Ludger and Fischer, Alexander W. C. and Stasch, Johannes-Peter and Bloch, Wilhelm and Friebe, Andreas and Heeren, Joerg and Pfeifer, Alexander}, title = {Stimulation of soluble guanylyl cyclase protects against obesity by recruiting brown adipose tissue}, series = {Nature Communications}, volume = {6}, journal = {Nature Communications}, number = {7235}, doi = {10.1038/ncomms8235}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-143127}, year = {2015}, abstract = {Obesity is characterized by a positive energy balance and expansion of white adipose tissue (WAT). In contrast, brown adipose tissue (BAT) combusts energy to produce heat. Here we show that a small molecule stimulator (BAY 41-8543) of soluble guanylyl cyclase (sGC), which produces the second messenger cyclic GMP (cGMP), protects against diet-induced weight gain, induces weight loss in established obesity, and also improves the diabetic phenotype. Mechanistically, the haeme-dependent sGC stimulator BAY 41-8543 enhances lipid uptake into BAT and increases whole-body energy expenditure, whereas ablation of the haeme-containing \(\beta\)\(_{1}\)-subunit of sGC severely impairs BAT function. Notably, the sGC stimulator enhances differentiation of human brown adipocytes as well as induces 'browning' of primary white adipocytes. Taken together, our data suggest that sGC is a potential pharmacological target for the treatment of obesity and its comorbidities.}, language = {en} } @phdthesis{Sturm2016, author = {Sturm, Julia Christine}, title = {Funktionelle Charakterisierung einer prim{\"a}ren Zahndurchbruchst{\"o}rung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-147051}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Die von Proffit und Vig (1981) als Primary Failure of Eruption (PFE, Prim{\"a}re Durchbruchst{\"o}rung) klassifizierte Zahndurchbruchst{\"o}rung resultiert klinisch h{\"a}ufig in schwergradigen Auswirkungen. Hierbei handelt es sich um Beeintr{\"a}chtigungen des Wachstums des Alveolarfortsatzes, ebenso wie Dilazerationen, große vertikale Defekte und schwergradige lateral offene Bisse. Die eindeutige Diagnostik und Abgrenzung der PFE von anderen Zahndurchbruchst{\"o}rungen gestaltete sich bis zur Bestimmung der zugrunde liegenden Ursachen als sehr schwierig. Aufgrund von Fehldiagnosen kam es h{\"a}ufig zu Behandlungsmisserfolgen. Um die PFE schneller und spezifischer diagnostizieren zu k{\"o}nnen, ist das Wissen {\"u}ber die zugrunde liegenden Mutationen des Parathormonrezeptor 1- Genes (PTHR1-Genes), welche bei PFE-Patienten isoliert wurden, von großer Bedeutung. Im Zuge vorangegangener Studien wurden bereits einige Mutationen des PTHR1 als pathogen klassifiziert, hierzu z{\"a}hlt die PTHR1-Mutante W339*, eine Abbruchmutante, welche auf einem Basenaustausch beruht. Dar{\"u}ber hinaus liegen Daten zu potenziell pathogenen Genvariationen, wie die PTHR1-Mutante G452E, eine Aminos{\"a}ureaustausch-Mutante, vor. Der Nachweis ihrer Pathogenit{\"a}t w{\"u}rde die Diagnosestellung sichern. Um die Pathogenit{\"a}t der PTHR1-Variationen nachweisen zu k{\"o}nnen, wurde ihre RNA in X. laevis Oozyten injiziert. Der PTHR1 wurde zusammen mit mTRESK, einem Kaliumkanal, exprimiert und im Anschluss auf sein Verhalten bei Zugabe von 100 nM Parathormon (PTH) mit elektrophysiolgischen Messungen untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die bei nicht an PFE erkrankten Menschen vorkommende Variante des PTHR1 (PTHR1-WT) eine Aktivierung von 260,47\% im Vergleich zu den Ausgangswerten unter einer physiologischen L{\"o}sung (ND96) zeigte. Im Gegensatz dazu konnte bei der bereits als pathogen klassifizierten PTHR1-Variation W339* kein signifikanter Anstieg der Aktivit{\"a}t unter PTH-Zugabe nachgewiesen werden. F{\"u}r die potenziell pathogene PTHR1-Mutante G452E konnte ebenfalls keine signifikante Aktivit{\"a}tssteigerung als Reaktion auf die Zugabe des Agonisten PTH nachzuweisen ermittelt werden. Dies l{\"a}sst die Schlussfolgerung zu, dass es sich bei der PTHR1-Mutante G452E ebenfalls um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt, genauso wie bei der als pathogen klassifizierten Variation W339* des PTHR1, da beide in den durchgef{\"u}hrten Messungen dasselbe Verhalten zeigen. Die als Kontrollgruppe k{\"u}nstlich erzeugte Mutante G452A des PTHR1 zeigte hingegen eine signifikante Aktivierung von 91,02\% im Vergleich zu den gemessenen Ausgangswerten unter physiolgischem ND96. Durch einen einfachen Aminos{\"a}ureaustausch wurde die Basensequenz des Rezeptors so ver{\"a}ndert, dass die Funktion trotz der Mutation wieder hergestellt werden konnte. Dies geschah durch den Einbau eines Alanins anstelle des nat{\"u}rlich vorkommenden Glycins. Im Gegensatz zu dem Einbau von Glutamat, bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E, bei welcher die Funktionsf{\"a}higkeit nicht mehr vorliegt. Die gemessene Aktivit{\"a}t ist zwar geringer als beim WT, legt aber nahe, dass es im Falle dieser k{\"u}nstlichen Mutation nicht zu einer Krankheitsauspr{\"a}gung kommt, da die Reaktion in ihrer Gesamtheit der des PTHR1-WT entspricht. Dies wird auch durch die signifikante Erh{\"o}hung des ausw{\"a}rts-gerichteten K+-Stromes deutlich, der sich analog zum gesunden PTHR1 verh{\"a}lt. . Es konnte somit die Funktionsf{\"a}higkeit der k{\"u}nstlichen PTHR1-Mutante G452A nachgewiesen werden. Die gesamten erzielten Ergebnisse waren durch die Abbildung von klinischen Befunden auf molekularer Ebene in Oozyten m{\"o}glich. Durch die Kombination eines Kalium-Kanales mit dem krankheitsspezifischen Rezeptor konnte das Verhalten des Rezeptors anhand des mittels TEVC-Messungen ermittelten Verhaltens des Kalium-Kanales abgebildet werden. Bei dem verwendeten Kalium-Kanal handelte es sich um mTRESK, welcher mit dem Parathormonrezeptor 1 zusammen exprimiert wurde. Durch die Zugabe des spezifischen Rezeptoragonisten PTH kam es bei den funktionsf{\"a}higen Variationen des Rezeptors zu einer Konformations{\"a}nderung des G-Proteins. Diese resultierte im weiteren Verlauf in einem Anstieg des intrazellul{\"a}ren Calcium-Spiegels und einer Aktivierung von Calcineurin. Die Dephosphorilierung des Kalium-Kanales mTRESK, welche zu einer Aktivit{\"a}tssteigerung des Kanals f{\"u}hrte, war die Folge. Dies verdeutlicht, wie auch zuk{\"u}nftig durch die Kooexpression von krankheitsspezifischen Rezeptoren und elektrophysiologisch ableitbaren Str{\"o}men, die Bedeutungen und Auswirkungen von Mutationen auf molekularer Ebene funktionell nachgewiesen werden k{\"o}nnen. Die vorliegende Arbeit erbringt somit unter Verwendung dieses Expressionssystems den Nachweis daf{\"u}r, dass es sich bei der im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante G452E um eine pathogene Variation des PTHR1-Genes handelt. Zudem konnten die vorangegangenen Ergebnisse, wonach es sich bei der ebenfalls im Patientenkollektiv isolierten PTHR1-Mutante W339* um eine pathogene Mutation handelt best{\"a}tigt werden. Patienten mit diesen Genvariationen k{\"o}nnen somit eindeutig die Diagnose PFE erhalten und entsprechend zielf{\"u}hrend therapiert werden.}, subject = {Zahndurchbruch}, language = {de} } @phdthesis{Backhaus2016, author = {Backhaus, Philipp}, title = {Effects of Transgenic Expression of Botulinum Toxins in Drosophila}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-143279}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Clostridial neurotoxins (botulinum toxins and tetanus toxin) disrupt neurotransmitter release by cleaving neuronal SNARE proteins. We generated transgenic flies allowing for conditional expression of different botulinum toxins and evaluated their potential as tools for the analysis of synaptic and neuronal network function in Drosophila melanogaster by applying biochemical assays and behavioral analysis. On the biochemical level, cleavage assays in cultured Drosophila S2 cells were performed and the cleavage efficiency was assessed via western blot analysis. We found that each botulinum toxin cleaves its Drosophila SNARE substrate but with variable efficiency. To investigate the cleavage efficiency in vivo, we examined lethality, larval peristaltic movements and vision dependent motion behavior of adult Drosophila after tissue-specific conditional botulinum toxin expression. Our results show that botulinum toxin type B and botulinum toxin type C represent effective alternatives to established transgenic effectors, i.e. tetanus toxin, interfering with neuronal and non-neuronal cell function in Drosophila and constitute valuable tools for the analysis of synaptic and network function.}, subject = {Botulinustoxin}, language = {en} } @phdthesis{Duennes2016, author = {D{\"u}nnes, Sarah}, title = {Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskul{\"a}ren System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schl{\"u}sselfunktion als wichtigster Rezeptor f{\"u}r das Signalmolek{\"u}l Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC f{\"u}hrt zur Produktion des sekund{\"a}ren Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Molek{\"u}le und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekund{\"a}rer Botenstoff, das Signalmolek{\"u}l cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekund{\"a}ren Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifit{\"a}t besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskul{\"a}re System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-M{\"a}use mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert. Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP n{\"a}her zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gef{\"a}ßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC f{\"u}hrt zu diesem Sensitivit{\"a}tseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivit{\"a}t um die H{\"a}lfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gef{\"a}ße zu gew{\"a}hrleisten. Ohne R{\"u}ckkopplung zwischen den beiden Signalwegen k{\"a}me es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen f{\"u}r das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar w{\"a}re eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A. Der Verlust der NO-GC f{\"u}hrt in GCKO- und SMC-GCKO-M{\"a}usen zu einem erh{\"o}hten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie k{\"o}nnte eine erh{\"o}hte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit n{\"a}her untersucht wurde. In GCKO-M{\"a}usen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erh{\"o}ht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zus{\"a}tzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine ver{\"a}nderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion f{\"u}hrt. Diese Ver{\"a}nderungen k{\"o}nnten die Blutdruckerh{\"o}hung in GCKO-M{\"a}usen erkl{\"a}ren. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gef{\"a}ß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als m{\"o}gliche Ursache f{\"u}r den erh{\"o}hten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufkl{\"a}rung m{\"u}ssen weitere Versuche zum Aufbau der Gef{\"a}ßw{\"a}nde und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden.}, subject = {Knock-Out }, language = {de} } @article{MarkertBritzProppertetal.2016, author = {Markert, Sebastian Matthias and Britz, Sebastian and Proppert, Sven and Lang, Marietta and Witvliet, Daniel and Mulcahy, Ben and Sauer, Markus and Zhen, Mei and Bessereau, Jean-Louis and Stigloher, Christian}, title = {Filling the gap: adding super-resolution to array tomography for correlated ultrastructural and molecular identification of electrical synapses at the C. elegans connectome}, series = {Neurophotonics}, volume = {3}, journal = {Neurophotonics}, number = {4}, doi = {10.1117/1.NPh.3.4.041802}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-187292}, pages = {041802}, year = {2016}, abstract = {Correlating molecular labeling at the ultrastructural level with high confidence remains challenging. Array tomography (AT) allows for a combination of fluorescence and electron microscopy (EM) to visualize subcellular protein localization on serial EM sections. Here, we describe an application for AT that combines near-native tissue preservation via high-pressure freezing and freeze substitution with super-resolution light microscopy and high-resolution scanning electron microscopy (SEM) analysis on the same section. We established protocols that combine SEM with structured illumination microscopy (SIM) and direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). We devised a method for easy, precise, and unbiased correlation of EM images and super-resolution imaging data using endogenous cellular landmarks and freely available image processing software. We demonstrate that these methods allow us to identify and label gap junctions in Caenorhabditis elegans with precision and confidence, and imaging of even smaller structures is feasible. With the emergence of connectomics, these methods will allow us to fill in the gap-acquiring the correlated ultrastructural and molecular identity of electrical synapses.}, language = {en} } @article{SubramanianDoeringKollertetal.2016, author = {Subramanian, Hariharan and D{\"o}ring, Frank and Kollert, Sina and Rukoyatkina, Natalia and Sturm, Julia and Gambaryan, Stepan and Stellzig-Eisenhauer, Angelika and Meyer-Marcotty, Philipp and Eigenthaler, Martin and Wischmeyer, Erhard}, title = {PTH1R Mutants Found in Patients with Primary Failure of Tooth Eruption Disrupt G-Protein Signaling}, series = {PLoS One}, volume = {11}, journal = {PLoS One}, number = {11}, doi = {10.1371/journal.pone.0167033}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-147967}, pages = {e0167033}, year = {2016}, abstract = {Aim Primary failure of tooth eruption (PFE) is causally linked to heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene. The mutants described so far lead to exchange of amino acids or truncation of the protein that may result in structural changes of the expressed PTH1R. However, functional effects of these mutations have not been investigated yet. Materials and Methods In HEK293 cells, PTH1R wild type was co-transfected with selected PTH1R mutants identified in patients with PFE. The effects on activation of PTH-regulated intracellular signaling pathways were analyzed by ELISA and Western immunoblotting. Differential effects of wild type and mutated PTH1R on TRESK ion channel regulation were analyzed by electrophysiological recordings in Xenopus laevis oocytes. Results In HEK293 cells, activation of PTH1R wild type increases cAMP and in response activates cAMP-stimulated protein kinase as detected by phosphorylation of the vasodilator stimulated phosphoprotein (VASP). In contrast, the PTH1R mutants are functionally inactive and mutant PTH1R/Gly452Glu has a dominant negative effect on the signaling of PTH1R wild type. Confocal imaging revealed that wild type PTH1R is expressed on the cell surface, whereas PTH1R/Gly452Glu mutant is mostly retained inside the cell. Furthermore, in contrast to wild type PTH1R which substantially augmented K+ currents of TRESK channels, coupling of mutated PTH1R to TRESK channels was completely abolished. Conclusions PTH1R mutations affect intracellular PTH-regulated signaling in vitro. In patients with primary failure of tooth eruption defective signaling of PTH1R mutations is suggested to occur in dento-alveolar cells and thus may lead to impaired tooth movement.}, language = {en} } @article{IsraelOhsiekAlMomanietal.2016, author = {Israel, Ina and Ohsiek, Andrea and Al-Momani, Ehab and Albert-Weissenberger, Christiane and Stetter, Christian and Mencl, Stine and Buck, Andreas K. and Kleinschnitz, Christoph and Samnick, Samuel and Sir{\´e}n, Anna-Leena}, title = {Combined [\(^{18}\)F]DPA-714 micro-positron emission tomography and autoradiography imaging of microglia activation after closed head injury in mice}, series = {Journal of Neuroinflammation}, volume = {13}, journal = {Journal of Neuroinflammation}, number = {140}, doi = {10.1186/s12974-016-0604-9}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146606}, year = {2016}, abstract = {Background Traumatic brain injury (TBI) is a major cause of death and disability. Neuroinflammation contributes to acute damage after TBI and modulates long-term evolution of degenerative and regenerative responses to injury. The aim of the present study was to evaluate the relationship of microglia activation to trauma severity, brain energy metabolism, and cellular reactions to injury in a mouse closed head injury model using combined in vivo PET imaging, ex vivo autoradiography, and immunohistochemistry. Methods A weight-drop closed head injury model was used to produce a mixed diffuse and focal TBI or a purely diffuse mild TBI (mTBI) in C57BL6 mice. Lesion severity was determined by evaluating histological damage and functional outcome using a standardized neuroscore (NSS), gliosis, and axonal injury by immunohistochemistry. Repeated intra-individual in vivo μPET imaging with the specific 18-kDa translocator protein (TSPO) radioligand [\(^{18}\)F]DPA-714 was performed on day 1, 7, and 16 and [\(^{18}\)F]FDG-μPET imaging for energy metabolism on days 2-5 after trauma using freshly synthesized radiotracers. Immediately after [\(^{18}\)F]DPA-714-μPET imaging on days 7 and 16, cellular identity of the [\(^{18}\)F]DPA-714 uptake was confirmed by exposing freshly cut cryosections to film autoradiography and successive immunostaining with antibodies against the microglia/macrophage marker IBA-1. Results Functional outcome correlated with focal brain lesions, gliosis, and axonal injury. [\(^{18}\)F]DPA-714-μPET showed increased radiotracer uptake in focal brain lesions on days 7 and 16 after TBI and correlated with reduced cerebral [\(^{18}\)F]FDG uptake on days 2-5, with functional outcome and number of IBA-1 positive cells on day 7. In autoradiography, [\(^{18}\)F]DPA-714 uptake co-localized with areas of IBA1-positive staining and correlated strongly with both NSS and the number of IBA1-positive cells, gliosis, and axonal injury. After mTBI, numbers of IBA-1 positive cells with microglial morphology increased in both brain hemispheres; however, uptake of [\(^{18}\)F]DPA-714 was not increased in autoradiography or in μPET imaging. Conclusions [\(^{18}\)F]DPA-714 uptake in μPET/autoradiography correlates with trauma severity, brain metabolic deficits, and microglia activation after closed head TBI.}, language = {en} } @article{KirschmerBandleonvonEhrlichTreuenstaettetal.2016, author = {Kirschmer, Nadine and Bandleon, Sandra and von Ehrlich-Treuenst{\"a}tt, Viktor and Hartmann, Sonja and Schaaf, Alice and Lamprecht, Anna-Karina and Miranda-Laferte, Erick and Langsenlehner, Tanja and Ritter, Oliver and Eder, Petra}, title = {TRPC4α and TRPC4β Similarly Affect Neonatal Cardiomyocyte Survival during Chronic GPCR Stimulation}, series = {PLoS ONE}, volume = {11}, journal = {PLoS ONE}, number = {12}, doi = {10.1371/journal.pone.0168446}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178539}, year = {2016}, abstract = {The Transient Receptor Potential Channel Subunit 4 (TRPC4) has been considered as a crucial Ca\(^{2+}\) component in cardiomyocytes promoting structural and functional remodeling in the course of pathological cardiac hypertrophy. TRPC4 assembles as homo or hetero-tetramer in the plasma membrane, allowing a non-selective Na\(^{+}\) and Ca\(^{2+}\) influx. Gαq protein-coupled receptor (GPCR) stimulation is known to increase TRPC4 channel activity and a TRPC4-mediated Ca\(^{2+}\) influx which has been regarded as ideal Ca\(^{2+}\) source for calcineurin and subsequent nuclear factor of activated T-cells (NFAT) activation. Functional properties of TRPC4 are also based on the expression of the TRPC4 splice variants TRPC4α and TRPC4β. Aim of the present study was to analyze cytosolic Ca\(^{2+}\) signals, signaling, hypertrophy and vitality of cardiomyocytes in dependence on the expression level of either TRPC4α or TRPC4β. The analysis of Ca\(^{2+}\) transients in neonatal rat cardiomyocytes (NRCs) showed that TRPC4α and TRPC4β affected Ca\(^{2+}\) cycling in beating cardiomyocytes with both splice variants inducing an elevation of the Ca\(^{2+}\) transient amplitude at baseline and TRPC4β increasing the Ca\(^{2+}\) peak during angiotensin II (Ang II) stimulation. NRCs infected with TRPC4β (Ad-C4β) also responded with a sustained Ca\(^{2+}\) influx when treated with Ang II under non-pacing conditions. Consistent with the Ca\(^{2+}\) data, NRCs infected with TRPC4α (Ad-C4α) showed an elevated calcineurin/NFAT activity and a baseline hypertrophic phenotype but did not further develop hypertrophy during chronic Ang II/phenylephrine stimulation. Down-regulation of endogenous TRPC4α reversed these effects, resulting in less hypertrophy of NRCs at baseline but a markedly increased hypertrophic enlargement after chronic agonist stimulation. Ad-C4β NRCs did not exhibit baseline calcineurin/NFAT activity or hypertrophy but responded with an increased calcineurin/NFAT activity after GPCR stimulation. However, this effect was not translated into an increased propensity towards hypertrophy but rather less hypertrophy during GPCR stimulation. Further analyses revealed that, although hypertrophy was preserved in Ad-C4α NRCs and even attenuated in Ad-C4β NRCs, cardiomyocytes had an increased apoptosis rate and thus were less viable after chronic GPCR stimulation. These findings suggest that TRPC4α and TRPC4β differentially affect Ca\(^{2+}\) signals, calcineurin/NFAT signaling and hypertrophy but similarly impair cardiomyocyte viability during GPCR stimulation.}, language = {en} } @phdthesis{Guan2016, author = {Guan, Chonglin}, title = {Functional and genetic dissection of mechanosensory organs of \(Drosophila\) \(melanogaster\)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146220}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {In Drosophila larvae and adults, chordotonal organs (chos) are highly versatile mechanosensors that are essential for proprioception, touch sensation and hearing. Chos share molecular, anatomical and functional properties with the inner ear hair cells of mammals. These multiple similarities make chos powerful models for the molecular study of mechanosensation. In the present study, I have developed a preparation to directly record from the sensory neurons of larval chos (from the lateral chos or lch5) and managed to correlate defined mechanical inputs with the corresponding electrical outputs. The findings of this setup are described in several case studies. (1) The basal functional lch5 parameters, including the time course of response during continuous mechanical stimulation and the recovery time between successive bouts of stimulation, was characterized. (2) The calcium-independent receptor of α-latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), an Adhesion class G protein-coupled receptor (aGPCR), is identified as a modulator of the mechanical signals perceived by lch5 neurons. The results indicate that dCIRL/Latrophilin is required for the perception of external and internal mechanical stimuli and shapes the sensitivity of neuronal mechanosensation. (3) By combining this setup with optogenetics, I have confirmed that dCIRL modulates lch5 neuronal activity at the level of their receptor current (sensory encoding) rather than their ability to generate action potentials. (4) dCIRL´s structural properties (e.g. ectodomain length) are essential for the mechanosensitive properties of chordotonal neurons. (5) The versatility of chos also provides an opportunity to study multimodalities at multiple levels. In this context, I performed an experiment to directly record neuronal activities at different temperatures. The results show that both spontaneous and mechanically evoked activity increase in proportion to temperature, suggesting that dCIRL is not required for thermosensation in chos. These findings, from the development of an assay of sound/vibration sensation, to neuronal signal processing, to molecular aspects of mechanosensory transduction, have provided the first insights into the mechanosensitivity of dCIRL. In addition to the functional screening of peripheral sensory neurons, another electrophysiological approach was applied in the central nervous system: dCIRL may impact the excitability of the motor neurons in the ventral nerve cord (VNC). In the second part of my work, whole-cell patch clamp recordings of motor neuron somata demonstrated that action potential firing in the dCirl\(^K\)\(^O\) did not differ from control samples, indicating comparable membrane excitability.}, subject = {Taufliege}, language = {en} } @article{WernerKojonazarovGassneretal.2016, author = {Werner, Franziska and Kojonazarov, Baktybek and Gaßner, Birgit and Abeßer, Marco and Schuh, Kai and V{\"o}lker, Katharina and Baba, Hideo A. and Dahal, Bhola K. and Schermuly, Ralph T. and Kuhn, Michaela}, title = {Endothelial actions of atrial natriuretic peptide prevent pulmonary hypertension in mice}, series = {Basic Research in Cardiology}, volume = {111}, journal = {Basic Research in Cardiology}, number = {2}, doi = {10.1007/s00395-016-0541-x}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-190664}, pages = {16}, year = {2016}, abstract = {The cardiac hormone atrial natriuretic peptide (ANP) regulates systemic and pulmonary arterial blood pressure by activation of its cyclic GMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. In the lung, these hypotensive effects were mainly attributed to smooth muscle-mediated vasodilatation. It is unknown whether pulmonary endothelial cells participate in the homeostatic actions of ANP. Therefore, we analyzed GC-A/cGMP signalling in lung endothelial cells and the cause and functional impact of lung endothelial GC-A dysfunction. Western blot and cGMP determinations showed that cultured human and murine pulmonary endothelial cells exhibit prominent GC-A expression and activity which were markedly blunted by hypoxia, a condition known to trigger pulmonary hypertension (PH). To elucidate the consequences of impaired endothelial ANP signalling, we studied mice with genetic endothelial cell-restricted ablation of the GC-A receptor (EC GC-A KO). Notably, EC GC-A KO mice exhibit PH already under resting, normoxic conditions, with enhanced muscularization of small arteries and perivascular infiltration of inflammatory cells. These alterations were aggravated on exposure of mice to chronic hypoxia. Lung endothelial GC-A dysfunction was associated with enhanced expression of angiotensin converting enzyme (ACE) and increased pulmonary levels of Angiotensin II. Angiotensin II/AT(1)-blockade with losartan reversed pulmonary vascular remodelling and perivascular inflammation of EC GC-A KO mice, and prevented their increment by chronic hypoxia. This experimental study indicates that endothelial effects of ANP are critical to prevent pulmonary vascular remodelling and PH. Chronic endothelial ANP/GC-A dysfunction, e.g. provoked by hypoxia, is associated with activation of the ACE-angiotensin pathway in the lung and PH.}, language = {en} } @article{MaiellaroLohseKitteetal.2016, author = {Maiellaro, Isabella and Lohse, Martin J. and Kitte, Robert J. and Calebiro, Davide}, title = {cAMP Signals in Drosophila Motor Neurons Are Confined to Single Synaptic Boutons}, series = {Cell Reports}, volume = {17}, journal = {Cell Reports}, number = {5}, doi = {10.1016/j.celrep.2016.09.090}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-162324}, pages = {1238-1246}, year = {2016}, abstract = {The second messenger cyclic AMP (cAMP) plays an important role in synaptic plasticity. Although there is evidence for local control of synaptic transmission and plasticity, it is less clear whether a similar spatial confinement of cAMP signaling exists. Here, we suggest a possible biophysical basis for the site-specific regulation of synaptic plasticity by cAMP, a highly diffusible small molecule that transforms the physiology of synapses in a local and specific manner. By exploiting the octopaminergic system of Drosophila, which mediates structural synaptic plasticity via a cAMP-dependent pathway, we demonstrate the existence of local cAMP signaling compartments of micrometer dimensions within single motor neurons. In addition, we provide evidence that heterogeneous octopamine receptor localization, coupled with local differences in phosphodiesterase activity, underlies the observed differences in cAMP signaling in the axon, cell body, and boutons.}, language = {en} } @phdthesis{Offner2017, author = {Offner, Kristin}, title = {SH3-mediated protein interactions of Mena and VASP}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-154481}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Regulation of actin cytoskeletal turnover is necessary to coordinate cell movement and cell adhesion. Proteins of the Enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein (Ena/VASP) family are important mediators in cytoskeleton control, linking cyclic nucleotide signaling pathways to actin assembly. In mammals, the Ena/VASP family consists of mammalian Enabled (Mena), VASP, and Ena-VASP-like (EVL). The family members share a tripartite domain organization, consisting of an N-terminal Ena/VASP homology 1 (EVH1) domain, a central proline-rich region (PRR), and a C-terminal EVH2 domain. The EVH1 domain mediates binding to the focal adhesion proteins vinculin and zyxin, the PRR interacts with the actin-binding protein profilin and with Src homology 3 (SH3) domains, and the EVH2 domain mediates tetramerization and actin binding. Endothelial cells line vessel walls and form a semipermeable barrier between blood and the underlying tissue. Endothelial barrier function depends on the integrity of cell-cell junctions and defective sealing of cell-cell contacts results in vascular leakage and edema formation. In a previous study, we could identify a novel interaction of the PRR of VASP with αII-spectrin. VASP-targeting to endothelial cell-cell contacts by interaction with the αII-spectrin SH3 domain is sufficient to initiate perijunctional actin filament assembly, which in turn stabilizes cell-cell contacts and decreases endothelial permeability. Conversely, barrier function of VASP-deficient endothelial cells and microvessels of VASP- null mice is defective, demonstrating that αII-spectrin/VASP complexes regulate endothelial barrier function in vivo. The aim of the present study was to characterize the structural aspects of the binding of Ena/VASP proteins to αII-spectrin in more detail. These data are highly relevant to understand the cardiovascular function of VASP and its subcellular targeting. In the present study, the following points were experimentally addressed: 1. Comparison of the interaction between αII-spectrin and Mena, VASP, or EVL In contrast to the highly conserved EVH1/EVH2 domains, the PRR is the most divergent part within the Ena/VASP proteins and may differ in binding modes and mechanisms of regulation. More specifically, VASP contains a triple GP5 motif, whereas EVL and Mena contain one or more GP6 motifs or even longer proline stretches. In the present study, we used peptide scans and competitive αII-spectrin SH3 pull-down assays with the recombinant Mena, VASP, and VASP mutants to investigate the relative binding efficiency. Our results indicate that binding of the αII-spectrin SH3 domain to GP6 motifs is superior to GP5 motifs, giving a rationale for a stronger interaction of αII-spectrin with EVL and Mena than with VASP. 2. Interaction of SH3i with Ena/VASP proteins In the mammalian heart, an αII-spectrin splice variant exists (SH3i), which contains a 20 amino acid insertion C-terminal to the SH3 domain. We used GST-fusion proteins of αII-spectrin, comprising the SH3 domain with or without the alternatively spliced amino acids, to pull-down recombinant Mena, VASP or VASP mutants. The results demonstrate a substantially increased binding of the C-terminal extended SH3 domain as compared to the general αII-spectrin isoform without the 20 amino acid insertion. These findings were also confirmed in pull-down experiments with heart lysates and purified Mena from heart muscle. The increased binding was not due to an alternative, SH3-independent binding interface because a pointmutation of the SH3 domain (W1004R) in the alternatively spliced αII-spectrin isoform completely abrogated the interaction. To analyze the interaction of SH3i and Ena/VASP proteins in living cells, we expressed the extended SH3 domain as GFP fusion proteins in endothelial cells. Here, we observed an extensive co-localization with Mena and VASP at the leading edge of lamellipodia confirming the in vivo relevance of the interaction with potential impact on cell migration and angiogenesis. 3. Binding affinity and influence of the Ena/VASP tetramerization domain We also determined the binding affinity of the general and the alternatively spliced αII-spectrin SH3 with Ena/VASP proteins by isothermal titration calorimetry (ITC) using a peptide from the PRR of Mena (collaboration with Dr. Stephan Feller, University of Oxford). Surprisingly, the binding affinity of the general SH3 domain was low (~900 μM) as compared to other SH3 domain- mediated interactions, which commonly display binding constants in the low micromolar range. Furthermore and in contrast to the pull-down assays, we could not detect an increased binding affinity of the C-terminally extended SH3 domain. This could be either explained by the existence of a third protein, which "bridges" the Mena/αII-spectrin complex in the pull-down assays, or, more likely, by the small size of the Mena peptide, which lacks major parts of the Mena protein, including the tetramerization domain. Indeed, it has been previously shown that the tetramerization of Ena is crucial for the interaction with the Abl- SH3 domain, although no SH3 binding sites are found in the tetramerization domain. To address this point experimentally, we used a VASP mutant that lacks the tetramerization domain in pull-down assays. Neither the general nor the alternatively spliced SH3 domain bound to the monomeric VASP, demonstrating the crucial (indirect) impact of Ena/VASP tetramerization on the interaction with αII-spectrin. In summary, we conclude that the αII-spectrin SH3 domain binds to the proline- rich region of all Ena/VASP proteins. However, binding to EVL and Mena, which both possess one or more GP6 motifs, is substantially more efficient than VASP, which only contains GP5 motifs. The C-terminally extended SH3 domain, which is present in the αII-spectrin splice variant SH3i, binds stronger to the Ena/VASP proteins than the general isoform and expression of the isolated domain is sufficient for co-localization with Ena/VASP in living endothelial cells. Finally, the tetramerization of the Ena/VASP proteins is indispensable for the interaction with either isoform of αII-spectrin.}, language = {en} } @article{ScholzGuanNieberleretal.2017, author = {Scholz, Nicole and Guan, Chonglin and Nieberler, Matthias and Grotmeyer, Alexander and Maiellaro, Isabella and Gao, Shiqiang and Beck, Sebastian and Pawlak, Matthias and Sauer, Markus and Asan, Esther and Rothemund, Sven and Winkler, Jana and Pr{\"o}mel, Simone and Nagel, Georg and Langenhan, Tobias and Kittel, Robert J}, title = {Mechano-dependent signaling by Latrophilin/CIRL quenches cAMP in proprioceptive neurons}, series = {eLife}, volume = {6}, journal = {eLife}, number = {e28360}, doi = {10.7554/eLife.28360}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-170520}, year = {2017}, abstract = {Adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs), a large molecule family with over 30 members in humans, operate in organ development, brain function and govern immunological responses. Correspondingly, this receptor family is linked to a multitude of diverse human diseases. aGPCRs have been suggested to possess mechanosensory properties, though their mechanism of action is fully unknown. Here we show that the Drosophila aGPCR Latrophilin/dCIRL acts in mechanosensory neurons by modulating ionotropic receptor currents, the initiating step of cellular mechanosensation. This process depends on the length of the extended ectodomain and the tethered agonist of the receptor, but not on its autoproteolysis, a characteristic biochemical feature of the aGPCR family. Intracellularly, dCIRL quenches cAMP levels upon mechanical activation thereby specifically increasing the mechanosensitivity of neurons. These results provide direct evidence that the aGPCR dCIRL acts as a molecular sensor and signal transducer that detects and converts mechanical stimuli into a metabotropic response.}, language = {en} } @phdthesis{Zechner2018, author = {Zechner, Martin}, title = {Quantifizierung morphologischer Ver{\"a}nderungen an Neuronen der lateralen Amygdala in SPRED2-defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-172291}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {In der vorliegenden Dissertation wurden die Folgen einer SPRED2-Defizienz in einem Knockout Mausmodell untersucht. Dabei wurde insbesondere die m{\"o}gliche Verbindung zur Zwangsst{\"o}rung, einer psychiatrischen Erkrankung beleuchtet. Das SPRED2-Protein kommt im menschlichen K{\"o}rper in zahlreichen Geweben vor, besonders im Hirn wurde eine ubiquit{\"a}re Expression nachgewiesen und ein Zusammenhang mit der Neurogenese und neuronaler Differenzierung vermutet. Seine regulatorische Funktion besteht in einer inhibitorischen Wirkung auf den BDNF/TrkB-ERK-Signalweg, welcher u.a. f{\"u}r die Transkription neuronaler Gene verantwortlich ist. Die verwendeten SPRED2-defizienten M{\"a}use wurden durch Insertion eines Gene-Trap Vektors in das Spred2-Gen generiert. Die Insertion verhindert letztendlich die korrekte Translation des Proteins. Von der durch weitere Verpaarung entstehenden SPRED2-Knockout Mauslinie wurden ausschließlich m{\"a}nnliche Tiere verwendet. Im Rahmen einer SPRED2-KO-Studie von der AG Schuh des Physiologischen Instituts der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg, die u.a. die Entgleisung der HHNA mit resultierendem erh{\"o}hten Stresshormonspiegel und eine Dysregulation des Mineralhaushaltshormons Aldosteron zeigte, wurden bei den Versuchstieren zwanghafte Verhaltensmuster beobachtet. Daraufhin wurden elektrophysiologische Messungen durchgef{\"u}hrt, die auf eine Anomalie in der synaptischen {\"U}bertragung zwischen Thalamus und Amygdala hindeuteten. Erh{\"o}hte Effizienz und Erregbarkeit der amygdaloiden Neuronen f{\"u}hrten zu der morphologischen Untersuchung, die im Rahmen dieser Arbeit durchgef{\"u}hrt wurden. Da die Afferenzen des Thalamus vorwiegend in den lateralen Kern der Amygdala projizieren, wurde zun{\"a}chst dieser betrachtet. Ziel der Untersuchung war es, Erkenntnisse dar{\"u}ber zu erlangen, ob der Knockout des SPRED2-Proteins in M{\"a}usen zu einer ver{\"a}nderten Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala f{\"u}hrt. Falls dies der Fall sein sollte, k{\"o}nnte damit zumindest ansatzweise das zwanghafte Verhalten der SPRED2-defizienten M{\"a}usen erkl{\"a}rt werden. Die Hirne der Versuchstiere wurden nach der Golgi-Cox-Impr{\"a}gnierung nach Glaser und Van der Loos und der Einbettung in Celloidin in 150 μm dicke Scheiben geschnitten und anschließend mithilfe eines Hellfeld-Mikroskops und des Neurolucida-Systems analysiert. Quantitativ erfasst und analysiert wurden pyramidale Klasse 1-Neuronen der lateralen Amygdala inklusive absoluter Anzahl und Dichte der Spines an ihren Dendriten. Die Untersuchung zeigte bei SPRED2-KO-M{\"a}usen eine signifikante Erh{\"o}hung der mittleren L{\"a}nge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und eine tendenzielle Erh{\"o}hung der Gesamtzahl der Spines an den Dendriten in Branch order 1-3 gegen{\"u}ber den Wildtyp-M{\"a}usen. Daraus l{\"a}sst sich folgern, dass ein Knockout des SPRED2-Proteins sich auf die Morphologie der Neuronen der lateralen Amygdala auswirkt. Die erh{\"o}hte mittlere L{\"a}nge des apikalen Dendriten in Branch order 3 und die tendenziell erh{\"o}hte Spine-Anzahl korrelieren mit der gesteigerten synaptischen {\"U}bertragung und Erregbarkeit an amygdaloiden pyramidalen Neuronen. Auf molekularer Ebene kann die Hyperaktivit{\"a}t der lateralen Amygdala als Folge der fehlenden Inhibition des BDNF/TrkB-ERK-Signalwegs und der dadurch ver{\"a}nderten Expression zahlreicher synaptischer Proteine diskutiert werden. Die ver{\"a}nderte Morphologie der Neuronen in der lateralen Amygdala kann eine Ursache f{\"u}r das zwanghafte Verhalten der M{\"a}use sein, jedoch ist anzunehmen, dass Zwangsst{\"o}rungen nicht bloß eine monokausale Ursache haben. Diese Arbeit identifiziert SPRED2 als neuen Regulator der Morphologie und Aktivit{\"a}t von Synapsen und die Amygdala als wichtige Hirnregion bei der Entstehung von Zwangsst{\"o}rungen. SPRED2 ist somit ein vielversprechender Angriffspunkt f{\"u}r andere und spezifischere Untersuchungen der Hirnfunktion und eine potenzielle genetische Ursache f{\"u}r weitere neurologische Erkrankungen.}, subject = {SPRED2}, language = {de} } @phdthesis{Augustin2018, author = {Augustin, Anne Marie}, title = {Auswirkung der SPRED2-Defizienz auf die kardiale Funktion und Beeinflussung durch die Behandlung mit dem Aldosteronantagonisten Eplerenon}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-166029}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {SPRED2 ist ein Inhibitor des Ras/ERK-MAPK-Signalwegs. Um die Folgen einer SPRED2-Defizienz zu erforschen, wurden im Rahmen vorheriger von Ullrich et al. durchgef{\"u}hrter Untersuchungen mittels Gene-Trap-Methode bereits mannigfaltige Auff{\"a}lligkeiten im Ph{\"a}notyp der SPRED2-M{\"a}use festgestellt. So zeigten die Tiere einen Hypochondroplasie-{\"a}hnlichen Zwergenwuchs, Verhaltensauff{\"a}lligkeiten, einen krankhaft gesteigerten Wasserkonsum und nicht zuletzt eine deutlich reduzierte Lebenserwartung im Vergleich mit den WT-Tieren. Des Weiteren fielen erh{\"o}hte Aldosteronspiegel auf, die bei n{\"a}heren Untersuchungen nicht einer erh{\"o}hten Aktivit{\"a}t des RAAS geschuldet zu sein schienen. Vielmehr zeigte sich eine deutlich erh{\"o}hte Aldosteron-Synthase-Expression in der Nebennierenrinde. Erste Hinweise darauf, dass die SPRED2-Defizienz auch Auswirkungen auf den kardiologischen Ph{\"a}notyp haben k{\"o}nnte, ergaben sich bereits bei initialen Untersuchungen von Ullrich et al. So konnte bei den SPRED2-KO-Tieren neben h{\"a}modynamischer Auff{\"a}lligkeiten eine gesteigerte Herz-K{\"o}rpergewicht-Ratio festgestellt werden. Die im Rahmen dieses Folgeprojekts durchgef{\"u}hrten Untersuchungen sollten die Frage kl{\"a}ren, ob die Defizienz des SPRED2-Gens Auswirkungen auf die Herzleistung hat und hier{\"u}ber die verk{\"u}rzte Lebenserwartung der KO-Tiere verschulden k{\"o}nnte. Hierf{\"u}r wurden zun{\"a}chst Untersuchungen der elektrischen kardialen Aktivit{\"a}t mittels EKG und Elektrophysiologischer Untersuchung durchgef{\"u}hrt. Die Ermittlung von Herzrhythmusst{\"o}rung und die Quantifizierung derselben spielte hierbei eine besondere Rolle. Des Weiteren sollte mit der Durchf{\"u}hrung von PSR-F{\"a}rbungen zur Bestimmung des kardialen Kollagengehaltes histologischen Fragestellungen Rechnung getragen werden. Aufgrund des bereits aus den vorherigen Studien bekannten Hyperaldosteronismus der KO-Tiere stellte sich dar{\"u}ber hinaus die Frage, ob die im Rahmen der Studie feststellbaren kardiologischen Auff{\"a}lligkeiten als Konsequenz der gesteigerten Aldosteronwerte, oder aber als direkte Folge des Genotyps gewertet werden m{\"u}ssen. Aus diesem Grund wurden alle oben genannten Untersuchungen mit Tieren, welche einer Behandlung mit dem Aldosteronantagonisten Eplerenon zugef{\"u}hrt worden waren, wiederholt. Bei der Auswertung der basalen Ruhe- und Stress-EKGs zeigten sich einige Parameter bei den KO-Tieren pathologisch ver{\"a}ndert. So war das QRS-Intervall, als Korrelat zur intraventrikul{\"a}ren {\"U}berleitungszeit, bei den KO-M{\"a}usen verl{\"a}ngert, im Stress-EKG waren dar{\"u}ber hinaus sowohl die Dauer der P-Welle als auch des PQ-Intervalls erh{\"o}ht. Durch die Behandlung mit Aldosteron waren diese Unterschiede zwischen WT- und KO-Gruppe teilweise nicht mehr feststellbar. Das die atrioventrikul{\"a}re {\"U}berleitungszeit abbildende PQ-Intervall war sowohl im Vergleich mit dem behandelten WT, als auch mit dem unbehandelten WT nicht mehr signifikant erh{\"o}ht. Auch die L{\"a}nge des QRS-Komplexes n{\"a}herte sich unter Eplerenon-Behandlung dem der unbehandelten WT-Tiere an und sank bei der Stress-EKG-Auswertung sogar unterhalb des Signifkanzniveaus. Bei der EKG-Analyse in Bezug auf Arrhythmien ergab sich bei Gegen{\"u}berstellung der basalen WT- und KO-Gruppe eine deutlich gesteigerte Vulnerabilit{\"a}t f{\"u}r Herzrhythmusst{\"o}rungen bei den KO-Tieren. Durch die Behandlung mit Eplerenon konnte hierbei ein deutlicher Erfolg erzielt werden mit signifikanter Reduktion der Arrhythmieereignisse. Die elektrophysiologische Untersuchung ergab neben unauff{\"a}lligen Parametern der Funktion des Sinusknotens und der AV-{\"U}berleitung ebenfalls Hinweise f{\"u}r eine gesteigerte Empfindlichkeit f{\"u}r Arrhythmien. Die durch EPU induzierten Arrhythmien zeigten sich durch Eplerenon-Behandlung gleichermaßen r{\"u}ckg{\"a}ngig. Mittels Kollagenf{\"a}rbung konnte der initiale Verdacht, dass die SPRED2-KO-Tiere zu einer vermehrten kardialen Fibrosierung neigen, best{\"a}tigt werden. Dabei zeigte sich durch die Behandlung mit Eplerenon eine deutliche Beeinflussung und Reduktion des kardialen Kollagengehaltes. Insgesamt l{\"a}sst sich schlussfolgern, dass die mannigfaltigen ph{\"a}notypischen Effekte, die die SPRED2-Defizienz bedingt, nur teilweise dem Hyperaldosteronismus der Tiere geschuldet sind und durch therapeutische Einflussnahme auf diesen auch nur partiell kompensiert werden k{\"o}nnen.}, subject = {Spred-Proteine}, language = {de} } @article{TauscherNakagawaVoelkeretal.2018, author = {Tauscher, Sabine and Nakagawa, Hitoshi and V{\"o}lker, Katharina and Werner, Franziska and Krebes, Lisa and Potapenko, Tamara and Doose, S{\"o}ren and Birkenfeld, Andreas L. and Baba, Hideo A. and Kuhn, Michaela}, title = {β Cell-specific deletion of guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, accelerates obesity-induced glucose intolerance in mice}, series = {Cardiovascular Diabetology}, volume = {17}, journal = {Cardiovascular Diabetology}, number = {103}, doi = {10.1186/s12933-018-0747-3}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-176322}, year = {2018}, abstract = {Background: The cardiac hormones atrial (ANP) and B-type natriuretic peptides (BNP) moderate arterial blood pressure and improve energy metabolism as well as insulin sensitivity via their shared cGMP-producing guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor. Obesity is associated with impaired NP/GC-A/cGMP signaling, which possibly contributes to the development of type 2 diabetes and its cardiometabolic complications. In vitro, synthetic ANP, via GC-A, stimulates glucose-dependent insulin release from cultured pancreatic islets and β-cell proliferation. However, the relevance for systemic glucose homeostasis in vivo is not known. To dissect whether the endogenous cardiac hormones modulate the secretory function and/or proliferation of β-cells under (patho)physiological conditions in vivo, here we generated a novel genetic mouse model with selective disruption of the GC-A receptor in β-cells. Methods: Mice with a floxed GC-A gene were bred to Rip-CreTG mice, thereby deleting GC-A selectively in β-cells (β GC-A KO). Weight gain, glucose tolerance, insulin sensitivity, and glucose-stimulated insulin secretion were monitored in normal diet (ND)- and high-fat diet (HFD)-fed mice. β-cell size and number were measured by immunofluorescence-based islet morphometry. Results: In vitro, the insulinotropic and proliferative actions of ANP were abolished in islets isolated from β GC-A KO mice. Concordantly, in vivo, infusion of BNP mildly enhanced baseline plasma insulin levels and glucose-induced insulin secretion in control mice. This effect of exogenous BNP was abolished in β GC-A KO mice, corroborating the efficient inactivation of the GC-A receptor in β-cells. Despite this under physiological, ND conditions, fasted and fed insulin levels, glucose-induced insulin secretion, glucose tolerance and β-cell morphology were similar in β GC-A KO mice and control littermates. However, HFD-fed β GC-A KO animals had accelerated glucose intolerance and diminished adaptative β-cell proliferation. Conclusions: Our studies of β GC-A KO mice demonstrate that the cardiac hormones ANP and BNP do not modulate β-cell's growth and secretory functions under physiological, normal dietary conditions. However, endogenous NP/GC-A signaling improves the initial adaptative response of β-cells to HFD-induced obesity. Impaired β-cell NP/GC-A signaling in obese individuals might contribute to the development of type 2 diabetes.}, language = {en} } @phdthesis{JungbauergebUlzhoefer2018, author = {Jungbauer [geb. Ulzh{\"o}fer], Sandra Gabi}, title = {Die Rolle pr{\"a}synaptischer Proteine Aktiver Zonen bei konditionierten Lernprozessen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-169090}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2018}, abstract = {Synaptische Plastizit{\"a}t wird als Grundlage f{\"u}r Lern- und Ged{\"a}chtnisprozesse in unserem Gehirn angesehen. Aktive Zonen (AZ) und ihre spezifischen Proteine modulieren diesen Prozess und bahnen essentielle Vorg{\"a}nge der synaptischen Transmission. In dieser Arbeit wurden drei zentrale Proteine Aktiver Zonen - Bruchpilot, RIM (Rab3 interacting molecule) und Fife - untersucht und ihre Rolle bei konditionierten Lernprozessen in Drosophila melanogaster Larven gepr{\"u}ft. Hierzu wurde das etablierte Paradigma des larvalen appetitiven olfaktorischen Lernens genutzt, bei dem eine Gruppe von Larven lernt, einen Duft mit einem gustatorischen Verst{\"a}rker zu koppeln. Durch die vielf{\"a}ltigen genetischen Manipulationsm{\"o}glichkeiten des Modellorganismus war es m{\"o}glich, die Funktion der Proteine bei assoziativen Lernvorg{\"a}ngen selektiv zu betrachten. Bruchpilot wird f{\"u}r den funktionellen Aufbau Aktiver Zonen in Drosophila ben{\"o}tigt und ist wichtig f{\"u}r die Akkumulation von Calcium-Kan{\"a}len in der N{\"a}he von AZ. Durch gentechnische Ver{\"a}nderungen dieses Proteins ließ sich jedoch keine Beeintr{\"a}chtigung im olfaktorischen Lernverhalten von Drosophila Larven beobachten. RIM fungiert durch seine Interaktionsdom{\"a}nen als Bindeglied zwischen verschiedensten Effektoren und hat Einfluss auf synaptische Plastizit{\"a}t. Es wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der C2A-Dom{\"a}ne von RIM beim Menschen gleichzeitig zur Retinadegeneration und zu einem gesteigert verbalen IQ (Intelligenzquotient) f{\"u}hrt. Eine durch die hohe Homologie vergleichbare Mutation im Drosophila-Genom resultierte nicht in einem ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp im olfaktorischen Lernen. Fife ist ein Protein, das f{\"u}r eine funktionsf{\"a}hige Architektur von AZ und damit u.a. f{\"u}r den reibungslosen Vesikelverkehr zust{\"a}ndig ist. Es zeigte sich, dass dieses Protein auch synaptische Plastizit{\"a}t und Lernvorg{\"a}nge beeinflusst. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind ein Beitrag, um die Zusammenh{\"a}nge der synaptischen Plastizit{\"a}t und die Funktion Aktiver Zonen Proteine besser begreifen zu k{\"o}nnen. Hervorzuheben dabei ist, dass die Bruchpilot- und RIM-Mutanten-Larven keinen ver{\"a}nderten Ph{\"a}notyp, bzw. bei Fife nur teilweise einen eingeschr{\"a}nkten Ph{\"a}notyp im olfaktorischen larvalen Lernen im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen zeigten. Gleichwohl man fr{\"u}her schon signifikante strukturelle Ver{\"a}nderungen an Aktiven Zonen dieser Mutanten an der neuromuskul{\"a}ren Endplatte und auch Effekte auf das Verhalten in adulten Drosophila gefunden hat. Es wird entscheidend sein, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion Aktiver Zonen Proteine weiter zu konkretisieren.}, subject = {Plastizit{\"a}t}, language = {de} } @article{JanschGuentherWaideretal.2018, author = {Jansch, Charline and G{\"u}nther, Katharina and Waider, Jonas and Ziegler, Georg C. and Forero, Andrea and Kollert, Sina and Svirin, Evgeniy and P{\"u}hringer, Dirk and Kwok, Chee Keong and Ullmann, Reinhard and Maierhofer, Anna and Flunkert, Julia and Haaf, Thomas and Edenhofer, Frank and Lesch, Klaus-Peter}, title = {Generation of a human induced pluripotent stem cell (iPSC) line from a 51-year-old female with attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) carrying a duplication of SLC2A3}, series = {Stem Cell Research}, volume = {28}, journal = {Stem Cell Research}, doi = {10.1016/j.scr.2018.02.005}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-176654}, pages = {136-140}, year = {2018}, abstract = {Fibroblasts were isolated from a skin biopsy of a clinically diagnosed 51-year-old female attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) patient carrying a duplication of SLC2A3, a gene encoding neuronal glucose transporter-3 (GLUT3). Patient fibroblasts were infected with Sendai virus, a single-stranded RNA virus, to generate transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs). SLC2A3-D2-iPSCs showed expression of pluripotency-associated markers, were able to differentiate into cells of the three germ layers in vitro and had a normal female karyotype. This in vitro cellular model can be used to study the role of risk genes in the pathogenesis of ADHD, in a patient-specific manner.}, language = {en} } @article{BeckYuStrzelczykPaulsetal.2018, author = {Beck, Sebastian and Yu-Strzelczyk, Jing and Pauls, Dennis and Constantin, Oana M. and Gee, Christine E. and Ehmann, Nadine and Kittel, Robert J. and Nagel, Georg and Gao, Shiqiang}, title = {Synthetic light-activated ion channels for optogenetic activation and inhibition}, series = {Frontiers in Neuroscience}, volume = {12}, journal = {Frontiers in Neuroscience}, number = {643}, doi = {10.3389/fnins.2018.00643}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-177520}, year = {2018}, abstract = {Optogenetic manipulation of cells or living organisms became widely used in neuroscience following the introduction of the light-gated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2). ChR2 is a non-selective cation channel, ideally suited to depolarize and evoke action potentials in neurons. However, its calcium (Ca2\(^{2+}\)) permeability and single channel conductance are low and for some applications longer-lasting increases in intracellular Ca\(^{2+}\) might be desirable. Moreover, there is need for an efficient light-gated potassium (K\(^{+}\)) channel that can rapidly inhibit spiking in targeted neurons. Considering the importance of Ca\(^{2+}\) and K\(^{+}\) in cell physiology, light-activated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels would be welcome additions to the optogenetic toolbox. Here we describe the engineering of novel light-gated Ca\(^{2+}\)-permeant and K\(^{+}\)-specific channels by fusing a bacterial photoactivated adenylyl cyclase to cyclic nucleotide-gated channels with high permeability for Ca\(^{2+}\) or for K\(^{+}\), respectively. Optimized fusion constructs showed strong light-gated conductance in Xenopus laevis oocytes and in rat hippocampal neurons. These constructs could also be used to control the motility of Drosophila melanogaster larvae, when expressed in motoneurons. Illumination led to body contraction when motoneurons expressed the light-sensitive Ca\(^{2+}\)-permeant channel, and to body extension when expressing the light-sensitive K\(^{+}\) channel, both effectively and reversibly paralyzing the larvae. Further optimization of these constructs will be required for application in adult flies since both constructs led to eclosion failure when expressed in motoneurons.}, language = {en} } @phdthesis{Hasse2019, author = {Hasse, Stephanie}, title = {Funktionelle Charakterisierung von Parathormon-Rezeptor Mutanten im Xenopus Oozyten-Expressionssystem}, doi = {10.25972/OPUS-17861}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178613}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) regulieren eine Vielzahl physiologischer als auch pathophysiologischer Prozesse im menschlichen K{\"o}rper. Verankert in der Zellmembran vermitteln sie die Transduktion {\"a}ußerer Stimuli zur Aktivierung nachgeschalteter Signalwege. Durch die Aktivierung Adenylatcyclasen-, Phosphlipasen C- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)- abh{\"a}ngiger Signalwege, vermittelt der zur Familie B der GPCRs geh{\"o}rige Parathormon-Rezeptor PTH1R die endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-verwandten Proteins (PTHrP). Diese sind die Regulation der Kalzium-Hom{\"o}ostase, des Knochenmetabolismus und der Skelettentwicklung. In dieser Arbeit wurden vier Mutationen im PTH1-Rezeptor untersucht, die durch Roth und Mitarbeiter (2014) in den Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der prim{\"a}ren Zahndurchbruchsst{\"o}rung (PFE) gebracht wurden. Die vier untersuchten Mutanten sind PTH1R [P119L], PTH1R [H442D], PTH1R [L232R] und PTH1R [L292P]: Bei den durch Mutagenese herbeigef{\"u}hrten Punktmutationen handelt es sich jeweils um eine missense-Mutation, bei der der Austausch einer einzelnen Base in der DNA-Sequenz zum Einbau einer anderen Aminos{\"a}ure im Protein f{\"u}hrt. Es folgte die funktionelle Charakterisierung des Parathormon-Rezeptors und seiner Mutanten, welche auf einer indirekten Messung der Rezeptoraktivit{\"a}t basierte. Direkt gemessen wurden dabei die Kaliumstr{\"o}me der Tandemporen-Kaliumkan{\"a}le TASK-1 und TRESK, welche durch Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren reguliert werden k{\"o}nnen: So werden TASK-Str{\"o}me durch GPCRs inhibiert, TRESK-Str{\"o}me dagegen aktiviert. TASK-1 Kan{\"a}le und Parathormon-Rezeptoren wurden zeitgleich heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und anschließend mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) elektrophysiologisch untersucht. Nach Zugabe von PTH (100 nM) ergab sich nach Kopplung an den TASK-1 Kanal f{\"u}r den PTH1R-Wildtyp eine durchschnittliche Stromamplitude von 52,11 \% ± 3,60 \% (n=28). Dagegen zeigten sich f{\"u}r die PTH1R-Mutanten keine signifikanten {\"A}nderungen der Stromamplituden nach Zugabe der PTH-haltigen Messl{\"o}sung. Die Untersuchungen wurden mit dem TRESK-Kanal wiederholt. Hier zeigte sich eine deutliche TRESK-Aktivierung durch Kopplung an den PTH1R-Wildtyp beim Einwaschen von PTH. Bei den Mutanten kam es ebenfalls nicht zu einer signifikanten {\"A}nderung der Stromamplitude durch PTH-Zugabe. Ein Austausch dieser entsprechenden Aminos{\"a}uren f{\"u}hrt somit zu einem Funktionsverlust des Parathormon-Rezeptors Typ 1. Bei den untersuchten Mutationen handelt es sich daher um Loss-of-function-Mutationen. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die von Roth und Mitarbeitern in ihrer Pathogenit{\"a}t als „wahrscheinlich sch{\"a}dlich" eingestuften Mutationen durch die vorliegende Arbeit nun als „pathogen" und damit PFE-verursachend bezeichnet werden k{\"o}nnen. Die zahnmedizinische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begr{\"u}ndet, dass durch eine genetisch gesicherte Diagnose PFE, die korrekte und erfolgversprechendste Behandlungsoption gew{\"a}hlt werden kann. Von PFE betroffene Z{\"a}hne ankylosieren nach Applikation kieferorthop{\"a}discher Kr{\"a}fte und k{\"o}nnen nicht weiter bewegt werden. Somit kann nach der Diagnose PFE ein individuelles Behandlungskonzept erstellt werden, das sich nach dem Ausmaß der Durchbruchsst{\"o}rung richtet. Langj{\"a}hrige und frustrierende kieferorthop{\"a}dische Behandlungen bleiben dem Patienten, aber auch dem Kieferorthop{\"a}den erspart.}, subject = {Rezeptor}, language = {de} } @phdthesis{Aue2019, author = {Aue, Annemarie}, title = {Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Lungenfibrose in der Maus}, doi = {10.25972/OPUS-17671}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-176710}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Fragestellungen vermitteln neue Kenntnisse {\"u}ber die Pathogenese der Lungenfibrose auf zellul{\"a}rer Ebene. Bei der Lungenfibrose handelt es sich um eine chronische Erkrankung, die durch eine initiale Inflammation und das Auftreten von Myofibroblasten gekennzeichnet ist. Die Myofibroblasten f{\"u}hren zu einer vermehrten Produktion von EZM, was in einer Zerst{\"o}rung der Lungenarchitektur, Narbenbildung und folglich einem verminderten Gasaustausch resultiert. Eine modulatorische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) bei der Entwicklung der Lungenfibrose wird vermutet, dennoch sind die Effektorzellen in der Lunge noch nicht bekannt. Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Lokalisation des NO-Rezeptors, der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), in der Lunge untersucht. Dazu wurden Knockout-M{\"a}use generiert, bei denen die NO-GC global (GCKO) oder Perizyten-spezifisch (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO) deletiert ist. Zudem wurden tdTomato-Reporterm{\"a}use verwendet, die das Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines spezifischen Reporters exprimieren (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). In der Lunge sind Perizyten der NO-GC-exprimierende Zelltyp. Durch Immunhistochemie konnten zudem zwei verschiedene Subpopulationen von NO-GC-exprimierenden Perizyten identifiziert werden: Eine große Population an SMMHC/PDGFRβ-positiven Perizyten und eine kleine Population an NG2/PDGFRβ-positiven Perizyten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der NO-GC w{\"a}hrend der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Bleomycin f{\"u}hrt zu einer fibrotischen Antwort in allen Genotypen, was durch ein erh{\"o}htes Lungengewicht und einen erh{\"o}hten Kollagengehalt deutlich wird. Der Schweregrad der Lungenverletzung ist in NO-GC-defizienten M{\"a}usen gr{\"o}ßer als in Anwesenheit der NO-GC. Dies deutet auf eine Rolle der NO-GC bei der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. W{\"a}hrend der Entstehung der Lungenfibrose kommt es zur Bildung von Myofibroblasten, die als die Schl{\"u}sselzellen der Wundheilung und fibrotischer Prozesse bezeichnet werden. Diese Zellen kommen unter physiologischen Bedingungen kaum vor und ihre Herkunft ist nach wie vor nicht eindeutig gekl{\"a}rt. Da Perizyten als m{\"o}gliche Vorl{\"a}uferzellen betrachtet werden, wurde Lineage Tracing von Perizyten durchgef{\"u}hrt. Erstmals wurden zwei verschiedene Myofibroblasten-Subtypen durch die Expression von NO-GC unterschieden: (1) NO-GC-positive Myofibroblasten, die in der Alveolarwand lokalisiert sind und von Perizyten abstammen und (2) NO-GC-negative Myofibroblasten, die sich innerhalb der Alveolen befinden, deren Ursprung jedoch nicht Perizyten sind. Diese Myofibroblasten zeigen jedoch eine de novo-Synthese von PDGFRβ. Durch Lineage Tracing-Versuche sowie immunhistochemische Analysen k{\"o}nnen Perizyten, Endothelzellen und Fibrozyten als Vorl{\"a}uferzellen ausgeschlossen werden. Die Ursprungszelle der intra-alveol{\"a}ren Myofibroblasten ist somit bislang nicht identifiziert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle der an der Lungenfibrose beteiligten Zelltypen n{\"a}her untersucht. Dazu wurde die Aufl{\"o}sung der reversiblen Bleomycin-induzierten Lungensch{\"a}den betrachtet. Der Verlust der beiden Myofibroblasten-Subtypen weist darauf hin, dass sie zwar die Effektorzellen der Wundheilungsreaktion, jedoch nicht an der Entstehung der chronisch manifesten Fibrose beteiligt sind. Perizyten proliferieren in Folge der Gabe von Bleomycin und sind vermehrt im Lungenparenchym auch nach Aufl{\"o}sung der Bleomycin-induzierten Lungenverletzung vorzufinden. Diese Ergebnisse f{\"u}hren zu der Annahme, dass es sich hierbei um die Effektorzellen der chronisch manifesten Lungenfibrose handelt, die durch eine Verdickung der Alveolarwand gekennzeichnet ist. Um die zellul{\"a}ren Mechanismen der Lungenfibrose umfassend aufzukl{\"a}ren, m{\"u}ssen weitere Untersuchungen an irreversiblen Fibrosemodellen folgen, die auch die chronischen Charakteristiken der Erkrankung ber{\"u}cksichtigen.}, subject = {Lungenfibrose}, language = {de} } @phdthesis{Grotemeyer2019, author = {Grotemeyer, Alexander}, title = {Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\)}, doi = {10.25972/OPUS-17879}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the 'classical' Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions.}, subject = {Optogenetik}, language = {en} } @phdthesis{Tauscher2020, author = {Tauscher, Sabine Christine}, title = {Die Rolle von Atrialen und B-Typ Natriuretischen Peptiden bei der Regulation der Insulinsekretion und Funktion pankreatischer ß-Zellen}, doi = {10.25972/OPUS-20842}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-208427}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Die kardialen Hormone Atriales (ANP) und B-Typ (BNP) Natriuretisches Peptid {\"u}ben bekannte renale und kardiovaskul{\"a}re Effekte aus, welche durch ihren gemeinsamen, cGMP-bildenden Guanylatzyklase-Rezeptor A (GC-A) vermittelt werden. Diese Effekte sind entscheidend an der physiologischen Aufrechterhaltung des arteriellen Blutdrucks sowie des intravaskul{\"a}ren Blutvolumens beteiligt. Dar{\"u}ber hinaus zeigen aktuelle Studien, dass NPs die Mobilisierung von Fetts{\"a}uren aus dem Fettgewebe und deren Oxidation durch die Skelettmuskulatur steigern sowie die Thermogenese in braunem und weißem Fettgewebe aktivieren k{\"o}nnen. Dadurch k{\"o}nnen NPs den Energieverbrauch erh{\"o}hen und die Insulinsensitivit{\"a}t verbessern. Desweiteren ist {\"U}bergewicht mit einer gest{\"o}rten NP/GC-A/cGMP-Signal{\"u}bertragung verbunden, die m{\"o}glicherweise zur Entwicklung von Diabetes Typ 2 und dessen kardio-metabolischen Folgeerkrankungen beitr{\"a}gt. In vitro stimuliert synthetisches ANP {\"u}ber GC-A die Glukose-stimulierte Insulinsekretion aus kultivierten pankreatischen Inseln und die β-Zellproliferation. Die Bedeutung f{\"u}r die systemische Insulin/Glukosehom{\"o}ostase in vivo ist jedoch unklar. Um zu untersuchen, ob die endogenen Herzhormone die sekretorische Funktion und/oder die Proliferation von β-Zellen unter (patho)physiologischen Bedingungen in vivo modulieren, haben wir ein neues genetisches Mausmodell mit selektiver Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen (ß GC-A KO) generiert. In kultivierten Inseln von β GC-A KO-M{\"a}usen waren die insulinotropen und proliferativen Effekte von ANP aufgehoben. {\"U}bereinstimmend damit f{\"u}hrte die Infusion von BNP bei Kontroll-Tieren in vivo zu leicht erh{\"o}hten basalen Plasma-Insulinspiegeln und verbesserter Glukose-induzierter Insulinsekretion. Dieser Effekt von exogenem BNP konnte bei β GC-A KO-M{\"a}usen nicht beobachtet werden, was die effiziente Deletion des GC-A-Rezeptors in β-Zellen best{\"a}tigt. Interessanterweise hatte die Ablation des GC-A-Rezeptors auf ß-Zellen unter basalen Bedingungen keinen Einfluss auf physiologische und metabolische Parameter in vivo. Sowohl m{\"a}nnliche als auch weibliche ß GC-A KO-Tiere zeigten keine Unterschiede in der basalen Insulin- und Glukosehom{\"o}ostase, da sie {\"a}hnliche N{\"u}chtern-Blutzucker- und Insulinspiegel (nach Fasten {\"u}ber Nacht) aufwiesen wie die Kontroll-M{\"a}use. Allerdings zeigten die mit HFD gef{\"u}tterten β GC-A KO-Tiere fr{\"u}hzeitiger Glukose-Intoleranz sowie eine verminderte adaptive β-Zellproliferation. Abgesehen davon war das konsistenteste Ergebnis der in vivo-Studien der geschlechtsabh{\"a}ngige Unterschied in der Auswirkung der ß-Zellspezifischen GC-A-Deletion auf die Glukose-stimulierte Insulinsekretion. Weibliche, aber nicht m{\"a}nnliche ß GC-A KO-M{\"a}use zeigten erh{\"o}hte N{\"u}chtern-Insulinspiegel und eine signifikant erh{\"o}hte Glukose-stimulierte Insulinsekretion, was zu einer deutlich verbesserten Glukosetoleranz f{\"u}hrte. Der postulierte und untersuchte Mechanismus beinhaltet eine Interaktion von {\"O}strogenen und NPs, welche die Expression des mitochondrialen Uncoupling Protein 2 beeinflussen. Diese Arbeit erweitert das derzeitige Wissen {\"u}ber die metabolischen Effekte des NP/GC-A-Systems. Insbesondere zeigen die Ergebnisse, dass Natriuretische Peptide zu einer gesteigerten ß-Zellfunktion und Vitalit{\"a}t in fr{\"u}hen Stadien eines erh{\"o}hten Insulinbedarfs, d.h. bei Diabetes Typ 2, beitragen. Da die Studien eine wesentliche Rolle dieser kardialen Hormone im endokrinen Pankreas aufdecken, ist es umso wichtiger die pleiotropen Eigenschaften von NPs und ihre m{\"o}glichen therapeutischen Anwendungen bei kardio-metabolischen Erkrankungen weiter zu untersuchen.}, subject = {Guanylylzyklase}, language = {de} } @phdthesis{GuerreroGonzalez2020, author = {Guerrero Gonz{\´a}lez, Hans}, title = {Quantifizierung von pr{\"a}- und postsynaptischen Protein-Ver{\"a}nderungen in der Amygdala-Region in SPRED2-defizienten M{\"a}usen}, doi = {10.25972/OPUS-21670}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-216701}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {SPRED2 ist ein Membran-assoziiertes Protein, das als wichtiger Regulator der Zelle fungiert. Es {\"u}bt eine inhibitorische Wirkung auf dem Ras/ERK/MAPK-Signalweg und ist u.a. in der Neurogenese im zentralen Nervensystem beteiligt. Durch diverse Verhaltenstests in SPRED2-KO M{\"a}usen konnten OCD-{\"a}hnliche Symptome bei den Tieren festgestellt werden sowie eine vermehrte Aktivit{\"a}t in thalamo-amygdalen Synapsen. Zur weiteren Abkl{\"a}rung dieser synaptischen Dysfunktion, wurde eine Quantifizierung von pr{\"a}- und postsynaptischen Protein-Ver{\"a}nderungen in der Amygdala-Region in SPRED2-defizienten M{\"a}usen im Vergleich zur Wildtyp M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt. Hier konnten signifikante Unterschiede festgestellt werden.}, subject = {Spred-Proteine}, language = {de} } @article{TianYangGao2020, author = {Tian, Yuehui and Yang, Shang and Gao, Shiqiang}, title = {Advances, perspectives and potential engineering strategies of light-gated phosphodiesterases for optogenetic applications}, series = {International Journal of Molecular Sciences}, volume = {21}, journal = {International Journal of Molecular Sciences}, number = {20}, issn = {1422-0067}, doi = {10.3390/ijms21207544}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-236203}, year = {2020}, abstract = {The second messengers, cyclic adenosine 3′-5′-monophosphate (cAMP) and cyclic guanosine 3′-5′-monophosphate (cGMP), play important roles in many animal cells by regulating intracellular signaling pathways and modulating cell physiology. Environmental cues like temperature, light, and chemical compounds can stimulate cell surface receptors and trigger the generation of second messengers and the following regulations. The spread of cAMP and cGMP is further shaped by cyclic nucleotide phosphodiesterases (PDEs) for orchestration of intracellular microdomain signaling. However, localized intracellular cAMP and cGMP signaling requires further investigation. Optogenetic manipulation of cAMP and cGMP offers new opportunities for spatio-temporally precise study of their signaling mechanism. Light-gated nucleotide cyclases are well developed and applied for cAMP/cGMP manipulation. Recently discovered rhodopsin phosphodiesterase genes from protists established a new and direct biological connection between light and PDEs. Light-regulated PDEs are under development, and of demand to complete the toolkit for cAMP/cGMP manipulation. In this review, we summarize the state of the art, pros and cons of artificial and natural light-regulated PDEs, and discuss potential new strategies of developing light-gated PDEs for optogenetic manipulation.}, language = {en} } @article{JessenKressBaluapurietal.2020, author = {Jessen, Christina and Kreß, Julia K. C. and Baluapuri, Apoorva and Hufnagel, Anita and Schmitz, Werner and Kneitz, Susanne and Roth, Sabine and Marquardt, Andr{\´e} and Appenzeller, Silke and Ade, Casten P. and Glutsch, Valerie and Wobser, Marion and Friedmann-Angeli, Jos{\´e} Pedro and Mosteo, Laura and Goding, Colin R. and Schilling, Bastian and Geissinger, Eva and Wolf, Elmar and Meierjohann, Svenja}, title = {The transcription factor NRF2 enhances melanoma malignancy by blocking differentiation and inducing COX2 expression}, series = {Oncogene}, volume = {39}, journal = {Oncogene}, issn = {0950-9232}, doi = {10.1038/s41388-020-01477-8}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-235064}, pages = {6841-6855}, year = {2020}, abstract = {The transcription factor NRF2 is the major mediator of oxidative stress responses and is closely connected to therapy resistance in tumors harboring activating mutations in the NRF2 pathway. In melanoma, such mutations are rare, and it is unclear to what extent melanomas rely on NRF2. Here we show that NRF2 suppresses the activity of the melanocyte lineage marker MITF in melanoma, thereby reducing the expression of pigmentation markers. Intriguingly, we furthermore identified NRF2 as key regulator of immune-modulating genes, linking oxidative stress with the induction of cyclooxygenase 2 (COX2) in an ATF4-dependent manner. COX2 is critical for the secretion of prostaglandin E2 and was strongly induced by H\(_2\)O\(_2\) or TNFα only in presence of NRF2. Induction of MITF and depletion of COX2 and PGE2 were also observed in NRF2-deleted melanoma cells in vivo. Furthermore, genes corresponding to the innate immune response such as RSAD2 and IFIH1 were strongly elevated in absence of NRF2 and coincided with immune evasion parameters in human melanoma datasets. Even in vitro, NRF2 activation or prostaglandin E2 supplementation blunted the induction of the innate immune response in melanoma cells. Transcriptome analyses from lung adenocarcinomas indicate that the observed link between NRF2 and the innate immune response is not restricted to melanoma.}, language = {en} } @phdthesis{Pickel2020, author = {Pickel, Simone}, title = {Role of the β subunit of L-type calcium channels in cardiac hypertrophy}, doi = {10.25972/OPUS-19282}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-192829}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated. Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy.}, subject = {Herzhypertrophie}, language = {en} } @article{CapetianMuellerVolkmannetal.2020, author = {Capetian, Philipp and M{\"u}ller, Lorenz and Volkmann, Jens and Heckmann, Manfred and Erg{\"u}n, S{\"u}leyman and Wagner, Nicole}, title = {Visualizing the synaptic and cellular ultrastructure in neurons differentiated from human induced neural stem cells - an optimized protocol}, series = {International Journal of Molecular Sciences}, volume = {21}, journal = {International Journal of Molecular Sciences}, number = {5}, issn = {1422-0067}, doi = {10.3390/ijms21051708}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-236053}, year = {2020}, abstract = {The size of the synaptic subcomponents falls below the limits of visible light microscopy. Despite new developments in advanced microscopy techniques, the resolution of transmission electron microscopy (TEM) remains unsurpassed. The requirements of tissue preservation are very high, and human post mortem material often does not offer adequate quality. However, new reprogramming techniques that generate human neurons in vitro provide samples that can easily fulfill these requirements. The objective of this study was to identify the culture technique with the best ultrastructural preservation in combination with the best embedding and contrasting technique for visualizing neuronal elements. Two induced neural stem cell lines derived from healthy control subjects underwent differentiation either adherent on glass coverslips, embedded in a droplet of highly concentrated Matrigel, or as a compact neurosphere. Afterward, they were fixed using a combination of glutaraldehyde (GA) and paraformaldehyde (PFA) followed by three approaches (standard stain, Ruthenium red stain, high contrast en-bloc stain) using different combinations of membrane enhancing and contrasting steps before ultrathin sectioning and imaging by TEM. The compact free-floating neurospheres exhibited the best ultrastructural preservation. High-contrast en-bloc stain offered particularly sharp staining of membrane structures and the highest quality visualization of neuronal structures. In conclusion, compact neurospheres growing under free-floating conditions in combination with a high contrast en-bloc staining protocol, offer the optimal preservation and contrast with a particular focus on visualizing membrane structures as required for analyzing synaptic structures.}, language = {en} } @phdthesis{Dannhaeuser2021, author = {Dannh{\"a}user, Sven}, title = {Function of the Drosophila adhesion-GPCR Latrophilin/CIRL in nociception and neuropathy}, doi = {10.25972/OPUS-20158}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-201580}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {Touch sensation is the ability to perceive mechanical cues which is required for essential behaviors. These encompass the avoidance of tissue damage, environmental perception, and social interaction but also proprioception and hearing. Therefore research on receptors that convert mechanical stimuli into electrical signals in sensory neurons remains a topical research focus. However, the underlying molecular mechanisms for mechano-metabotropic signal transduction are largely unknown, despite the vital role of mechanosensation in all corners of physiology. Being a large family with over 30 mammalian members, adhesion-type G protein-coupled receptors (aGPCRs) operate in a vast range of physiological processes. Correspondingly, diverse human diseases, such as developmental disorders, defects of the nervous system, allergies and cancer are associated with these receptor family. Several aGPCRs have recently been linked to mechanosensitive functions suggesting, that processing of mechanical stimuli may be a common feature of this receptor family - not only in classical mechanosensory structures. This project employed Drosophila melanogaster as the candidate to analyze the aGPCR Latrophilin/dCIRL function in mechanical nociception in vivo. To this end, we focused on larval sensory neurons and investigated molecular mechanisms of dCIRL activity using noxious mechanical stimuli in combination with optogenetic tools to manipulate second messenger pathways. In addition, we made use of a neuropathy model to test for an involvement of aGPCR signaling in the malfunctioning peripheral nervous system. To do so, this study investigated and characterized nocifensive behavior in dCirl null mutants (dCirlKO) and employed genetically targeted RNA-interference (RNAi) to cell-specifically manipulate nociceptive function. The results revealed that dCirl is transcribed in type II class IV peripheral sensory neurons - a cell type that is structurally similar to mammalian nociceptors and detects different nociceptive sensory modalities. Furthermore, dCirlKO larvae showed increased nocifensive behavior which can be rescued in cell specific reexpression experiments. Expression of bPAC (bacterial photoactivatable adenylate cyclase) in these nociceptive neurons enabled us to investigate an intracellular signaling cascade of dCIRL function provoked by light-induced elevation of cAMP. Here, the findings demonstrated that dCIRL operates as a down-regulator of nocifensive behavior by modulating nociceptive neurons. Given the clinical relevance of this results, dCirl function was tested in a chemically induced neuropathy model where it was shown that cell specific overexpression of dCirl rescued nocifensive behavior but not nociceptor morphology.}, subject = {Drosophila}, language = {en} } @article{StetterLopezCaperuchipiHoppKraemeretal.2021, author = {Stetter, Christian and Lopez-Caperuchipi, Simon and Hopp-Kr{\"a}mer, Sarah and Bieber, Michael and Kleinschnitz, Christoph and Sir{\´e}n, Anna-Leena and Albert-Weißenberger, Christiane}, title = {Amelioration of cognitive and behavioral deficits after traumatic brain injury in coagulation factor XII deficient mice}, series = {International Journal of Molecular Sciences}, volume = {22}, journal = {International Journal of Molecular Sciences}, number = {9}, issn = {1422-0067}, doi = {10.3390/ijms22094855}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-284959}, year = {2021}, abstract = {Based on recent findings that show that depletion of factor XII (FXII) leads to better posttraumatic neurological recovery, we studied the effect of FXII-deficiency on post-traumatic cognitive and behavioral outcomes in female and male mice. In agreement with our previous findings, neurological deficits on day 7 after weight-drop traumatic brain injury (TBI) were significantly reduced in FXII\(^{-/-}\) mice compared to wild type (WT) mice. Also, glycoprotein Ib (GPIb)-positive platelet aggregates were more frequent in brain microvasculature of WT than FXII\(^{-/-}\) mice 3 months after TBI. Six weeks after TBI, memory for novel object was significantly reduced in both female and male WT but not in FXII\(^{-/-}\) mice compared to sham-operated mice. In the setting of automated home-cage monitoring of socially housed mice in IntelliCages, female WT mice but not FXII\(^{-/-}\) mice showed decreased exploration and reacted negatively to reward extinction one month after TBI. Since neuroendocrine stress after TBI might contribute to trauma-induced cognitive dysfunction and negative emotional contrast reactions, we measured peripheral corticosterone levels and the ration of heart, lung, and spleen weight to bodyweight. Three months after TBI, plasma corticosterone levels were significantly suppressed in both female and male WT but not in FXII\(^{-/-}\) mice, while the relative heart weight increased in males but not in females of both phenotypes when compared to sham-operated mice. Our results indicate that FXII deficiency is associated with efficient post-traumatic behavioral and neuroendocrine recovery.}, language = {en} } @article{PoppSchmittBoehrerLangeretal.2021, author = {Popp, Sandy and Schmitt-B{\"o}hrer, Angelika and Langer, Simon and Hofmann, Ulrich and Hommers, Leif and Schuh, Kai and Frantz, Stefan and Lesch, Klaus-Peter and Frey, Anna}, title = {5-HTT Deficiency in Male Mice Affects Healing and Behavior after Myocardial Infarction}, series = {Journal of Clinical Medicine}, volume = {10}, journal = {Journal of Clinical Medicine}, number = {14}, issn = {2077-0383}, doi = {10.3390/jcm10143104}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-242739}, year = {2021}, abstract = {Anxiety disorders and depression are common comorbidities in cardiac patients. Mice lacking the serotonin transporter (5-HTT) exhibit increased anxiety-like behavior. However, the role of 5-HTT deficiency on cardiac aging, and on healing and remodeling processes after myocardial infarction (MI), remains unclear. Cardiological evaluation of experimentally na{\"i}ve male mice revealed a mild cardiac dysfunction in ≥4-month-old 5-HTT knockout (-/-) animals. Following induction of chronic cardiac dysfunction (CCD) by MI vs. sham operation 5-HTT-/- mice with infarct sizes >30\% experienced 100\% mortality, while 50\% of 5-HTT+/- and 37\% of 5-HTT+/+ animals with large MI survived the 8-week observation period. Surviving (sham and MI < 30\%) 5-HTT-/- mutants displayed reduced exploratory activity and increased anxiety-like behavior in different approach-avoidance tasks. However, CCD failed to provoke a depressive-like behavioral response in either 5-Htt genotype. Mechanistic analyses were performed on mice 3 days post-MI. Electrocardiography, histology and FACS of inflammatory cells revealed no abnormalities. However, gene expression of inflammation-related cytokines (TGF-β, TNF-α, IL-6) and MMP-2, a protein involved in the breakdown of extracellular matrix, was significantly increased in 5-HTT-/- mice after MI. This study shows that 5-HTT deficiency leads to age-dependent cardiac dysfunction and disrupted early healing after MI probably due to alterations of inflammatory processes in mice.}, language = {en} } @article{PanzerZhangKonteetal.2021, author = {Panzer, Sabine and Zhang, Chong and Konte, Tilen and Br{\"a}uer, Celine and Diemar, Anne and Yogendran, Parathy and Yu-Strzelczyk, Jing and Nagel, Georg and Gao, Shiqiang and Terpitz, Ulrich}, title = {Modified Rhodopsins From Aureobasidium pullulans Excel With Very High Proton-Transport Rates}, series = {Frontiers in Molecular Biosciences}, volume = {8}, journal = {Frontiers in Molecular Biosciences}, issn = {2296-889X}, doi = {10.3389/fmolb.2021.750528}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-249248}, year = {2021}, abstract = {Aureobasidium pullulans is a black fungus that can adapt to various stressful conditions like hypersaline, acidic, and alkaline environments. The genome of A. pullulans exhibits three genes coding for putative opsins ApOps1, ApOps2, and ApOps3. We heterologously expressed these genes in mammalian cells and Xenopus oocytes. Localization in the plasma membrane was greatly improved by introducing additional membrane trafficking signals at the N-terminus and the C-terminus. In patch-clamp and two-electrode-voltage clamp experiments, all three proteins showed proton pump activity with maximal activity in green light. Among them, ApOps2 exhibited the most pronounced proton pump activity with current amplitudes occasionally extending 10 pA/pF at 0 mV. Proton pump activity was further supported in the presence of extracellular weak organic acids. Furthermore, we used site-directed mutagenesis to reshape protein functions and thereby implemented light-gated proton channels. We discuss the difference to other well-known proton pumps and the potential of these rhodopsins for optogenetic applications.}, language = {en} } @article{JanschZieglerForeroetal.2021, author = {Jansch, Charline and Ziegler, Georg C. and Forero, Andrea and Gredy, Sina and W{\"a}ldchen, Sina and Vitale, Maria Rosaria and Svirin, Evgeniy and Z{\"o}ller, Johanna E. M. and Waider, Jonas and G{\"u}nther, Katharina and Edenhofer, Frank and Sauer, Markus and Wischmeyer, Erhard and Lesch, Klaus-Peter}, title = {Serotonin-specific neurons differentiated from human iPSCs form distinct subtypes with synaptic protein assembly}, series = {Journal of Neural Transmission}, volume = {128}, journal = {Journal of Neural Transmission}, number = {2}, issn = {1435-1463}, doi = {10.1007/s00702-021-02303-5}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-268519}, pages = {225-241}, year = {2021}, abstract = {Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have revolutionized the generation of experimental disease models, but the development of protocols for the differentiation of functionally active neuronal subtypes with defined specification is still in its infancy. While dysfunction of the brain serotonin (5-HT) system has been implicated in the etiology of various neuropsychiatric disorders, investigation of functional human 5-HT specific neurons in vitro has been restricted by technical limitations. We describe an efficient generation of functionally active neurons from hiPSCs displaying 5-HT specification by modification of a previously reported protocol. Furthermore, 5-HT specific neurons were characterized using high-end fluorescence imaging including super-resolution microscopy in combination with electrophysiological techniques. Differentiated hiPSCs synthesize 5-HT, express specific markers, such as tryptophan hydroxylase 2 and 5-HT transporter, and exhibit an electrophysiological signature characteristic of serotonergic neurons, with spontaneous rhythmic activities, broad action potentials and large afterhyperpolarization potentials. 5-HT specific neurons form synapses reflected by the expression of pre- and postsynaptic proteins, such as Bassoon and Homer. The distribution pattern of Bassoon, a marker of the active zone along the soma and extensions of neurons, indicates functionality via volume transmission. Among the high percentage of 5-HT specific neurons (~ 42\%), a subpopulation of CDH13 + cells presumably designates dorsal raphe neurons. hiPSC-derived 5-HT specific neuronal cell cultures reflect the heterogeneous nature of dorsal and median raphe nuclei and may facilitate examining the association of serotonergic neuron subpopulations with neuropsychiatric disorders.}, language = {en} }