@phdthesis{Rovituso2016,
  author    = {Rovituso, Damiano},
  title     = {Die Rolle der autoreaktiven B-Zellen und Autoantik{\"o}rper in der Pathophysiologie der Multiplen Sklerose},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-141003},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Multiple Sklerose (MS) ist die h{\"a}ufigste neurologische Erkrankung, die bei jungen Erwachsenen zu dauerhaften k{\"o}rperlichen Einschr{\"a}nkungen f{\"u}hrt. Ein Kennzeichen der MS sind zeitlich und {\"o}rtlich disseminierte entz{\"u}ndliche L{\"a}sionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die L{\"a}sionsart, die am h{\"a}ufigsten auftritt, ist u. a. durch Antik{\"o}rperablagerungen charakterisiert. Die h{\"a}ufigste Verlaufsform der MS tritt in Sch{\"u}ben auf. Im Laufe der Erkrankung bilden sich die Symptome in der Mehrzahl der Patienten unvollst{\"a}ndig zur{\"u}ck und es entwickelt sich ein chronischer Verlauf. Trotz intensiver Forschung ist die {\"A}tiologie der MS bisher unbekannt Bis heute gibt es keine Biomarker, um den Therapieerfolg oder das Therapieversagen der MS-Basistherapeutika (Glatirameracetat und β-Interferon) zu bestimmen. Aktuelle Studien, bei denen B-Zellen depletiert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion MS-typischer L{\"a}sionen und der Schubrate bei der schubf{\"o}rmigen MS. Man vermutet, dass autoreaktive B-Zellen vielf{\"a}ltige Aufgaben in der Pathogenese der MS {\"u}bernehmen: sie produzieren Autoantik{\"o}rper, pr{\"a}sentieren autoreaktiven T-Zellen Autoantigene und sezernieren Mediatoren, die zur Aktivierung anderer Immunzellen f{\"u}hren. Es ist noch unklar, welche B-Zell-Untergruppe bei der MS besondere Relevanz hat. Vor kurzem wurden B1-Zellen beim Menschen beschrieben. Eine Studie zeigte, dass die Anzahl der B1-Zellen in unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt war. Des Weiteren wurden im ZNS von chronisch erkrankten MS-Patienten B-Zell-Aggregate nachgewiesen. Diese B-Zell-Aggregate {\"a}hneln sekund{\"a}ren lymphatischen Organen und k{\"o}nnten zur Progredienz der Erkrankung beitragen. Eine ex vivo-Studie zeigte, dass die B-Zell-Aggregat-Bildung durch das Adh{\"a}sionsmolek{\"u}l CEACAM1-(carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1) vermittelt wird. {\"U}berdies ist die Koexpression von CEACAM1 und TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3) f{\"u}r immunersch{\"o}pfte und tolerante T-Zellen charakteristisch. Schließlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass ZNS-reaktive B-Zellen nur im Blut von Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom und MS-Patienten nachweisbar waren. In meiner Studie habe ich den Einfluss von MS-Basistherapeutika und einer MS-Eskalationstherapie auf die B-Zell-Untergruppen untersucht. Dabei habe ich die naive B-Zell-, B-Ged{\"a}chtniszell-, B1-Zell- und Plasmablasten-Zahl von gesunden Probanden sowie unbehandelten und behandelten MS-Patienten miteinander verglichen. Die B-Zell-Untergruppen wurden durchflusszytometrisch untersucht. Die B1-Zell-Zahl war bei behandelten und unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt. In einer weiteren Studie konnte ich zeigen, dass die Anwesenheit von ZNS-reaktiven B-Zellen im Blut von glatirameracetat-behandelten MS-Patienten mit dem Therapieerfolg assoziiert war. Die ZNS-reaktiven B-Zellen wurden durch einen ZNS-Lysat-ELISPOT detektiert. Schließlich habe ich in einer dritten Studie die Expression von CEACAM1 und TIM-3 auf B-Zellen bei natalizumab-behandelten MS-Patienten durchflusszytometrisch untersucht. Im Vergleich zu gesunden Probanden zeigte sich, dass im Blut der MS-Patienten die CEACAM1+- und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B-Zell-Zahl signifikant erh{\"o}ht war. Im Gegensatz dazu waren CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T-Helferzellen signifikant erniedrigt in behandelten MS-Patienten. Meine Arbeit belegt, dass die B1-Zell-Population unabh{\"a}ngig von der MS-Therapie in MS-Patienten erniedrigt ist. Ungekl{\"a}rt bleibt, ob diese Erniedrigung eine Folge oder eine Ursache der Erkrankung ist. B1-Zellen sind die Quelle von nat{\"u}rlichen Antik{\"o}rpern in Mensch und Tier. Sie haben protektive Eigenschaften und sind bei der B-Zell-Toleranzinduktion beteiligt. Die protektiven Funktionen der nat{\"u}rlichen Antik{\"o}rper k{\"o}nnten durch die Erniedrigung der B1-Zell-Zahl ausbleiben. Zus{\"a}tzlich waren B-Zellen mit einem immunersch{\"o}pften Ph{\"a}notyp im Blut von MS-Patienten erh{\"o}ht. Trotz Stimulation konnte kein Ph{\"a}notyp bei T-Helferzellen induziert werden, der f{\"u}r tolerante und immunersch{\"o}pfte T-Zellen beschrieben worden ist. In zuk{\"u}nftigen Studien sollte man die B1-Zell-Zahl und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B- und -T-Zell-Zahl bei Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom im Liquor und im Blut untersuchen. Damit k{\"o}nnte man feststellen, ob B1-Zellen aus der Peripherie bei MS-Patienten in das ZNS migrieren. Die Anwesenheit ZNS-reaktiver B-Zellen im Blut von behandelten MS-Patienten zeigte sich in meiner Arbeit als ein Marker, um den Therapieerfolg zu dokumentieren. Eine weiterf{\"u}hrende Querschnittstudie (COPSELECT) wird ZNS-reaktive B-Zellen mittels ZNS-Lysat-ELISPOT als zuk{\"u}nftige Therapie-Biomarker ausf{\"u}hrlicher untersuchen. MS-Biomarker w{\"a}ren f{\"u}r den einzelnen Betroffenen von großer Bedeutung und h{\"a}tten ebenfalls gesundheits{\"o}konomisch eine hohe Relevanz.},
  subject      = {Multiple Sklerose},
  language  = {mul}
}
@phdthesis{Eichhorn2011,
  author    = {Eichhorn, Eva-Maria},
  title     = {Analyse der ontogenetischen Ver{\"a}nderungen in B-Zell-Subpopulationen im Kindes- und Erwachsenenalter},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72429},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {B-Lymphozyten sind die zellul{\"a}ren Tr{\"a}ger der humoralen Immunit{\"a}t des adaptiven Immunsystems. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Immundefekten und Autoimmunprozessen. In dieser Arbeit sollen Entwicklungsver{\"a}nderungen der peripheren B-Zell-Populationen von der Kindheit bis zum Erwachsenenalter charakterisiert und altersabh{\"a}ngige Referenzwerte generiert werden. In einer durchflusszytometrischen Analyse wurden daf{\"u}r sowohl relative als auch absolute H{\"a}ufigkeiten f{\"u}r naive B-Zellen, Ged{\"a}chtnis-B-Zellen, Transitionalzellen, Plasmablasten und CD21 low CD38 low B-Zellen untersucht. Die meisten B-Zell-Subpopulationen zeigen spezifische ontogenetische Ver{\"a}nderungen.},
  subject      = {Durchflusscytometrie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Muhammad2009,
  author    = {Muhammad, Khalid},
  title     = {Longterm impact of anti-CD20 mediated transient B cell depletion on memory B cells in patients with rheumatoid arthritis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36319},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {B-Lymphozyten leisten unterschiedliche Beitr{\"a}ge zur Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie produzieren Autoantik{\"o}rper, pr{\"a}sentieren Autoantigene und sch{\"u}tten verschiedene Zytokine, die am proinflammatorischen Prozess beteiligt sind, aus. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurden in den letzten Jahren Therapien entwickelt, die gezielt B-Lymphozyten ansteuern um direkt oder indirekt in den autoimmunen Krankheitsverlauf einzugreifen. Die zeitlich begrenzte B-Zell-Depletion mit Rituximab (anti CD20-Antik{\"o}rper) hat dabei in den letzten Jahren einen hohen Stellenwert erlangt und wird im klinischen Alltag insbesondere bei der Behandlung von Patienten mit rheumatoider Arthritis angewandt. Rituximab induziert im peripheren Blut bemerkenswerte Ver{\"a}nderungen in der Hom{\"o}ostase der B-Zell-Subpopulationen. Nach Therapie mit dem anti-CD20 Antik{\"o}rper Rituximab beginnt die Repletionsphase mit der peripheren Aussaat von transitionalen unreifen B-Zellen. Im weiteren Verlauf kommt es zu einer Normalisierung des naiven B-Zell-Pools. Das B-Zell Ged{\"a}chtnis und in besonderem Maße die IgD+CD27+ Ged{\"a}chtniszellen erholen sich nach Therapie nur langsam. In einer prospektiven klinischen Studie hat unsere Arbeitsgruppe gezeigt, dass die Gesamtzahl der Ged{\"a}chtniszellen gut mit der Dauer der klinischen Antwort auf Rituximab korreliert. Es ist wenig {\"u}ber die speziellen molekularen Ver{\"a}nderungen innerhalb der Ged{\"a}chtnis B-Zellen nach Rituximab Therapie bekannt. Um die Ver{\"a}nderungen im peripheren Blut zu verstehen untersuchten wir die somatische Mutationsfrequenz und das Muster der Ig-VH3 Gen Rearrangements, indem wir pr{\"a}- und posttherapeutisch bei 18 Patienten einzelne B-Zellen isolierten und den individuellen B-Zellrezeptor durch eine Einzelzell RT-PCR amplifizierten und sequenzierten. Wir verglichen das Mutationsmuster nach erfolgreicher B-Zelldepletion in den neu rezirkulierenden Ged{\"a}chtnis B-Zellen mit dem Mutationsmuster von vier Gesunden Blutspendern und sechs nicht-RA Patienten, die eine Hochdosis Chemotherapie mit anschließender autologer oder allogener Stammzelltransplantation erhalten hatten. Zun{\"a}chst haben wir die Zusammensetzung der Ged{\"a}chtniszellen im peripheren Blut analysiert. Der Ph{\"a}notyp der peripheren pr{\"a}-switch (IgD+CD27+) und post-switch (IgD-CD27+) Ged{\"a}chtniszellen zeigte keine quantitativen Unterschiede in RA-Patienten im Vergleich zu Gesunden. Bei der direkten Analyse des B-Zell Immunglobulin Rezeptors fanden sich jedoch zwischen klassengeswitchten und ungeswitchten Ged{\"a}chtnis B-Zellen signifikante Unterschiede in der Anzahl der Mutationen in der variablen Region der Ig Rezeptors. Die Population der IgD+CD27+ Ged{\"a}chtniszellen beinhaltete sowohl nicht mutierte, wenig mutierte und stark mutierte (Median= 9 Mutationen pro Sequenz) rearrangierte Ig- Rezeptoren, wohingegen die IgD-CD27+ Ged{\"a}chtniszellen einen durchgehend hoch mutierten (Median = 18 Mutationen pro Sequenz) Rezeptor aufwiesen. Der Unterschied zwischen beiden Gruppen war signifikant (Mutationsfrequenzen 3.83±0.19\% vs. 7.1±0.53\%; P=0.0001). Grundlegende Ver{\"a}nderungen wurden bei den rezirkulierenden ungeswitchten Ged{\"a}chtniszellen (IgD+CD27+) nach vor{\"u}bergehender B-Zell Depletion mit Rituximab festgestellt. Diese Zellen wurden bis 6 Jahre nach Rituximab beobachtet und zeigten eine stark verz{\"o}gerte Zunahme an Mutationen im Ig-Rezeptor. Ein Jahr nach einmaliger Gabe von Rituximab waren 84\% der einzelnen zirkulierenden IgD+/CD27+ B-Zellen unmutiert. Zu diesem Zeitpunkt fanden sich keine stark mutierten Ig-VH3 Gen Rearrangements (P=0.0001). Mit zunehmendem Abstand zur B-Zell depletierenden Therapie konnten in der Repopulationsphase zunehmende Zahlen an Mutationen in den B-Zell Ig Rezeptoren festgestellt werden. Beispielsweise waren w{\"a}hrend des 2. Jahres der Regeneration (P=0.0001) 7.8\%, sowie nach 4 Jahren nur 14\% der Ig Rezeptoren mutiert. Sogar 6 Jahre nach Behandlung, waren VH Mutationen in IgD+ Ged{\"a}chtniszellen noch deutlich vermindert. Selbst nach dieser Zeit fanden sich in der pr{\"a}-switch Ged{\"a}chtnispopulation nur 27\% hochmutierte Sequenzen w{\"a}hrend vor der passageren B-Zelldepletion 52\% ein hohe Zahl an Mutationen trugen (P=0.0001). Die posttherapeutische Analyse der CDR3 L{\"a}nge der regenerierten IgD+ Ged{\"a}chtniszellen ergab eine erh{\"o}hte CDR3 L{\"a}nge, die signifikant mit der Anzahl der nicht mutierten VH Genrearrangements w{\"a}hrend der Repletionsphase korreliert. Interessanterweise regenerierten Patienten nach Hochdosis Chemotherapie und allogener Stammzelltransplantation ihre IgD+ Ged{\"a}chtniszellen mit einer deutlich h{\"o}heren Anzahl an Mutationen. Ein Jahr nach Transplantation zeigten die Ig Rezeptoren schon 22\% hoch mutierte und 42\% unmutierte VH Rearrangements. Das zeigt, dass eine gegen CD20 gerichtete Behandlung nicht nur eine Verz{\"o}gerung der Produktion der ungeswitchten Ged{\"a}chtniszellen zur Folge hat, sondern dar{\"u}ber hinaus einen signifikanten Effekt auf die Mutationsrate im pr{\"a}switch Ged{\"a}chtnis B-Zellpool besitzt. Im Gegensatz zum Mutationsmuster der IgD+ Ged{\"a}chtniszellen regenerierten die klassengeswitchten Ged{\"a}chtniszellen nach anti-CD20 Depletion im peripheren Blut mit quantitativ normalen Mutationen im Ig Rezeptor. Interessanterweise fand sich allerdings eine {\"A}nderung der exprimierten Isotypen mit deutlicher Dominanz IgA exprimierender B Zellen. Weitere Analysen der klassengeswitchten Ged{\"a}chtnis B-Zellen zeigen außerdem eine Therapie induzierte qualitative Ver{\"a}nderung dieses B-Zellpools. So waren posttherapeutisch die Mutationen in bestimmten T-Zell abh{\"a}ngigen Mutationshotspots, dem RGYW/WRCY Motiv, signifikant vermehrt (Mutationstargeting vor Therapie 27\% vs. 43\% nach Rituximab, P=0.0003). Dies weist darauf hin, dass die Mechanismen der Affinit{\"a}tsreifung im klassengeswitchten B-Zellged{\"a}chtnis vor und nach B-Zelldepletion unterschiedlich funktionieren. Der Mutationsmechanismus selbst ist allerdings in diesen Zellen quantitativ nicht eingeschr{\"a}nkt. Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit zum erstem mal, dass es nach einer passageren B-Zelldepletion mit anti-CD20 Antik{\"o}rpern zu einer {\"u}ber Jahre hinweg nachweisbaren ausgepr{\"a}gten Verz{\"o}gerung in der Aquisition von somatischen Mutationen in rearrangierten VH Genen der IgD+ Ged{\"a}chtniszellen kommt. Demgegen{\"u}ber erholt sich das klassengeswitchte B-Zellged{\"a}chtnis mit uneingeschr{\"a}nkter Zahl von Mutationen im Ig Rezeptor. Diese Resultate zeigen, dass anti-CD20 gerichtete Therapien in besonderem Maße IgD+ Ged{\"a}chtniszellen beeinflussen. Der Selektionsdruck durch Antigene und/oder die Selektion der Ig Rezeptoren erscheint unter diesen Bedingungen speziell bei IgD-Ged{\"a}chtnis B-Zellen reduziert. Die Daten unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass pr{\"a}-switch Ged{\"a}chtnis B-Zellen im Vergleich zu post-switch Ged{\"a}chtnis B-Zellen andere Bedingungen f{\"u}r die Aktivierung der Mutationsmaschinerie ben{\"o}tigen. Die Resultate er{\"o}ffnen neue Wege f{\"u}r das Verst{\"a}ndnis der Pathophysiologie der B-Zell Ged{\"a}chtnisentwicklung und k{\"o}nnen helfen neue zielgerichtete Therapien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu konzipieren.},
  subject      = {Rheumatoider arthritis},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Klein2005,
  author    = {Klein, J{\"o}rg},
  title     = {Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberfl{\"a}chenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialins{\"a}ure bindende Ig{\"a}hnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazellul{\"a}re Immunoglobulin-{\"a}hnliche Dom{\"a}nen und kann {\"u}ber die {\"a}ußerste V-set Dom{\"a}ne seine Liganden: \&\#945;2,6 verkn{\"u}pfte Sialins{\"a}uren binden. CD22 hat eine Transmembrandom{\"a}ne und eine cytoplasmatische Dom{\"a}ne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente M{\"a}use zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdom{\"a}ne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdom{\"a}ne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Ph{\"a}notyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adh{\"a}sions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenh{\"a}ngen. Der „Targeting" Vektor f{\"u}r die „Gene Targeting" Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Urspr{\"u}nglich wurde ein „Targeting" Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir f{\"u}r ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchim{\"a}re M{\"a}use erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie f{\"u}r neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verl{\"a}ngerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5'-Richtung verl{\"a}ngert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erh{\"o}hen, durchgef{\"u}hrt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot best{\"a}tigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten f{\"u}nf chim{\"a}re Tiere gewonnen werden. Ein 80 \%ig chim{\"a}res M{\"a}nnchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie f{\"u}r die Gene Targeting Experimente f{\"u}r einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c M{\"a}usen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilit{\"a}t ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Dom{\"a}ne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor f{\"u}hrte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der urspr{\"u}nglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-\&\#946; Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene n{\"a}her zu untersuchen. Von Erwin B{\"o}ttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-\&\#946; Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-\&\#946; Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Ver{\"a}nderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erh{\"o}hung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der f{\"u}r TGF-\&\#946; beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- M{\"a}use hingegen nicht beeintr{\"a}chtigt.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gross2003,
  author    = {Gross, Tim Philipp},
  title     = {Transkriptionelle Regulation des CD23a-Promotors in Zellen chronischer lymphatischer Leuk{\"a}mien vom B-Zelltyp},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7344},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {Die Expression und Regulation des Gens f{\"u}r den niedrig affinen Immunglobulin E-Rezeptor, von welchem beim Menschen zwei Isoformen existieren, unterscheidet sich deutlich zwischen B-Lymphozyten der chronisch lymphatischen Leuk{\"a}mie und normalen B-Zellen. Eine Untersuchung auf Promotorebene erscheint daher interessant; da der Promotor der Isoform b schon relativ gut charakterisiert ist, wurde in dieser Arbeit der CD23a-Core-Promotor n{\"a}her betrachtet. Ein besonderes Augenmerk galt dabei putativen Bindungsstellen f{\"u}r STAT6. Das Bindungsverhalten von Transkriptionsfaktoren an Promotor-DNA wurde mit Gel-Retardierungsexperimenten (EMSA) untersucht. Hierzu wurden CD23a-Core-Promotor-Oligonukleotide zusammen mit Kernproteinextrakten aus Stimulationsans{\"a}tzen von B-CLL- und normalen B-Zellen mit IL-4, IFN-g und PMA genutzt. Die EMSA-Experimente zeigten trotz unterschiedlicher Stimulationsans{\"a}tze ein sich wiederholendes Bandenmuster, sodass die DNA-Protein-Interaktion auf Core-Promotorebene keine ausreichende Erkl{\"a}rung f{\"u}r die differentielle Regulation der Genexpression lieferte. Allerdings zeigten analoge EMSA-Versuche mit Kernextrakten einer EBV-transformierten Zelllinie ein leicht ver{\"a}ndertes Bandenmuster, was auf ein ver{\"a}ndertes Profil an Transkriptionsfaktoren am CD23a-Core-Promotor nach EBV-Transformation hindeuten kann. Eine weitere Analyse der Core-Promotorregion mittels der DNase-I-Footprint-Technik wurde durch die Klonierung geeigneter Vektoren und Etablierung einer Positivkontrolle vorbereitet. Da IL-4 den Hauptregulator auch der CD23a-Expression darstellt, war ein zentraler Teil der Arbeit die Charakterisierung von STAT6-Bindungsstellen im CD23a-Core-Promotor. Durch Sequenzanalyse wurden 2 putative STAT6-Bindungsstellen identifiziert. Mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten konnte f{\"u}r eine der beiden Stellen (Nukleotidsequenz TAC CTGA GAA, Position 77-86 im CD23a-Core-Promotor) eine STAT6-Bindungsf{\"a}higkeit nachgewiesen werden; diese Bindungsstelle zeigte im Vergleich zu ihrem schon bekannten Gegenpart im CD23b-Promotor ein etwas schw{\"a}cheres Bindungsverm{\"o}gen f{\"u}r STAT6.Entscheidend f{\"u}r die Regulation der CD23-Expression sind wahrscheinlich das Zusammenspiel von STAT6 mit anderen Transkriptionsfaktoren wie Krox20 und NF-kB sowie alternative Signaltransduktionswege; auch Proto-Onkogene wie bcl-6 und Notch2 sind bei der Expression von CD23 von Bedeutung. Deren Rolle f{\"u}r die Pathogenese der B-CLL muss noch untersucht werden.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Danzer2002,
  author    = {Danzer, Claus-Peter},
  title     = {Generierung von chim{\"a}ren M{\"a}usen mit Mutationen in der Signalleitungs-Dom{\"a}ne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-M{\"a}usen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialins{\"a}ure-bindende Immunglobulin-{\"a}hnliche Lectine). Mit der {\"a}ußersten der 7 extrazellul{\"a}ren Ig-{\"a}hnlichen Dom{\"a}nen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialins{\"a}ure interagieren. In der cytoplasmatischen Dom{\"a}ne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungekl{\"a}rt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerst{\"o}rte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Dom{\"a}ne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren f{\"u}r CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. F{\"u}r beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingef{\"u}hrten Mutationen vollst{\"a}ndig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chim{\"a}re Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank erm{\"o}glichte die Verl{\"a}ngerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch {\"o}ffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Ver{\"a}nderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerst{\"o}rten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalit{\"a}t des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig f{\"u}r die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialins{\"a}ure auf der selben Zelloberfl{\"a}che (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialins{\"a}ure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5\% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-M{\"a}usen, aber nur ca. 4,5\% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- M{\"a}usen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialins{\"a}ure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In {\"U}bereinstimmung damit f{\"u}hrte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abh{\"a}ngiger Demaskierung. 4. FACS-F{\"a}rbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- M{\"a}usen um ca. 70-80\% gegen{\"u}ber wt-M{\"a}usen verkleinert ist. In Best{\"a}tigung fr{\"u}herer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabh{\"a}ngige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- M{\"a}usen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant st{\"a}rker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- M{\"a}usen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Knoedel2000,
  author    = {Kn{\"o}del, Matthias},
  title     = {Regulation der terminalen B-Zell-Differenzierung durch Blimp-1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1571},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Ged{\"a}chtniszelle ein, der sowohl durch die Affinit{\"a}tsreifung als auch den Klassensprung zu sekund{\"a}ren Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchl{\"a}uft, ist abh{\"a}ngig von der Intensit{\"a}t und der Dauer des BZR-Signals, von der Verf{\"u}gbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen" der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszul{\"o}sen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Ged{\"a}chtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, prim{\"a}rer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung {\"u}ber den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdr{\"u}ckt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die f{\"u}r Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Ged{\"a}chtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdr{\"u}ckung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abh{\"a}ngige Signalgebung {\"u}ber CD40 und IL-4 unterdr{\"u}ckt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist f{\"u}r den Eintritt und das Durchlaufen des Ged{\"a}chtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren {\"u}berexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die {\"U}berexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abh{\"a}ngigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung f{\"u}hrt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repr{\"a}sentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erh{\"o}hte Konzentration der f{\"u}r die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfl{\"a}che und sezernieren f{\"u}r kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Ph{\"a}notyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen f{\"u}hrt zum Verlust des differenzierten Ph{\"a}notyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen m{\"o}glich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verh{\"a}ltnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abh{\"a}ngigen, proiliferationsf{\"o}rdernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung f{\"u}r die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits f{\"u}r B-Zellen diskutiert. Auch in prim{\"a}ren B-Zellen f{\"u}hrt Blimp-1 zu einer verst{\"a}rkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen {\"U}berexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so {\"u}berleben diese Zellen wieder erheblich l{\"a}nger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Ph{\"a}notyp, charakterisiert durch die verst{\"a}rkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod k{\"o}nnen in diesem System daher entkoppelt werden. In prim{\"a}ren Zellen f{\"u}hrt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molek{\"u}len wie A1 verl{\"a}ngerbar.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}