@phdthesis{Klein2014,
  author    = {Klein, Teresa},
  title     = {Lokalisationsmikroskopie f{\"u}r die Visualisierung zellul{\"a}rer Strukturen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die Einf{\"u}hrung der Fluoreszenzmikroskopie erm{\"o}glicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Aufl{\"o}sung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierf{\"u}r photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz r{\"a}umlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu k{\"o}nnen. Aus tausenden Einzelmolek{\"u}l-Lokalisationen wird ein k{\"u}nstliches, hochaufgel{\"o}stes Bild rekonstruiert. Die hochaufl{\"o}sende Mikroskopie ist grade f{\"u}r die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzellul{\"a}re Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu k{\"o}nnen. Als Marker k{\"o}nnen sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. W{\"a}hrend die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der h{\"o}heren Photonenausbeute eine pr{\"a}zisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren {\"u}ber sogenannte chemische Tags erm{\"o}glicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gef{\"a}rbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich f{\"u}r die Hochaufl{\"o}sung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden k{\"o}nnen. F{\"u}r besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings k{\"o}nnen unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfl{\"a}che mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photosch{\"a}digung m{\"o}glichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die M{\"o}glichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu k{\"o}nnen, stellt einen großen Gewinn f{\"u}r die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der urspr{\"u}nglich farbstoffgekoppelte Antik{\"o}rper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgekl{\"a}rt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellul{\"a}r vorhandene Peptide gr{\"o}ßere Aggregate formen als die im extrazellul{\"a}ren Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen.},
  subject      = {Hochaufl{\"o}sendes Verfahren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Proppert2014,
  author    = {Proppert, Sven Martin},
  title     = {Design, implementation and characterization of a microscope capable of three-dimensional two color super-resolution fluorescence imaging},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107905},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {This thesis reviews the fundamentals of three-dimensional super-resolution localization imaging. In order to infer the axial coordinate of the emission of single fluorophores, the point spread function is engineered following a technique usually referred to as astigmatic imaging by the introduction of a cylindrical lens to the detection path of a microscope. After giving a short introduction to optics and localization microscopy, I outline sources of aberrations as frequently encountered in 3D-localization microscopy and will discuss their respective impact on the precision and accuracy of the localization process. With the knowledge from these considerations, experiments were designed and conducted to verify the validity of the conclusions and to demonstrate the abilities of the proposed microscope to resolve biological structures in the three spatial dimensions. Additionally, it is demonstrated that measurements of huge volumes with virtually no aberrations is in principle feasible. During the course of this thesis, a new method was introduced for inferring axial coordinates. This interpolation method based on cubic B-splines shows superior performance in the calibration of a microscope and the evaluation of subsequent measurement and will therefore be used and explained in this work. Finally, this work is also meant to give future students some guidance for entering the field of 3D localization microscopy and therefore, detailed protocols are provided covering the specific aspects of two color 3D localization imaging.},
  subject      = {Dimension 3},
  language  = {en}
}