@phdthesis{Baumann2013, author = {Baumann, Melanie}, title = {Optogenetische Simulation und Analyse elektrischer und Calcium-basierter Signale in Pflanzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-87974}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Funktionelle Expression von ChR2 in Pflanzen In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig die funktionelle Expression des licht-aktivierten Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii in h{\"o}heren Pflanzen gezeigt werden. Obwohl die erfolgreiche Transformation auf der Basis der Integration einer Expressionskassette f{\"u}r WT-ChR2 in Pflanzen genetisch nachgewiesen werden konnte, war ein funktioneller Nachweis nicht m{\"o}glich. Demgegen{\"u}ber war die funktio-nelle Expression aller getesteten ChR2-Mutanten im transienten Expressionsansatz er-folgreich und konnte schließlich auf der Basis der im Rahmen dieser Arbeit generierten Konstrukte auch f{\"u}r stabil transformierte Arabidopsis-Pflanzen best{\"a}tigt werden. ChR2 wurde in Arabidopsis-Protoplasten sowie Tabak-Epidermis- und Mesophyllzellen an der Plasmamembran lokalisiert, zeigte jedoch aufgrund der {\"U}berexpression eine starke {\"U}berladung des Endomembransystems. Elektrophysiologische Messungen mit Hilfe der Einstichtechnik belegten, dass ChR2 sowohl in Arabidopsis-Keimlingen als auch im Tabakmesophyll funktionell ist, wobei sich die erzeugten Blaulicht-vermittelten Depolarisationen weitaus erfolgreicher im Ta-baksystem darstellten. Alle eingesetzten ChR2-Mutanten waren funktionell und zeigten in Einstichmessungen mit Oozytendaten korrelierende Kinetiken. Die Mutante C128A wurde hinsichtlich der erzielten lichtinduzierten Membranpotentialdepolarisationen als effektivste ChR2-Variante identifiziert. Calcium-Messungen mit dem Reporterprotein Aequorin lieferten keinen Beweis f{\"u}r einen direkt durch ChR2-C128A vermittelten Calcium-Einstrom in Arabidopsis-Protoplasten. Jedoch konnte ein cytosolischer Calcium-Anstieg ca. 3min nach Blau-lichtapplikation beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass die durch ChR2 vermittelten Membranpotential{\"a}nderungen zu einer Aktivierung endogener, Calcium-permeabler Ionenkan{\"a}le f{\"u}hren k{\"o}nnte. F{\"u}r die ChR2-L132C Mutante konnte allerdings in ersten Messungen ein direkter Calcium-Anstieg nach Lichtgabe beobachtet werden.   Transkriptionelle {\"A}nderungen aufgrund ChR2-basierter, elektrischer Signalmuster In RNA-Seq-Analysen mit transient transformierten Tabakbl{\"a}ttern konnte die Bedeu-tung der Signalsignatur elektrischer bzw. Calcium-basierter Signale verifiziert werden: Die Applikation zweier in ihrer Form g{\"a}nzlich unterschiedlicher elektrischer Signal-muster lieferte ein signifikant unterschiedlich reguliertes Set an Genen, wobei einige wenige durch beide Behandlungen induziert werden konnten. Langanhaltende Depolari-sationen regulierten deutlich mehr Gene und waren daher in ihrer Wirkung weitaus ef-fektiver als kurze, repetitive Depolarisationen. Die bioinformatische Analyse dieser Daten zeigte, dass die Nachahmung eines im Zuge der Pathogenantwort bekannten, langen Depolarisationspulses Gene der Flagellin-induzierten Signaltransduktion adressierte, w{\"a}hrend kurze, wiederkehrende Pulse mit gleichem Informationsgehalt diese nicht regulierten.}, subject = {Channelrhodopsin-2}, language = {de} } @phdthesis{Stangl2012, author = {Stangl, Christoph}, title = {Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unver{\"o}ffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz {\"u}ber das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einw{\"a}rts-Str{\"o}me gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei ann{\"a}hernd unabh{\"a}ngig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in h{\"o}heren Pflanzen gezeigt werden. Nach Best{\"a}tigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zus{\"a}tzlich und unter der Kontrolle eines {\"o}strogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der M{\"o}glichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums {\"u}ber Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind ph{\"a}notypische Auff{\"a}lligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verz{\"o}gerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verz{\"o}gerte Keimung normal und uneingeschr{\"a}nkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschl{\"a}uche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unver{\"a}ndertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ans{\"a}tzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des {\"o}strogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. {\"U}ber den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsf{\"a}higes Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt.}, subject = {Calciumion}, language = {de} } @phdthesis{Ruemer2013, author = {R{\"u}mer, Stefan}, title = {Untersuchungen zur oxidativen Bildung von Stickstoffmonoxid in Pflanzen sowie zur Visualisierung von Stickstoffmonoxid mittels Fluoreszenzfarbstoffen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77115}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasf{\"o}rmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen {\"u}ber einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nos{\"a}ure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielf{\"a}ltige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spalt{\"o}ffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifit{\"a}t der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in fr{\"u}heren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, n{\"a}mlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxams{\"a}ure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) k{\"o}nn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde {\"u}berpr{\"u}ft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber {\"u}berraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerh{\"o}henden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum {\"U}berstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im {\"U}berstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anh{\"a}ufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 f{\"u}r eine verst{\"a}rkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivit{\"a}t nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg {\"a}hnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch h{\"o}here Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerh{\"o}hung ohne Anwesenheit von NO erh{\"a}rtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte n{\"a}her zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Fl{\"u}ssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden tats{\"a}chlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzuf{\"u}gen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellul{\"a}ren Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr fr{\"u}h eluierender Substanzen zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem {\"U}berstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch {\"u}berhaupt nicht auf. Vorl{\"a}ufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt.}, subject = {Stickstoffmonoxid}, language = {de} } @phdthesis{Schaefer2012, author = {Sch{\"a}fer, Barbara}, title = {Untersuchungen zur Regulation der Invertaseaktivit{\"a}t und zu Invertaseinhibitoren aus Pflanzenextrakten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-71469}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {Die Spaltung verschiedener Zuckerverbindungen ist ein elementarer Vorgang in allen Lebewesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Enzyme untersucht, die Saccharose, einen wichtigen Energietr{\"a}ger und Botenstoff, in Fructose und Glucose spalten. Sie liefert einen umfassenden {\"U}berblick saccharosespaltender Enzyme und deren Inhibitoren, der erstmals die Gebiete der β-Fructofuranosidasen und der α-Glucosidasen vereinigt. Invertasen (β-Fructofuranosidasen, Abspaltung der Fructose) spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden auf vielf{\"a}ltige Art und Weise reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Ver{\"a}nderungen in der Aktivit{\"a}t durch verschiedene Einfl{\"u}sse in vitro untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Temperaturoptima der Invertasen erstaunlich hoch liegen. Das Verhalten der getesteten alkalischen / neutralen Invertase aus Lolium temulentum unterschied sich bei vielen Tests von dem der anderen eingesetzten Invertasen. Auch in Tieren bzw. im Menschen sind saccharosespaltende Enzyme, hier bezeichnet als Sucrasen bzw. α-Glucosidasen (Abspaltung der Glucose), an vielen wichtigen Vorg{\"a}ngen beteiligt, etwa der Glykosilierung von Proteinen oder der Verdauung. Die humane Sucrase-Isomaltase aus dem D{\"u}nndarm ist ein Target in der Diabetestherapie. Erstmals konnte die humane Sucrase als aktive Untereinheit in der Hefe Pichia pastoris exprimiert werden. Neben den Enzymen selbst wurden das Wirkspektrum und die Wirkst{\"a}rke verschiedener Inhibitoren untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass Acarbose, ein Pseudotetrasaccharid, das in der Diabetestherapie verwendet wird, auch pflanzliche Invertasen hemmt. Die in ihrer Struktur zueinander sehr {\"a}hnlichen Iminozucker DMDP, Miglitol und Calystegin B2 unterschieden sich erheblich in ihrer Hemmaktivit{\"a}t. DMDP ist dabei am potentesten, Miglitol f{\"u}hrt teilweise zu einer erh{\"o}hten Invertaseaktivit{\"a}t und Calystegin B2 verf{\"u}gt nur {\"u}ber ein beschr{\"a}nktes Hemmspektrum. Pflanzliche proteinogene Invertaseinhibitoren hemmten auch die humane Sucrase und die Hefeinvertase; wurden die Inhibitorproteine in P. pastoris exprimiert und dabei glykosiliert, hatten sie keine Hemmaktivit{\"a}t. Als einziger Inhibitor zeigte Miglitol der getesteten alkalischen / neutralen Invertase gegen{\"u}ber ein Verhalten, das als selektiv bezeichnet werden kann, da die Hemmung mit Konzentrationen, die um den Faktor 1000 niedriger waren als bei anderen Invertasen, eintrat. F{\"u}r die Suche nach neuen Inhibitoren wurden ein Screening und eine Literaturrecherche zum Thema Pflanzen in der Diabetestherapie bzw. pflanzliche Glucosidasehemmstoffe durchgef{\"u}hrt. Die Literaturrecherche weist darauf hin, dass eine große Anzahl an Pflanzen potentielle Wirkstoffe beinhalten k{\"o}nnte. Das Screening nach neuen Hemmstoffen wurde gr{\"o}ßtenteils mit Pflanzenextrakten aus der Traditionellen Chinesischen Medizin durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden hemmende Extrakte entdeckt, die weiter auf ihre aktiven Komponenten hin untersucht werden sollten.}, subject = {Invertase}, language = {de} } @phdthesis{Karg2006, author = {Karg, Kathrin}, title = {Analyse biologisch aktiver, oxidierter Lipide in Pflanzen und Menschen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20424}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Durch freie, radikalkatalysierte Oxidation von Linolens{\"a}ure k{\"o}nnen in vitro und in vivo meh-rere Klassen von Phytoprostanen gebildet werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wur-den Phytoprostane in Pflanzenmaterial (Bl{\"a}ttern, Bl{\"u}tenpollen), Speise{\"o}len sowie in mensch-lichen K{\"o}rperfl{\"u}ssigkeiten (Blut und Urinproben) untersucht. Zus{\"a}tzlich wurden neue Metho-den entwickelt, um Phytohormone sowie verschiedene Metabolite des pflanzlichen Prim{\"a}r- und Sekund{\"a}rstoffwechsels zusammen mit einer gemeinsamen Aufarbeitung erfassen und bestimmen zu k{\"o}nnen. Bl{\"u}tenpollen enthalten mehrere mmol/g an Phytoprostanen, darunter PPA1/PPB1, PPE1 und PPF1. Physiologisch relevant sind jedoch nur die Mengen, die sich nach Extraktion in einem w{\"a}ssrigen Puffer wiederfinden lassen. Deshalb wurden hier erstmals w{\"a}ssrige Extrakte von Birkenpollen untersucht. In diesen befanden sich durchschnittlich 60 nmol PPE1 und 10 nmol PPF1 pro g extrahiertem Pollen. Pflanzen{\"o}le enthalten a-Linolens{\"a}ure bis zu einem Gewichtsanteil von 56 \% (m/m). In Spei-se{\"o}len aus ausgesuchten Pflanzenarten (Lein{\"o}l, Soja{\"o}l, Oliven{\"o}l), Walnuss{\"o}l, Traubenkern{\"o}l) und parenteraler Nahrung (Intralipid) wurden die Phytoprostanklassen A1, B1, D1, E1, F1 und deoxy-J1 nachgewiesen und quantifiziert. In frischen {\"O}len wurden große Mengen an Phy-toprostanen (0,4 - 101 mg/g {\"O}l) gefunden, welche teilweise frei und teilweise verestert vorla-gen. Der absolute Phytoprostangehalt der {\"O}le nahm in folgender Reihe ab: Lein{\"o}l » Soja{\"o}l > Oliven{\"o}l > Walnuss{\"o}l > Raps{\"o}l >> Traubenkern{\"o}l. (a-Tocopherol). In allen untersuchten {\"O}-len dominierten entweder PPE1 oder PPF1 als h{\"a}ufigste Phytoprostanklasse. PPA1 und PPB1 waren lediglich als untergeordnete Bestandteile enthalten. PPD1 und dPPJ1 konnten nur in sehr geringen Mengen gefunden werden. Wenn ein {\"O}l bei l{\"a}ngerer Lagerung autoxidiert, k{\"o}nnen die Gehalte an oxidierten Fetts{\"a}uren um ein Vielfaches ansteigen. Es konnte gezeigt werden, dass bei der Autoxidation von Spei-se{\"o}len weitere Phytoprostane entstehen und die Konzentrationen von PPE1 und PPF1 im {\"O}l bis auf das 10-fache ansteigen k{\"o}nnen. Weiterhin wurde dabei die Bildung von detektierbaren Mengen dPPJ1 nachgewiesen. Die Kinetik der Phytoprostanbildung folgte dem f{\"u}r andere Autoxidationsprodukte typischem zeitlichen Verlauf und erst nach {\"U}berschreiten einer Induk-tionsperiode traten vermehrt Phytoprostane auf. Im menschlichen Verdauungstrakt sind Phytoprostane chemisch stabil. Allerdings k{\"o}nnen im sauren Milieu des Magens (pH 0-2) Dehydratisierungen auftreten: Nach Inkubation von PPE1 in 0,1 M HCl waren nach 3 h noch 97 \% intakt, wohingegen 3 \% nichtenzymatisch zu PPA1 konvertiert waren. Unter den gleichen Bedingungen wurden 19 \% der inkubierten PGD1 zu dPGJ1 dehydratisiert. In den Pflanzen{\"o}len veresterte PPF1 wurden mit Schweinepankreas-Lipase innerhalb 1 h zu 44 bis 100 \% hydrolysiert. Raffinierte Speise{\"o}le, welche fast ausschließlich aus Triacylglyce-riden zusammengesetzt sind, wurden die veresterten PPF1 sogar zu fast 100 \% hydrolysiert. Weiterhin konnte erstmals gezeigt werden, dass Phytoprostane nach oraler Aufnahme resor-biert werden k{\"o}nnen und anschließend mit dem Urin ausgeschieden werden. Nach Verzehr von Pflanzen{\"o}len (Soja{\"o}l, Oliven{\"o}l, Traubenkern{\"o}l) wurden die Spiegel von PPF1 in Blut und Urin bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutliche Korrelation zwischen dem Phytoprostangehalt der {\"O}le und dem Gehalt in den Blut- und Urinproben: Nach Konsum von Oliven- oder Soja{\"o}l konnten innerhalb von 24 h PPF1 in Blut und Urin wiedergefunden werden, wohingegen der Konsum von Traubenkern{\"o}l in den untersuchten Zeitr{\"a}umen weder im Blut noch im Urin zu detektierbaren PPF1-Mengen f{\"u}hrte. Im Blut lag PPF1 verestert vor: Im Serum von Oliven{\"o}l-Konsumenten konnten durchschnittlich 1,22 nmol/l PPF1 gefunden werden. Das Serum eines Soja{\"o}l-Konsumenten enthielt 0,97 nmol PPF1/l. Die Ausscheidung von unmetabolisierten PPF1 mit dem Urin erfolgte fast vollst{\"a}ndig innerhalb der ersten 8 h nach dem Konsum der {\"O}le, 8 bis 24 h danach konnten im Urin nur noch sehr geringe Mengen PPF1 detektiert wer-den. In den Urinproben der Konsumenten von Oliven{\"o}l oder Soja{\"o}l konnten nach 0-4 h durch-schnittlich 2,02 bzw. 0,43 pmol PPF1/mg Kreatinin und nach 4-8 h 1,39 bzw. 0,68 pmol PPF1/mg Kreatinin gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, welche die simultane Bestimmung von Phytohormonen, Oxylipinen und Fetts{\"a}uren erm{\"o}glicht. Weiterhin wurden Methoden zur Metabolit-Analytik entwickelt, mit welchen Konzentrationsunterschiede zwischen zwei Pro-ben direkt verglichen werden k{\"o}nnen. Zur Markierung von der Carboxylgruppe von Oxylipinen, Phytohormonen und Aminos{\"a}uren mit 18O-Sauerstoff wurden allgemein anwendbare Methoden entwickelt. Die [18O]2-markierten Verbindungen erwiesen sich als stabil und eigneten sich als interner Standard in der GC-MS und HPLC-MS Analytik.}, subject = {Prostaglandine}, language = {de} } @phdthesis{Thoma2003, author = {Thoma, Ingeborg}, title = {Cyclopentenon-Phytoprostane als Induktoren von pflanzlichen Abwehrreaktionen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6857}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Lipidperoxidation kann entweder durch Lipoxygenasen oder reaktive Sauerstoffspezies ausgel{\"o}st werden. Enzymatische Oxidation von alpha-Linolens{\"a}ure kann zur Biosynthese von zyklischen Oxylipinen vom Typ der Jasmonate f{\"u}hren, wohingegen durch freie Radikal-katalysierte Oxidation von alpha-Linolens{\"a}ure mehrerere Klassen zyklischer Oxylipine, den Phytoprostanen entstehen k{\"o}nnen. Eine dieser Phytoprostanklassen, Phytoprostane E1 (PPE1), kommen ubiquit{\"a}r in Pflanzen vor. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass PPE1 in planta in neuartige Cyclopentenon-Phytoprostane, die PPA1 und PPB1 umgewandelt werden. Eine gesteigerte Bildung von PPE1, PPA1 und PPB1 wurde sowohl nach Peroxid-Behandlung von Tabak-Zellkulturen als auch nach Behandlung von Tomatenpflanzen mit dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea beobachtet. Dar{\"u}berhinaus besitzen PPA1 und PPB1 biologische Wirkung. Sie stimulierten beispielsweise die Bildung von Phytoalexinen in mehreren Zellkulturen. Diese Daten implizieren, dass die Bildung von Phytoprostanen eine Folge von oxidativem Stress in Pflanzen ist und dass Phytoprostane pflanzliche Abwehrmechanismen induzieren k{\"o}nnen.}, subject = {Pflanzen}, language = {de} } @phdthesis{Imbusch2001, author = {Imbusch, Ruth}, title = {Phytoprostane F1}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-1182238}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Isoprostane F2 sind Autoxidationsprodukte der Arachidons{\"a}ure, die {\"u}ber radikal-katalysierte Oxidation entstehen. Bei einigen Erkrankungen im Tier konnte gezeigt werden, daß die Konzentration von Isoprostanen F2 mit dem verst{\"a}rkten Vorkommen von freien Radikalen korreliert, weshalb Isoprostane heute als Marker des oxidativen Streß genutzt werden. Dar{\"u}ber hinaus weisen einige Isoprostane eine biologische Aktivit{\"a}t auf, weshalb sie heute als Signalstoffe des oxidativen Streß im Tier diskutiert werden. Pflanzen hingegen k{\"o}nnen keine Isoprostane F2 synthetisieren, da ihnen der Precursor Arachidons{\"a}ure fehlt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, daß analog zu den Isoprostanen F2 Phytoprostane F1 in Pflanzen aus Linolens{\"a}ure gebildet werden. Hierf{\"u}r wurden HPLC- und Gaschromatographie-Massenspektroskopie-Methoden entwickelt, die eine Quantifizierung von Phytoprostanen F1 in Pflanzen erm{\"o}glichten. In frischen Pflanzenorganen wurden Phytoprostane F1 sowohl in freier als auch in veresterter Form detektiert. Dar{\"u}ber hinaus stieg die Konzentration sowohl freier als auch veresterter Phytoprostane F1 in Pfefferminzbl{\"a}ttern nach Verwundung und in pflanzlichen Zellkulturen nach Zusatz von Agentien, von denen bekannt ist, daß sie pflanzliche Zellen oxidativ sch{\"a}digen, an. In getrockneten Pflanzenmaterialien wurden extrem hohe Konzentrationen an Phytoprostanen F1 quantifiziert. Daher steht die Vermutung nahe, daß Phytoprostane F1 {\"a}hnlich wie die Isoprostane F2 im Tier als sensitiver Marker der oxidativen Zellverletzung in der Pflanze eingesetzt werden k{\"o}nnen. Dar{\"u}ber hinaus konnte gezeigt werden, daß der Zusatz von Phytoprostanen F1 zu Eschscholzia californica-, Crotalaria cobalticola- and Thalictrum tuberosum-Zellsuspensionskulturen zu einer Phytoalexinakkumulation f{\"u}hrte.}, subject = {Pflanzen}, language = {de} } @phdthesis{Eckert2000, author = {Eckert, Martin}, title = {Zur Regulation und Expression von Aquaporinen unter Ber{\"u}cksichtigung des pflanzlichen Wasserhaushaltes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-1114}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2000}, abstract = {Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde f{\"u}r den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und f{\"u}r Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorg{\"a}ngen w{\"a}hrend der Stoma{\"o}ffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Ver{\"a}nderungen des zeitlichen Verlaufs der Stoma{\"o}ffnung. Die Wasserpermeabilit{\"a}ten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgew{\"a}hlte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomat{\"a}ren Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierf{\"u}r wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisins{\"a}ure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomat{\"a}ren Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivit{\"a}ten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitb{\"u}ndel, in jungen Kotyledonen und in Staubbl{\"a}ttern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivit{\"a}t und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab {\"U}bereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-{\"a}hnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzellul{\"a}re Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-{\"a}hnlichen Strukturen beobachtet.}, subject = {Pflanzen}, language = {de} }