@phdthesis{Merdanovic2005,
  author    = {Merdanovic, Melisa},
  title     = {Charakterisierung von NadR : das essentielle Enzym der NAD-Synthese bei Haemophilus influenzae},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-14907},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {I Zusammenfassung Haemophilus influenzae, ein Gram-negatives, Bakterium der Familie Pasteurellaceae, kann beim Menschen eine Vielzahl an Erkrankungen ausl{\"o}sen: Die bekapselte St{\"a}mme, v. a. mit Typ b Kapsel k{\"o}nnen Cellulitis, septische Arthritis, Epiglottitis und Meningitis verursachen. Die nicht-bekapselte St{\"a}mme k{\"o}nnen Otitis media, Sinusitis, Pneumonie und in selteneren F{\"a}llen Bakter{\"a}mie verursachen. Ein besonderes Merkmal des Metabolismus von H. influenzae ist dessen Unf{\"a}higkeit Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) de novo zu synthetisieren. Daher sind die Enzyme bzw. Transporter, die an NAD+ Aufnahme und Resynthese beteiligt sind, als putative antimikrobielle Ziele von Interesse. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass NAD+ zu Nikotinamidribosyl degradiert werden muss, bevor es in die Zelle aufgenommen werden kann. Auch Proteine, die an der Degradation des exogenen NAD+ zu Nikotinamidribosyl und dessen anschließender Aufnahme in die Zelle verantwortlich sind, konnten identifiziert und charakterisiert werden. Wie Nikotinamidribosyl im Cytoplasma wiederum zu NAD+ synthetisiert wird, ist auch erst k{\"u}rzlich gekl{\"a}rt worden: f{\"u}r NadR konnte sowohl eine Ribosyl-Nukleotid-Kinase (RNK) Aktivit{\"a}t als auch eine Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT) Aktivit{\"a}t in vitro gezeigt werden. Die Kristallstruktur von hiNadR im Komplex mit NAD+ wurde auch aufgekl{\"a}rt. In dieser Arbeit sollte NadR, insbesondere dessen RNK Dom{\"a}ne, in vivo und in vitro n{\"a}her charakterisiert werden. Um zu untersuchen, ob beide Dom{\"a}nen in vivo essentiell sind, wurden Deletionsmutanten erzeugt, bei welchen die komplette bzw. der C-terminale Teil der RNK Dom{\"a}ne fehlten. Diese Deletionen konnten im nadV+ Hintergrund erzeugt werden. Die Deletionen konnten in H. influenzae nur zusammen mit dem nadV-Gen transferiert werden oder alternativ nur in die Zellen, die mit pNadRKan Plasmid transformiert wurden. Dies verdeutlicht, dass nicht nur die NMNAT Dom{\"a}ne sondern auch die RNK Dom{\"a}ne bzw. sogar nur wenige C-terminal fehlende Aminos{\"a}uren des NadR Proteins essentiell f{\"u}r die Lebensf{\"a}higkeit von H. influenzae sind. Gleichzeitig zeigen diese Experimente, dass die RNK-Dom{\"a}ne in Anwesenheit von NadV redundant ist. Ein weiterer Ph{\"a}notyp der RNK-Deletionsmutante zeigte sich beim Nikotinamidribosyl-Transport. Im Gegensatz zum Wt, welcher ca. 60-80\% des 14C-Nikotinamidribosyls aufnahm, konnte f{\"u}r die RNK-Deletionsmutante nur 2-5\% Aufnahme gemessen werden. Dies konnte durch das pNadRKan Plasmid komplementiert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass spontan Aminopyridin-resistente H. influenzae Zellen Mutationen im nadR Gen haben, insbesondere im Walker A-Motif (P-Loop) der RNK Dom{\"a}ne. Zus{\"a}tzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NadR aus Aminopyridin und ATP Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid synthetisieren kann. Somit konnte gezeigt werden, dass die wachstumshemmende Wirkung eigentlich durch das aus Aminopyridin synthetisierte Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid entsteht, welches NAD+ in Redox-Reaktionen verdr{\"a}ngt, wodurch es letztendlich zum Stillstand des Metabolimus kommt. Durch Einf{\"u}hren von gezielten AS-Substitutionen im Walker A und B Motif und in der LID-Dom{\"a}ne von NadR, konnten einige Aminos{\"a}uren identifiziert werden, welche essentiell f{\"u}r die Aktivit{\"a}t der RNK Dom{\"a}ne sind. Alle Aminos{\"a}uren-Substitutionen f{\"u}hrten zum Verlust der RNK Aktivit{\"a}t, die NMNAT Aktivit{\"a}t jedoch war nicht beeintr{\"a}chtigt. Desweiteren wurden diese NadR Punktmutanten in vivo untersucht. F{\"u}r alle konnte eine signifikante Defizienz in der Nikotinamidribosyl-Aufnahme beobachtet werden, die gemessene Aufnahme lag im Bereich der RNK-Deletionsmutante. Dadurch konnte eine direkte Korrelation zwischen der RNK Aktivit{\"a}t und der Nikotinamidribosyl-Aufnahme gezeigt werden. In weiteren in vitro Experimenten konnte f{\"u}r NadR eine Feedback-Inhibition durch das NAD+ gezeigt werden, wobei NAD+ in erster Linie die RNK Dom{\"a}ne von NadR inhibiert. Eine graduelle Erh{\"o}hung der NAD+ Konzentration f{\"u}hrte in den in vitro Assays zu einer graduellen Abnahme der RNK. Bei der NMNAT Aktivit{\"a}t jedoch zeigte sich keine signifikante Inhibition in Anwesenheit von NAD+. Begleitende in vivo Experimente, zeigten eine 2/3 Reduktion der Nikotinamidribosyl-Aufnahme bei den Zellen, die mit NAD+ inkubiert wurden, d. h. h{\"o}here intrazellul{\"a}re NAD+ Konzentration hatten. F{\"u}r die genauere Analyse der Feedback-Inhibition durch NAD+ wurden weitere Punktmutanen hergestellt. Bei zwei der Punktmutanten wurde eine Beeintr{\"a}chtigung der NadR-Aktivit{\"a}t beobachtet, daher wurden diese Punktmutanten von weiteren Analysen im Bezug auf NAD+-Feedback Inhibition ausgeschlossen. Eine Mutante (NadRW256F) jedoch, zeigte {\"a}hnliche Aktivit{\"a}t wie das Wt-NadR. In Anwesenheit von NAD+ wurde die RNK Aktivit{\"a}t dieser Punktmutante, im Gegensatz zum Wt-Protein, kaum gehemmt. Dadurch konnte W256 als eine der Aminos{\"a}uren identifiziert werden, die an der Vermittlung der NAD+-bedingten Inhibition der RNK-Dom{\"a}ne beteiligt ist.},
  subject      = {Haemophilus influenzae},
  language  = {de}
}