@phdthesis{PaulusverhRehling2023, author = {Paulus [verh. Rehling], Sofia}, title = {CRISPR/Cas9-basierte Etablierung Alkalischer Phosphatase-defizienter odontogener Zelllinien zur Analyse der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie}, doi = {10.25972/OPUS-24349}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-243491}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Die Hypophosphatasie (HPP) ist eine seltene Erberkrankung, welche durch compound-heterozygote oder dominant negative heterozygote Mutationen des ALPL Gens zu einem Funktionsverlust der gewebeunspezifischen Alkalischen Phosphatase (TNAP) f{\"u}hrt. Die daraus resultierenden Mineralisierungsst{\"o}rungen betreffen sowohl den Knochen als auch in milderen Auspr{\"a}gungsformen die Z{\"a}hne und den Zahnhalteapparat. Das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen F{\"a}llen das erste Anzeichen der HPP ist dabei der vorzeitige Verlust der Milchz{\"a}hne ohne physiologische Wurzelresorption. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene TNAP defiziente immortalisierte Zellen des parodontalen Ligaments (PDL) mittels der CRISPR/Cas9 Methode generiert und anschließend f{\"u}nf Zelllinien charakterisiert. Die dabei entstandenen Mutationen variierten von einer moderaten heterozygoten Punktmutation zu einer schwerwiegenden homozygoten Deletion eines einzelnen Nukleotids, welche in einem vorzeitigen Stopcodon resultierte. Analysen der ALPL Expression (qPCR), TNAP Aktivit{\"a}tsmessungen (CSPD Assay) und TNAP F{\"a}rbungen zeigten einen signifikanten R{\"u}ckgang in allen TNAP-defizienten Zelllinien mit einer starken Korrelation zwischen der Restaktivit{\"a}t und dem Ausmaß der Mutation, welche in Einklang mit der komplexen Genotyp-Ph{\"a}notyp Korrelation bei HPP zu bringen ist. Das Potential der osteogenen Differenzierung der hTERT PDL Zellen wurde in der homozygot mutierten Zelllinie komplett unterdr{\"u}ckt. M{\"o}gliche Mechanismen des vorzeitigen Zahnverlustes bei HPP Patienten ist die geminderte Formation und Mineralisation des Wurzelzements und die fehlerhafte Insertion der parodontalen Fasern. Die hier erstmalig etablierten Zellkulturmodelle liefern ein valides spenderunabh{\"a}ngiges in vitro Modell der HPP, welches dazu beitragen kann, die molekularbiologischen Zusammenh{\"a}nge der dentalen Aspekte der Hypophosphatasie zu ergr{\"u}nden und daraus gegebenenfalls neue Therapieans{\"a}tze abzuleiten.}, subject = {Hypophosphatasie}, language = {de} } @phdthesis{Roth2020, author = {Roth, Markus}, title = {Etablierung eines isogenen Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung mono- und biallelischer TP53-Inaktivierungen beim Multiplen Myelom}, doi = {10.25972/OPUS-20893}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-208939}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Trotz der Fortschritte in der Therapie des Multiplen Myeloms und des stetig wachsenden Arsenals effektiver anti-MM-Medikamente muss ein Teil der Patienten mit bestimmten zytogenetischen Ver{\"a}nderungen der Tumorzellen nach wie vor der Hochrisiko-Gruppe zugeordnet werden und hat eine Lebens-erwartung von nur wenigen Jahren. Einer der ung{\"u}nstigsten prognostischen Marker ist die Inaktivierung des Tumorsuppressorgens TP53 durch Mutationen des Gens oder Deletionen des kurzen Arms von Chromosom 17, del(17p). Diese wird h{\"a}ufig mit einer Chemoresistenz der entarteten Plasmazellen in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit gelang es mittels des CRISPR/Cas9-Systems TP53-L{\"a}sionen zu erzeugen und isogene Klone der TP53wt/wt Zelllinie AMO-1 zu generieren. Diese wurden anhand der Sequenzanalysen von beiden TP53-Allelen den Gruppen der biallelisch TP53-inaktivierten, der monoallelisch TP53-inaktivierten und der TP53wt/wt Klone zugeordnet. Das gruppenspezifische Verhalten der Klone aller drei Gruppen hinsichtlich deren Expression von p53, p21 und Mdm2 unterstrich die Validit{\"a}t des etablierten Zelllinienmodells zur Untersuchung der Bedeutung von TP53-L{\"a}sionen beim Multiplen Myelom. Neben einer kompletten Ausschaltung durch biallelische TP53-Inaktivierung zeigten die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch eine Haploinsuffizienz des p53-Systems. Diese {\"a}ußerte sich in einer Abschw{\"a}chung der Nutlin-3A-abh{\"a}ngigen p53-, p21- und Mdm2-Induktion bereits nach Inaktivierung eines TP53-Allels durch Frameshift-Mutation. Korrelierend zu dem Proteinexpressions¬muster konnte eine zunehmende Resistenzentwicklung der Klone je nach Grad der TP53-Inaktivierung (mono- bzw. biallelisch) gegen Nutlin 3A sowie genotoxische Substanzen nachgewiesen werden, w{\"a}hrend die Sensibilit{\"a}t der MM-Zellen gegen Proteasominhibitoren unbeeintr{\"a}chtigt blieb. Einschr{\"a}nkungen hinsichtlich der {\"U}bertragbarkeit der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auf das Multiple Myelom im Allgemeinen bestehen in dem Umstand, dass die beschriebenen Beobachtungen lediglich an einer einzigen MM-Zelllinie gemacht werden konnten. Dies ist durch die geringe Auswahl an TP53wt/wt MM-Zelllinien, die zudem noch oft eine schlechte Transfektabilit{\"a}t und niedrige Zellteilungsrate nach Einzelzellselektion aufweisen, bedingt. Die an der Zelllinie AMO-1 gemachten Beobachtungen stehen in Einklang mit der in klinischen Studien festgestellten Verk{\"u}rzung des progressionsfreien- (PFS) und Gesamt-{\"U}berlebens (OS) bei MM-Patienten mit TP53-Alterationen. Die zunehmende Chemoresistenz der malignen Plasmazellen nach mono- bzw. biallelischer TP53-Inaktivierung kann als Grund f{\"u}r die Akkumulation entsprechender Klone im Rezidiv und in fortgeschrittenen Krankheitsstadien des MM angesehen werden. Mittels m{\"o}glichst umfassender Erfassung des genauen TP53-L{\"a}sions-Status in zuk{\"u}nftigen klinischen Studien zu multiplen Zeitpunkten des Krankheitsverlaufs k{\"o}nnte der Einfluss verschiedener, in der Therapie des MM zum Einsatz kommender Substanzen auf die Selektion bzw. die Unterdr{\"u}ckung besonders virulenter Subklone mit TP53-L{\"a}sionen untersucht werden.}, subject = {Plasmozytom}, language = {de} }