@phdthesis{Stoelzle2003,
  author    = {St{\"o}lzle, Sonja},
  title     = {Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kan{\"a}len in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-6975},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-h{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kan{\"a}len ausgestattet. In Ca2+-haltigen L{\"o}sungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erh{\"o}hung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitf{\"a}higkeit bei einer Pipettenl{\"o}sung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kan{\"a}le waren sensitiv gegen{\"u}ber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 \% und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 \% reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abh{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabh{\"a}ngig und der Stromanstiegs erreichte eine S{\"a}ttigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivit{\"a}t erst bei einer Intensit{\"a}t an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis f{\"u}r die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese best{\"a}tigte sich nach {\"U}berpr{\"u}fung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kan{\"a}le durch Blaulicht mehr m{\"o}glich war, konnte auf eine {\"u}berlappende Funktion beider Photorezeptoren bez{\"u}glich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kan{\"a}len geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abh{\"a}ngige, Calcium-permeable Kan{\"a}le. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabh{\"a}ngige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kan{\"a}le. Eine S{\"a}ttigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kan{\"a}le {\"u}berpr{\"u}ft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Ph{\"a}notypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-F{\"a}rbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeintr{\"a}chtigt war, wurde {\"u}berpr{\"u}ft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kan{\"a}le in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kan{\"a}le festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repr{\"a}sentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kan{\"a}le in der Kanal-Mutante war jedoch m{\"o}glich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kan{\"a}le mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kan{\"a}le in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Str{\"o}me durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abh{\"a}ngigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma {\"a}hnlichen internen L{\"o}sung ergab, dass eine Kanalaktivit{\"a}t durch eine erh{\"o}hte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abh{\"a}ngigen, Calcium-permeablen Kan{\"a}le. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kan{\"a}le {\"u}ber einen Ca2+/Calmodulin-abh{\"a}ngigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren k{\"o}nnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein k{\"o}nnte. Dies best{\"a}tigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repr{\"a}sentiert und dass der Verlust der Kanalaktivit{\"a}t in dnd1 in einer beeintr{\"a}chtigten Signalkette zu suchen ist.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schulz2012,
  author    = {Schulz, Alexander},
  title     = {Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport {\"u}ber die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierf{\"u}r wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkr{\"a}fte des vakuol{\"a}ren Zuckertransportes erm{\"o}glichten. Zus{\"a}tzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgew{\"a}hlten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgef{\"u}hrt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuol{\"a}re glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazit{\"a}ten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgel{\"o}st werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus f{\"u}r beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinit{\"a}t und hohe Transportkapazit{\"a}t f{\"u}r den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkr{\"a}fte der Zuckertransportaktivit{\"a}t herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abh{\"a}ngigen H+-Pumpaktivit{\"a}t auf die pH-Hom{\"o}ostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant f{\"u}r die Zuckertransporter zu fungieren. Dar{\"u}ber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole n{\"a}her charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich f{\"u}r den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter {\"U}berexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgel{\"o}st und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bez{\"u}glich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden.},
  subject      = {Ackerschmalwand},
  language  = {de}
}