@phdthesis{Scherzer2012,
  author    = {Scherzer, S{\"o}nke},
  title     = {Biophysikalische Analyse und Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges aus Arabidopsis thaliana},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76199},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {In dieser Arbeit sollte zun{\"a}chst die Frage gekl{\"a}rt werden, ob es sich bei SLAC1 um den S-typ Anionenkanal handelt, oder ob SLAC1 nur ein essentieller Bestandteil des Anionenkanals ist. Zur funktionellen Charakterisierung des per se inaktiven SLAC1 Proteins, wurde mit der Suche nach SLAC1-aktivierenden Interaktionspartnern begonnen. Zu diesem Zweck bediente man sich der Methode der bimolekularen Fluoreszenz Komplementation (BiFC) im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten. Da bereits die Abh{\"a}ngigkeit der Anionenstr{\"o}me in Schließzellen von De- und Phosphorylierungsereignissen bekannt war, galt Ca2+-abh{\"a}ngigen Kinasen der CPK Familie, ABA-aktivierten Kinasen der SnRK Familie und Phosphatasen des PP2C Typs eine besondere Aufmerksamkeit. Mitglieder dieser Familien wurden bereits mit der Regulation des Stomaschlusses in Verbindung gebracht. Bei diesen Experimenten zeigte sich, dass SnRK2.6 (OST1) und mehrere CPKs deutlich mit SLAC1 physikalisch interagierten. Als Folge dieser Interaktion in Oozyten konnten schließlich nach Koexpression von SLAC1 zusammen mit den interagierenden Kinasen typische S-Typ Anionenstr{\"o}me detektiert werden, wie man sie aus Patch-Clamp Experimenten an isolierten Schließzellprotoplasten kannte. Hierbei bewirkten die Kinasen OST1 und CPK23 die gr{\"o}ßte Anionenkanalaktivierung. Dieses Ergebnis wird durch die BIFC-Experimente gest{\"u}tzt, da OST1 und CPK23 die st{\"a}rkste Interaktion zu SLAC1 zeigten. Die elektrophysiologische Charakterisierung der SLAC1-Str{\"o}me im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten in Kombination mit in vivo Patch-Clamp Untersuchungen wies SLAC1 eindeutig als den lange gesuchten S-Typ Anionenkanal in Arabidopsis Schließzellen aus. Somit ist die direkte S-Typ Anionenkanalaktivierung durch OST1 auf dem Kalzium- unabh{\"a}ngigen und durch CPKs auf dem Ca2+-abh{\"a}ngigen ABA-Signaltransduktionsweg gelungen. Bei der Spezifizierung der einzelnen Kalzium-Abh{\"a}ngigkeiten dieser Kinasen in Oozyten und in in vitro Kinase Assays konnten weiterhin unterschiedliche Affinit{\"a}ten der CPKs zu Kalzium festgestellt werden. So vermittelten die schwach Kalzium-abh{\"a}ngigen CPK6 und CPK23 bereits ohne einen Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentratiom {\"u}ber das Ruheniveau hinaus schon die Anionenkanalaktivierung. Die stark Kalzium-abh{\"a}ngigen CPK3 und CPK21 hingegen, werden erst aktiv wenn die ABA vermittelte Signaltransduktion zu einem Anstieg der Kalziumkonzentration f{\"u}hrt. Da somit die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 ohne dieses Kalziumsignal aktiv sind, ben{\"o}tigen diese einen {\"u}bergeordneten Regulationsmechanismus. In den BIFC-Experimenten konnte eine deutliche Interaktion der Phosphatasen ABI1 und 2 zu den SLAC1 aktivierenden Kinasen beobachtet werden. Dass diese Interaktion zu einem Ausbleiben der Anionenkanalaktivierung f{\"u}hrt, wurde in TEVC-Messungen gezeigt. Mit diesen Erkenntnissen um die ABA-Signaltransduktionskette in Schließzellen konnten in in vitro Kinase Experimenten ihre einzelnen Glieder zusammengesetzt und der ABA-vermittelte Stomaschluss nachvollzogen werden. In dieser Arbeit zeigte sich, dass, das unter Wasserstress-Bedingungen synthetisierte Phytohormon, ABA von Rezeptoren der RCAR/PYR/PYL-Familie percepiert wird. Anschließend bindet die Phosphatase ABI1 an den ABA-RCAR1 Komplex. In ihrer freien Form inhibiert die Phosphatase ABI1 die Kinasen OST1, CPK3, 6, 21 und CPK23 durch Dephosphorylierung. Nach Bindung von ABI1 an RCAR1 sind diese Kinasen von dem inhibierenden ABI1 entlassen. Die Kinasen OST1, CPK6 und CPK23 stellen ihre Aktivit{\"a}t durch Autophosphorylierung wieder her. Die stark Ca2+-abh{\"a}ngigen Kinasen CPK3 und 21 ben{\"o}tigt hierzu noch einen ABA induzierten Ca2+-Anstieg im Zytoplasma. Diese Kinasen phosphorylieren anschließend SLAC1 am N-Terminus. Diese Phosphorylierung bewirkt die Aktivierung von SLAC1 woraufhin Anionen aus der Schließzelle entlassen werden. Das Fehlen dieser negativen Ladungen f{\"u}hrt zur Depolarisation der Membran woraufhin der ausw{\"a}rtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK aktiviert und K+ aus der Schließzelle entl{\"a}sst. Der Verlust an Osmolyten bewirkt einen osmotisch getriebenen Wasserausstrom und das Stoma schließt sich.},
  subject      = {Schließzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lind2016,
  author    = {Lind, Christof Martin},
  title     = {W{\"a}hrend der Evolution von Landpflanzen geriet der Anionenkanal SLAC1 unter die Kontrolle des ABA-Signalwegs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-141669},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2016},
  abstract  = {Die ersten Landpflanzen standen vor der Herausforderung sich mit der wechselnden Verf{\"u}gbarkeit von Wasser an Land arrangieren zu m{\"u}ssen. Daraus ergab sich die Notwendigkeit den Wasserverlust zu minimieren und dennoch ausreichend CO2 f{\"u}r die Photosynthese aufzunehmen (Raven, 2002). Im Laufe der Evolution der Pflanzen entstanden mehrere Anpassungen an diese neuen Gegebenheiten, die schließlich auch zur Entstehung von regulierbaren {\"O}ffnungen, den Stomata, in der Blattepidermis f{\"u}hrte. Zwei Schließzellen umschließen das Stoma und regulieren {\"u}ber die Aufnahme oder Abgabe von osmotisch-aktiven Teilchen ihren Turgordruck und damit die {\"O}ffnungsweite des Stomas. Das Kation Kalium und die Anionen Chlorid und Nitrat repr{\"a}sentieren die Hauptosmotika, die je nach Bedarf durch Transportproteine {\"u}ber die Plasmamembran der Schließzellen geschleust werden. In den Samenpflanzen wie zum Beispiel der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, ist der Signalweg in Schließzellen, der bei Trockenheit zu einem schnellen Schluss des Stomas f{\"u}hrt bereits sehr gut untersucht. Bei Wassermangel synthetisiert die Pflanze das Trockenstresshormon ABA (Abscisins{\"a}ure). Das Hormon wird durch ABA-Rezeptoren erkannt und resultiert schließlich in der Aktivit{\"a}t der Proteinkinase OST1. Daraufhin reguliert diese Kinase zum einen die Transkription ABA-abh{\"a}ngiger Gene, die der Pflanze eine langfristige Adaptation an Trockenheit und Austrocknungstoleranz verleiht. Zum anderen, phosphoryliert OST1 den Anionenkanal SLAC1 und aktiviert ihn so. Die Aktivit{\"a}t des Kanals initiiert schließlich den Stomaschluss durch einen Ausstrom von Anionen aus den Schließzellen, der mit einer Depolarisation der Schließzellmembran einhergeht. Der ABA-Signalweg, der zur transkriptionellen Regulation von Genen und der damit verbunden Trockentoleranz f{\"u}hrt ist ein sehr stark konservierter und evolutiv sehr alter Signalweg, der in allen Geweben von Pflanzen bei Trockenheit beschritten wird. Der schnelle ABA-Signalweg, der die Aktivit{\"a}t der SLAC1 Anionenkan{\"a}le reguliert, ist auf Schließzellen begrenzt. Da sich Schließzellen aber erst sp{\"a}t in der Evolution von Landpflanzen etablierten, erhob sich die Frage, wann in der Evolution geriet SLAC1 unter die Kontrolle das ABA-Signalwegs? Geht diese Regulation von SLAC1 mit der Entstehung von Schließzellen einher oder bestand dieser Regulationsmechanismus bereits in Pflanzen, die keine Schließzellen besitzen. Zur Beantwortung dieser Frage untersuchte ich die einzelnen Komponenten des Signalwegs und ihre Beziehungen zu einander im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten. Im Laufe dieser Arbeit wurden Schl{\"u}sselelemente des ABA-Signalwegs aus sechs verschiedenen Versuchspflanzen kloniert und in Oozyten charakterisiert. F{\"u}r die Untersuchung der Evolution des schnellen ABA-Signalwegs wurden die sechs Versuchspflanzen aus je einem rezenten Vertreter der Gr{\"u}nalgen (Klebsormidium nitens), der Lebermoose (Marchantia polymorpha), der Laubmoose (Physcomitrella patens), der Lycophyten (Selaginella moellendorffii) und der Farne (Ceratopteris richardii) ausgew{\"a}hlt und mit der Samenpflanze Arabidopsis thaliana verglichen. Die sechs Pflanzengruppen spalteten sich an unterschiedlichen Zeitpunkten im Laufe der pflanzlichen Evolution von der Entwicklung der restlichen Pflanzen ab und erlauben so einen bestm{\"o}glichen Einblick in den jeweiligen Entwicklungsstand der Landpflanzen w{\"a}hrend der Entstehung der einzelnen Pflanzenfamilien. Obwohl sich die ersten Stomata erst in den Laubmoosen entwickelten, besitzen schon die Gr{\"u}nalgen OST1-Kinasen und SLAC1-Kan{\"a}le. Interessanterweise konnte wir zeigen, dass schon die fr{\"u}hen OST1-Kinasen aus Algen und Moosen dazu in der Lage sind, in den h{\"o}her entwickelten Samenpflanzen die Rolle in der Regulation der ABA-abh{\"a}ngigen Expression von Genen zu {\"u}bernehmen. Außerdem zeigte sich im Laufe meiner biophysikalischen Untersuchungen, dass alle dreizehn getesteten OST1-Kinasen aus den sechs unterschiedlichen Versuchspflanzenarten in Lage sind, den Anionenkanal SLAC1 aus Arabidopsis in Xenopus Oozyten zu aktivieren. Diese Austauschbarkeit von den AtSLAC1-aktivierenden Kinasen deutet auf eine sehr starke Konservierung der Struktur und Funktion von OST1 hin. Anders verhielt es sich bei der funktionellen Analyse der Anionenkan{\"a}le aus den verschiedenen Versuchspflanzen: Hier bildete nur der evolution{\"a}r gesehen j{\"u}ngsten SLAC-Kanal AtSLAC1 aus Arabidopsis ein funktionelles P{\"a}rchen mit OST1. Die SLAC1 Kan{\"a}le aus der Gr{\"u}nalge, dem Lebermoos, den Lycophyten und dem Farn blieben ohne messbare Aktivit{\"a}t bei einer Co-expression mit den verschiedenen OST1 Kinasen. Nur beim Laubmoos (Physcomitrella patens) konnte noch ein funktionelles Kinase-Anionenkanal P{\"a}rchen gefunden werden. Struktur-Funktionsuntersuchungen erlaubten mir schließlich zu zeigen, dass bestimmte funktionelle Dom{\"a}nen sowohl im N-terminus als auch im C-terminus von SLAC1 erforderlich sind, um eine Aktivierung des Kanals durch OST1 Kinasen sicherzustellen.},
  subject      = {Evolution},
  language  = {de}
}