@phdthesis{Pelz2015,
  author    = {Pelz, Jann-Patrick},
  title     = {Strukturbiologische Untersuchungen zur Chaperone-vermittelten Zusammenlagerung spleißosomaler U-snRNPs},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116973},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Durch die Spleißreaktion werden nicht-kodierende Sequenzelemente (Introns) aus eukaryotischen Vorl{\"a}ufer-mRNAs entfernt und die kodierenden Sequenzelemente (Exons) miteinander zu einem offenen Leserahmen verbunden. Dieser zentrale Prozessierungsschritt w{\"a}hrend der eukaryotischen Genexpression wird durch das Spleißosom katalysiert, das aus den vier kleinen nukle{\"a}ren Ribonucleoproteinpartikeln (snRNPs) U1, U2, U4/U6 und U5, sowie einer Vielzahl weiterer Proteinfaktoren gebildet wird. Alle snRNPs besitzen eine gemeinsame ringf{\"o}rmige Kernstruktur, die aus sieben gemeinsamen Sm-Proteinen (SmB/B'-D1-D2-D3-E-F-G) besteht, die ein einzelstr{\"a}ngiges Sequenzmotiv auf der snRNAs binden. W{\"a}hrend sich diese, als Sm-Core-Dom{\"a}ne bezeichnete Struktur in vitro spontan ausbilden kann, erfolgt die Zusammenlagerung in vivo in einem assistierten und hochregulierten Prozess. Dieser ist abh{\"a}ngig von insgesamt mindestens 12 trans-agierenden Faktoren, die in den PRMT5- und SMN-Komplexen organisiert sind. Der PRMT5-Komplex agiert in der fr{\"u}hen Phase der Zusammenlagerung, indem er die Sm-Proteine durch die Untereinheit pICln rekrutiert und die symmetrische Methylierung von Argininresten in den C terminalen Schw{\"a}nzen von SmB/B', SmD1 und SmD3 katalysiert. Als Resultat dieser fr{\"u}hen Phase befinden sich die Sm-Proteine SmD1-D2-E-F-G und SmB/B'-D3 in zwei getrennten und durch pICln organisierten Komplexen. W{\"a}hrend SmB/B'-D3-pICln am PRMT5-Komplex gebunden bleibt, existiert der zweite Komplex als freies Intermediat mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S. Diese Intermediate k{\"o}nnen nicht mit RNA assoziieren, sodass f{\"u}r die Fortsetzung des Zusammenlagerungsprozesses die Interaktion der Sm-Proteine mit pICln aufgel{\"o}st werden muss. Dies geschieht in der sp{\"a}ten Phase der Sm-Core-Zusammenlagerung, in der die Sm-Proteine vom SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) {\"u}bernommen werden und pICln dissoziiert wird. Dadurch werden die Sm-Proteine f{\"u}r ihre Interaktion mit der snRNA aktiviert und k{\"o}nnen auf die Sm-Bindestelle transferiert werden, wodurch die Formierung des Sm-Core abgeschlossen wird. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe einer Kombination r{\"o}ntgenkristallographischer und elektronenmikroskopischer Methoden zwei wichtige Intermediate dieses Zusammenlagerungs-prozesses strukturbiologisch charakterisiert werden. Bei diesen Intermediaten handelt es sich um den 6S-Komplex, sowie um ein Sm-Protein-Transferintermediat mit einem Sedimentations-koeffizienten von 8S. In diesem ist der 6S-Komplex an zwei zentrale Untereinheiten des SMN-Komplexes (SMN und Gemin2) gebunden, w{\"a}hrend pICln den Komplex noch nicht verlassen hat. Der 8S-Komplex stellt daher ein „gefangenes" Intermediat zwischen der fr{\"u}hen und sp{\"a}ten Phase der Zusammenlagerung dar. Zun{\"a}chst gelang es eine erste Kristallform des rekombinant hergestellten 8S-Komplexes zu erhalten, die jedoch keine Strukturl{\"o}sung erlaubte. Durch eine kombinierte Optimierung der Kristallisationsbedingung und der verwendeten Proteine wurde eine weitere {\"a}hnliche Kristallform erhalten, mit der die Kristallstruktur des 8S-Komplexes gel{\"o}st werden konnte. Die Kristallisation des 6S-Komplexes gelang im Anschluss auf Basis der Hypothese, dass Kristalle beider Komplexe aufgrund der kompositionellen Verwandtschaft zwischen 6S und 8S auch {\"A}hnlichkeiten in der Architektur ihrer Kristallgitter aufweisen k{\"o}nnten. Daher wurden innerhalb von pICln gezielt Aminos{\"a}uren substituiert, die sich innerhalb von Kristallkontakten der 8S-Kristalle befanden und konformationell eingeschr{\"a}nkt waren. Mit entsprechend rekonstituierten 6S-Pr{\"a}parationen konnten dann zwei Kristallformen erzeugt werden, die eine Strukturl{\"o}sung des 6S-Komplexes erm{\"o}glichten. Durch die Kristallstruktur des 6S-Komplexes konnte f{\"u}r pICln eine strukturelle Mimikry der Sm-Proteine identifiziert werden. Diese erm{\"o}glicht eine Bindung der Sm-Proteine und eine fr{\"u}hzeitige topologische Organisation des Sm-Pentamers D1-D2-F-E-G in einer geschlossenen hexameren Ringstruktur. Die Kristallstruktur des 8S-Komplexes zeigt, wie der SMN-Komplex {\"u}ber Gemin2 an das Sm-Pentamer bindet. In Kombination mit einer EM-Struktur des 8S-Komplexes gelang es weiterhin, einen plausiblen Mechanismus f{\"u}r die Elimination von pICln und die Aktivierung der Sm-Proteine f{\"u}r die snRNA-Bindung zu formulieren. Somit konnten diese Arbeiten zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Funktionen von trans-agierenden Faktoren bei Zusammenlagerung von RNA-Protein-Komplexen in vivo beitragen.},
  subject      = {Spleißosom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Linder2012,
  author    = {Linder, Bastian},
  title     = {Systemischer Spleißfaktormangel im Zebrafisch Danio rerio - Etablierung und Charakterisierung eines Tiermodells f{\"u}r Retinitis pigmentosa},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69965},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Retinitis pigmentosa (RP) ist eine vererbte Form der Erblindung, die durch eine progressive Degeneration von Photorezeptorzellen in der Retina verursacht wird. Neben „klassischen" RP-Krankheitsgenen, die direkt oder indirekt mit dem Sehprozess und der Aufrechterhaltung der Photorezeptoren in Verbindung stehen, k{\"o}nnen auch Mutationen in Genen f{\"u}r konstitutive Spleißfaktoren zur Photorezeptordegeneration f{\"u}hren. RP kann daher als Paradebeispiel einer Erkrankung mit paradoxer Gewebespezifit{\"a}t angesehen werden: Defekte in essentiellen und ubiquit{\"a}r exprimierten Genen f{\"u}hren zu einem Ph{\"a}notyp, der nur wenige Zelltypen betrifft. Um Einblicke in diesen außergew{\"o}hnlichen Pathomechanismus zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Tiermodell f{\"u}r Spleißfaktor-vermittelte RP im Zebrafisch Danio rerio etabliert. Zun{\"a}chst wurde gezeigt, dass eine RP verursachende Punktmutation des Spleißfaktors Prpf31 auch in dessen Zebrafisch-Homolog zu einem Verlust der physiologischen Aktivit{\"a}t f{\"u}hrt. Als Modell f{\"u}r die Prpf31-Mangelsituation diente dann die durch ein Antisense-Morpholino induzierte partielle Reduktion der Prpf31-Expression in Zebrafischlarven. Konsistent mit einem RP-Ph{\"a}notyp zeigte sich in diesen Larven eine starke Beeintr{\"a}chtigung des Sehverm{\"o}gens. Sie wurde - ebenfalls analog zu RP - durch defekte Photorezeptoren verursacht, die bei ansonsten normal entwickelter Retina eine deutlich ver{\"a}nderte Morphologie aufwiesen. Daraufhin konnten in einer genomweiten Transkriptomanalyse der Augen von Prpf31-defizienten Larven erstmals in vivo photorezeptorspezifische Gene identifiziert werden, deren Expression durch den Mangel an Prpf31 beeintr{\"a}chtigt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob es neben den bereits bekannten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren gibt, deren Defekt die Degeneration von Photorezeptoren ausl{\"o}sen kann. Dazu wurde in Zebrafischlarven ein Mangel an Prpf4 erzeugt, einem Spleißfaktor, der bislang nicht mit RP in Verbindung gebracht worden war. Der Ph{\"a}notyp dieser Fische war nicht von dem des Prpf31 RP-Modells zu unterscheiden. Dies lieferte einen Hinweis darauf, dass auch Defekte in Prpf4 in der Lage sein k{\"o}nnten, RP auszul{\"o}sen. Tats{\"a}chlich konnte durch genetisches Screening ein RP-Patient mit einer Punktmutation in Prpf4 identifiziert werden (Kollaboration mit Hanno Bolz, Universit{\"a}t K{\"o}ln). Die biochemische Analyse dieser Mutation zeigte, dass sie zu einem Defekt der Integration von Prpf4 in spleißosomale Untereinheiten und zu dessen Funktionsverlust in vivo f{\"u}hrt. Mit dem in dieser Arbeit etablierten Tiermodell konnte zum ersten Mal in vivo ein von Spleißfaktor-Mutationen verursachter Pathomechanismus von Retinitis pigmentosa nachvollzogen werden. Die vom Prpf31-Mangel betroffenen Photorezeptortranskripte stellen vielversprechende Kandidaten f{\"u}r die Vermittlung der Gewebespezifit{\"a}t dar und unterst{\"u}tzen die Hypothese, dass ihre ineffiziente Prozessierung den RP-Ph{\"a}notyp ausl{\"o}st. Die Entdeckung eines weiteren Spleißfaktors, dessen Defizienz ebenfalls zu defekten Photorezeptoren f{\"u}hrt, zeigt, dass offenbar der Funktionsverlust des Spleißosoms generell in der Lage ist, die Degeneration dieser Zellen zu verursachen. Dies ist nicht zuletzt auch von klinischer Relevanz, da vermutet werden kann, dass sich unter den vielen bisher nicht identifizierten RP-Krankheitsgenen weitere Spleißfaktoren befinden.},
  subject      = {RNS-Spleißen},
  language  = {de}
}