@phdthesis{Baetz2012,
  author    = {B{\"a}tz, Julia},
  title     = {FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven {\"A}nderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Ph{\"a}nomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) k{\"o}nnen in f{\"u}nf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen f{\"u}nf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerw{\"u}nschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, k{\"o}nnen so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. F{\"u}r ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden f{\"u}r den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gew{\"a}hlt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angef{\"u}gt. Die zur Markierung mit FlAsH n{\"o}tige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellul{\"a}ren Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bez{\"u}glich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zun{\"a}chst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkst{\"a}rke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabh{\"a}ngig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabh{\"a}ngig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformations{\"a}nderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen f{\"u}r 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare {\"A}nderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob f{\"u}r die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkst{\"a}rke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine {\"a}ußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformations{\"a}nderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant st{\"a}rker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine st{\"a}rkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine st{\"a}rkere Bewegung unterhalb von Transmembrandom{\"a}ne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse f{\"u}r EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine gr{\"o}ßere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einfl{\"u}sse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen m{\"o}glich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformations{\"a}nderung des M2 AChR untersucht. W{\"a}hrend eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-{\"A}nderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzukl{\"a}ren, wurden verschiedene Ans{\"a}tze gew{\"a}hlt: Mit kettenverl{\"a}ngerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine {\"A}nderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins f{\"u}hrte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signal{\"a}nderung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen f{\"u}hrten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu erm{\"o}glichen. Ein anderer Erkl{\"a}rungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformations{\"a}nderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR m{\"o}glich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Dar{\"u}ber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivit{\"a}t mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformations{\"a}nderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias f{\"u}r diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bez{\"u}glich ihrer F{\"a}higkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verl{\"a}ngerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformations{\"a}nderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den urspr{\"u}nglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle m{\"o}glich ist, urs{\"a}chlich f{\"u}r die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.},
  subject      = {Muscarinrezeptor},
  language  = {de}
}