@phdthesis{Effenberger2012,
  author    = {Effenberger, Madlen},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung von YB-1 im Zytoplasma des Multiplen Myeloms},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76816},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Das Y-Box-bindende Protein 1 (YB-1) ist ein Vertreter der hochkonservierten Familie eukaryotischer K{\"a}lteschockproteine und ein DNA/RNA-bindendes Protein. In Abh{\"a}ngigkeit von seiner Lokalisation {\"u}bernimmt es Aufgaben bei der DNA-Transkription oder mRNA-Translation. YB-1 ist ein potentielles Onkogen beim Multiplen Myelom (MM), dass in prim{\"a}ren MM-Zellen exprimiert ist. F{\"u}r die funktionellen Untersuchungen von YB-1 in der vorliegenden Arbeit wurden humane Myelomzelllinien (HMZL) verwendet, die als in vitro Modell dieser malignen B Zell-Erkrankung dienen. Aufgrund der potentiellen Expression von YB-1 im Zellkern und/oder Zytoplasma von HMZL, wurde zun{\"a}chst die Lokalisation des Proteins bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass YB 1 in den HMZL ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert ist. Eine Translokation von YB-1 in den Nukleus kann durch die Serin-Phosphorylierung (Aminos{\"a}ure 102) in der K{\"a}lteschockdom{\"a}ne induziert werden. Die analysierten Myelomzelllinien zeigen jedoch kein nukle{\"a}res YB 1 und keine S102-Phosphorylierung. Diese Ergebnisse st{\"u}tzen die These, dass die Regulation der mRNA-Translation im Zytoplasma die vorherrschende Funktion von YB-1 beim MM ist. YB-1 k{\"o}nnte {\"u}ber diesen Mechanismus seine anti-apoptotische Wirkung vermitteln und die MM-Zellen vor genotoxischem Stress sch{\"u}tzen. Um YB-1-regulierte mRNAs zu identifizieren wurden YB 1-Immunpr{\"a}zipitationen mit zwei HMZL, einer Maus-Plasmozytomzelllinie und einem prim{\"a}ren Maus-Plasmazelltumor durchgef{\"u}hrt. Zu den YB-1-gebundenen mRNAs geh{\"o}ren Translationsfaktoren und ribosomale Proteine, die eine starke Beteiligung von YB-1 beim RNA-Metabolismus best{\"a}tigen. In der vorliegenden Arbeit wurden spezifisch zwei mRNA-Kandidaten untersucht, die f{\"u}r den malignen Ph{\"a}notyp von MM-Zellen wichtig sein k{\"o}nnen: das translationell kontrollierte Tumorprotein TCTP und MYC. Sowohl TCTP als auch MYC wurden bereits in Zusammenhang mit der Proliferation und Apoptose-Resistenz von malignen Zellen beschrieben. Die immunhistochemische Untersuchung der Knochenmarkbiopsien von MM-Patienten ergab eine gute Ko-Expression von YB-1 und TCTP in intramedull{\"a}ren MM-Zellen, w{\"a}hrend MYC erst in extramedull{\"a}rem MM-Tumormaterial verst{\"a}rkt mit der hohen YB 1-Expression korreliert. Die funktionellen Analysen der Arbeit haben gezeigt, dass YB 1 f{\"u}r die Translation der TCTP- und MYC-mRNA essentiell ist. Es kontrolliert die Verteilung dieser mRNAs zwischen translationell aktiven und inaktiven messenger Ribonukleoprotein-Partikeln. Die shRNA-vermittelte Reduktion von YB-1 f{\"u}hrte zur Hemmung der TCTP- und MYC-Translation in der Phase der Initiation. Um den Einfluss der Kandidaten auf das {\"U}berleben der HMZL zu untersuchen, wurden proteinspezifische Knockdown-Experimente durchgef{\"u}hrt. Beim shRNA-vermittelten TCTP-Knockdown konnten keine Auswirkungen auf die Proliferation oder Viabilit{\"a}t von MM-Zellen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu ist MYC f{\"u}r das {\"U}berleben und Wachstum der HMZL ausschlaggebend, denn der MYC-Knockdown induzierte Apoptose. Wie beim YB 1-Knockdown war ein Anstieg der Caspase-Aktivit{\"a}t und der Zusammenbruch des mitochondrialen Membranpotentials in den HMZL nachweisbar. Da es beim MYC-Knockdown gleichzeitig zur einer Reduktion der YB 1-Protein- und mRNA-Expression kam, wurde der Einfluss von MYC auf die Transkription des YB-1-Gens untersucht. Mit Hilfe von embryonalen Mausfibroblasten, die ein induzierbares MYC als Transgen besitzen, konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von MYC mit einer Zunahme der YB-1-mRNA einher geht. YB-1 ist somit ein direktes Zielgen des Transkriptionsfaktors MYC. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben zum ersten Mal ein gegenseitiges regulatorisches Netzwerk aufgezeigt, in dem YB 1 transkriptionell durch MYC reguliert wird und YB-1 f{\"u}r die Translation der MYC-mRNA essentiell ist. Die Ko-Expression beider Proteine tr{\"a}gt zum Wachstum und {\"U}berleben von malignen Plasmazellen bei.},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@article{FischerMaierSiegemundetal.2011,
  author    = {Fischer, Roman and Maier, Olaf and Siegemund, Martin and Wajant, Harald and Scheurich, Peter and Pfizenmaier, Klaus},
  title     = {A TNF Receptor 2 Selective Agonist Rescues Human Neurons from Oxidative Stress-Induced Cell Death},
  series = {PLoS ONE},
  volume    = {6},
  journal   = {PLoS ONE},
  number    = {11},
  doi       = {10.1371/journal.pone.0027621},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-133552},
  pages     = {e27621},
  year      = {2011},
  abstract  = {Tumor necrosis factor (TNF) plays a dual role in neurodegenerative diseases. Whereas TNF receptor (TNFR) 1 is predominantly associated with neurodegeneration, TNFR2 is involved in tissue regeneration and neuroprotection. Accordingly, the availability of TNFR2-selective agonists could allow the development of new therapeutic treatments of neurodegenerative diseases. We constructed a soluble, human TNFR2 agonist (TNC-scTNF(R2)) by genetic fusion of the trimerization domain of tenascin C to a TNFR2-selective single-chain TNF molecule, which is comprised of three TNF domains connected by short peptide linkers. TNC-scTNFR2 specifically activated TNFR2 and possessed membrane-TNF mimetic activity, resulting in TNFR2 signaling complex formation and activation of downstream signaling pathways. Protection from neurodegeneration was assessed using the human dopaminergic neuronal cell line LUHMES. First we show that TNC-scTNF(R2) interfered with cell death pathways subsequent to H(2)O(2) exposure. Protection from cell death was dependent on TNFR2 activation of the PI3K-PKB/Akt pathway, evident from restoration of H(2)O(2) sensitivity in the presence of PI3K inhibitor LY294002. Second, in an in vitro model of Parkinson disease, TNC-scTNFR(2) rescues neurons after induction of cell death by 6-OHDA. Since TNFR2 is not only promoting anti-apoptotic responses but also plays an important role in tissue regeneration, activation of TNFR2 signaling by TNC-scTNF(R2) appears a promising strategy to ameliorate neurodegenerative processes.},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Klingler2014,
  author    = {Klingler, Barbara},
  title     = {Mechanismen der Todesrezeptorinduzierten JNK-Aktivierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113940},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Fas (Apo-1/CD95) ist ein Mitglied der TNF (Tumor Necrosis Factor)-Familie, dass {\"u}ber die rezeptoreigene Todesdom{\"a}ne Caspase 8-vermittelt Apoptose induzieren kann. Dies geschieht entweder auf direktem Wege durch Aktivierung von Caspase 3 oder durch die zus{\"a}tzliche, f{\"u}r den Untergang der Zellen essentiellen Stimulation des intrinsischen mitochondrialen Signalwegs. Abh{\"a}ngig von der jeweiligen Art der Apoptoseinduktion werden Zellen somit in Typ I oder Typ II unterteilt. Durch das Vorhandensein von antiapoptotischen Proteinen wie unter anderem Bcl-xL kann in Letzterem negativ regulierend auf den Signalweg eingegriffen werden (siehe Abb. 3). W{\"a}hrend der Aktivierung des Fas-Signalweges kommt es zur Phosphorylierung der MAP-Kinasen JNK, p38-MAPK und ERK; dies alleine ist jedoch nicht ausreichend f{\"u}r die Induktion des Zelltodes und findet ebenfalls in apoptoseresistenten Zellen statt. Weiterhin wurde bei der Regulation entz{\"u}ndlicher Prozesse eine Beteiligung von Fas beschrieben18. Bedingt durch die hohe Dichte an Fas und seinem Liganden FasL auf T-Zellen nimmt es durch Apoptoseinduktion auf T-Zellen selbst oder deren Zielzellen indirekt auf verschiedene Formen entz{\"u}ndlicher oder immunregulatorischer Prozesse wie beispielsweise die Transplantatabstoßung Einfluss. Seit vielen Jahren ist zudem bekannt, dass durch die Aktivierung des Fas-Signalweges auch nichtapoptotische Signalwege induziert werden k{\"o}nnen. Beispielhaft hierf{\"u}r steht der NF-B-Signalweg, welcher letztendlich zur Transkription antiapoptotischer Zielgene f{\"u}hrt. Auch hierbei kommt es Caspase 8-vermittelt zur Phosphorylierung von JNK, p38-MAPK und ERK, weiterhin scheint eine Aktivierung dieses Signalweges in Zusammenhang mit einer erh{\"o}hten Produktion von Interleukin 8 zu stehen49. Im Rahmen dieser Arbeit hat sich nun gezeigt, dass die Aktivierung von Fas sowohl durch die Aktivierung von Caspase 8 als auch durch unabh{\"a}ngige Mechanismen zur Aktivierung von JNK f{\"u}hrt. Hierbei wurde durch Stimulation der apoptosesensiblen T-Zelllinie Jurkat mit dem vorvernetzten FasL die Phosphorylierung von JNK bei nativen Zellen ebenso wie mit dem Caspaseinhibitor zVAD vorbehandelnden Zellen nachgewiesen. Des Weiteren konnte in den wenig apoptosesensitiven KB-Zellen sowie in den transfizierten und somit apoptoseresistenten Colo 357 Bcl-xL Zellen ein caspaseabh{\"a}ngiger, jedoch apoptoseunabh{\"a}ngiger Signalweg zur Aktivierung von JNK nachgewiesen werden. Dieses Ph{\"a}nomen scheint vom Zelltyp abh{\"a}ngig zu sein. Die Stimulation der Colo 357 Bcl-xL Zellen f{\"u}hrte nach Vorbehandlung mit CHX, das eine Todesrezeptor-vermittelte, verst{\"a}rkte Caspase 8-Aktivierung bewirkt, zur Aktivierung von JNK, w{\"a}hrend im simultan durchgef{\"u}hrten Zytotoxizit{\"a}tsessay das {\"U}berleben der Zellen best{\"a}tigt werden konnte. Bei Zugabe des Caspaseinhibitors zVAD konnte in den Colo 357 Bcl-xL Zellen kein phosphoryliertes JNK nachgewiesen werden, w{\"a}hrend in den KB-Zellen eine Aktivierung von JNK bei reduzierter Konzentration von zVAD mit jedoch bestehendem Apoptoseschutz, graduell stattfand. Zuletzt wurde der Einfluss der JNK-Aktivierung auf die Interleukin 8 Produktion untersucht. Hierzu wurde die Interleukin 8 Produktion bei Colo 357 Bcl-xL Zellen unter Stimulation mit FasL gemessen und mit der Produktion nach Vorbehandlung mit zVAD verglichen. Hierbei zeigte sich eine unver{\"a}nderte Produktion von Interleukin 8, was einen JNK-unabh{\"a}ngigen Weg postuliert, da JNK, wie im Vorversuch gezeigt, in dieser Zelllinie durch zVAD inhibiert wird. Unter Zugabe des JNK-spezifischen Inhibitors JNKII kommt es jedoch zu einer deutlichen, aber Konzentrations-abh{\"a}ngigen Suppression der Interleukin 8 Produktion, was in direktem Widerspruch zu dem vorab bestehenden Ergebnis steht. M{\"o}glicherweise f{\"u}hrt eine erh{\"o}hte Konzentration von JNKII zu einer Hemmung zus{\"a}tzlicher Signalwege wie beispielsweise der des NF-B-Signalweges, was indirekt zu einer Beeinflussung der Interleukin 8-Produktion f{\"u}hrt. Weiterhin k{\"o}nnte eine obligat gemeinsame Aktivierung des JNK und des NF-B-Signalweges zur Interleukin 8 Produktion notwendig sein.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Mueller2009,
  author    = {M{\"u}ller, Nicole},
  title     = {Entwicklung antigenabh{\"a}ngig aktivierbarer TNF-Ligand-Fusionsproteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-36489},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Von TRAIL, FasL und APRIL, drei Mitgliedern der TNF-Liganden-Familie, ist bekannt, dass Trimerstabilit{\"a}t und Oligomerisierungsstatus maßgeblich das Rezeptoraktivierungspotential dieser Liganden beeinflussen. F{\"u}r die immunstimulatorischen TNF-Liganden CD27L, CD40L, OX40L, 41BBL und GITRL war hingegen vor der Durchf{\"u}hrung dieser Arbeit praktisch nicht bekannt, inwieweit Trimerbildung, Stabilisierung und Oligomerisierung wichtig f{\"u}r deren Aktitvit{\"a}t sind. Dies wurde in dieser Arbeit systematisch untersucht. CD40L besaß bereits als trimeres Molek{\"u}l eine hohe Aktivit{\"a}t, die durch sekund{\"a}re Oligomerisierung nur wenig gesteigert wurde. Die spezifische Aktivit{\"a}t konnte durch Stabilisierung mit Hilfe der Tenascin-C (TNC)-Trimerisierungsdom{\"a}ne nur geringf{\"u}gig gesteigert werden. CD27L war als l{\"o}sliches Flag-markiertes sowie als hexameres Fc-Protein selbst nach Quervernetzen nicht in der Lage, seinen Rezeptor CD27 zu binden und zu aktivieren. Die TNC-stabilisierte trimere Form des CD27L hingegen induzierte nach Oligomerisierung mit einem anti-Flag-Antik{\"o}rper ein starkes Signal. Trimerer OX40L und trimerer 41BBL konnten nur in oligomerisierter Form ihre Rezeptoren aktivieren, wobei die Aktivit{\"a}t der TNC-stabilisierten Form signifikant st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war. GITRL aktivierte seinen Rezeptor bereits als stabilisiertes Trimer und Hexamer, die Aktivit{\"a}t konnte durch Quervernetzen nur gering gesteigert werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass CD27L, OX40L und 41BBL zu der Untergruppe der TNF-Ligandenfamilie geh{\"o}rt, f{\"u}r die eine Stabilisierung des trimeren Molek{\"u}ls und dessen Oligomerisierung n{\"o}tig sind, um eine starke Rezeptoraktivierung zu erm{\"o}glichen. Im Gegensatz dazu zeigten CD40L und GITRL bereits oligomerisierungsunabh{\"a}ngig eine hohe Aktivit{\"a}t. GITRL ben{\"o}tigte allerdings die Stabilisierung des trimeren Molek{\"u}ls durch die TNC-Dom{\"a}ne, um gute Aktivit{\"a}t zu zeigen. Im Weiteren wurden Antik{\"o}rperfragment (scFv-)-TNF-Ligand-Fusionsproteine konstruiert und untersucht, die ein Zelloberfl{\"a}chenantigen binden. Eine starke Zelloberfl{\"a}chenantigen-spezifische Aktivierung des jeweiligen Rezeptors konnte f{\"u}r scFv-41BBL und f{\"u}r scFv-OX40L gezeigt werden, wohingegen scFv-CD40L und scFv-GITRL bereits auf antigennegativen Zellen stark aktiv waren. scFv-CD27L war selbst auf antigenpositiven Zellen inaktiv. Verwendet man an Stelle des Antik{\"o}rperfragments eine extrazellul{\"a}re Proteinbindedom{\"a}ne, z.B. die eines TNF-Rezeptors, erh{\"a}lt man Fusionsproteine, die zum einen eine selektive Aktivierung der TNF-Ligandendom{\"a}ne und somit die Aktivierung des korrespondierenden Rezeptors auf der Zielzelle erm{\"o}glichen, zum anderen aber durch die Bindung an den membranst{\"a}ndigen Liganden dessen Aktitv{\"a}t neutralisieren k{\"o}nnen. F{\"u}r CD40-, RANK- und B7-2-FasL konnte der immobilisationabh{\"a}ngige Aktivierungseffekt auf entsprechenden Zelloberfl{\"a}chenmolek{\"u}l-exprimierenden Zellen gezeigt werden. Anhand von T47D-Zellen, die durch eine autokrine CD40L-CD40-Signalschleife vor Apoptose gesch{\"u}tzt sind, konnte gezeigt werden, dass durch die Bindung von CD40-FasL an membranst{\"a}ndigen CD40L die CD40L-CD40-Interaktion gest{\"o}rt und gleichzeitig Apoptose verst{\"a}rkt induziert werden kann. Das Prinzip der antigenabh{\"a}ngigen Aktivierung von TNF-Liganden k{\"o}nnte Anwendung in der Tumortherapie finden, da bei Verwendung entsprechender selektiv exprimierter Marker eine lokale Rezeptoraktivierung erreicht und so Nebenwirkungen minimiert werden k{\"o}nnen.},
  subject      = {Rekombinantes Protein},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rothhammer2008,
  author    = {Rothhammer, Veit},
  title     = {Wachstumsverhalten und Expansionskapazit{\"a}t humaner mesenchymaler Stammzellen aus Pankreas und Knochenmark},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29149},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Prim{\"a}re Nestin-positive adulte Stamm-/Vorl{\"a}uferzellen aus menschlichen Langerhans'schen Inseln besitzen einen mesenchymalen Charakter und das prinzipielle Potenzial zur in vitro-Differenzierung in Insulin produzierende Ph{\"a}notypen. Allerdings ist die Entwicklung effektiver Differenzierungsstrategien bisher noch nicht gelungen. Dies ist unter anderem durch das limitierte Wachstumsverhalten dieser Prim{\"a}rzellen in Kultur begr{\"u}ndet, das in der vorliegenden Arbeit ausf{\"u}hrlich charakterisiert wurde. So besitzt die Gesamtpopulation aus pankreatischen humanen Langerhansschen Inseln auswachsender Zellen (hIZ) ein begrenztes Wachstumspotenzial von im Mittel 19 Passagen. Diese Tatsache limitiert zum einen die Entwicklung von Protokollen zur Differenzierung dieser Zellen und f{\"u}hrt zum anderen zu einer Limitierung der Vision in vitro vermehrbaren und differenzierbaren Vorl{\"a}uferzellmaterials, das nach Differenzierung transplantiert werden und in vivo die beta-Zellfunktion ersetzen k{\"o}nnte. Vor diesem Hintergrund zeigt die vorliegende Arbeit anhand des Nestin-positiven und mesenchymalen Zellmodells der menschlichen Knochenmarksstammzelllinie hMSC-TERT weiterhin, dass sich eine gentechnisch induzierte transiente und stabile {\"U}berex-pression des wachstums- und proliferationsassoziierten Proteins p8 f{\"o}rdernd auf das Wachstumsverhalten dieser Zelllinie auswirkt. Dieser Effekt beruht, wie an stabil generierten p8-{\"u}berexprimierenden Zelllinien gezeigt werden konnte, zum einen auf der Steigerung der Proliferationsrate. Zum anderen ist das verbesserte Wachstumsverhalten jedoch auch auf eine bis dato unbekannte Verminderung der basalen Apoptoserate von hMSC-TERT zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Das Protein p8 konnte erstmals als molekularer Mediator des Wachstums und {\"U}berlebens mesenchymaler Nestin-positiver und zu beta-Zell{\"a}hnlichen Ph{\"a}notypen differenzierbarer Vorl{\"a}uferzellen charakterisiert werden. Es kann somit einen entscheidenden Beitrag zur L{\"o}sung des Problems begrenzten differenzierbaren Stammzellmaterials auf der Suche nach einer zellbasierten kurativen, breit und risikoarm einsetzbaren Therapiestrategie f{\"u}r den Diabetes mellitus leisten.},
  subject      = {Adulte Stammzelle},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaffstein2010,
  author    = {Schaffstein, Stella},
  title     = {Molekulare Mechanismen der nicht-apoptotischen Signaltransduktion des Todesliganden TRAIL (Apo-2 Ligand)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55943},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn {\"u}ber seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, w{\"a}hrend normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Ausl{\"o}ser der Apoptose zus{\"a}tzlich die F{\"a}higkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierf{\"u}r wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabh{\"a}ngig vom apoptotischen Zelltod aber abh{\"a}ngig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entz{\"u}ndlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegen{\"u}ber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Trebing2014,
  author    = {Trebing, Johannes},
  title     = {CD70-abh{\"a}ngige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111592},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antik{\"o}rpers mit einer Fc-unabh{\"a}ngigen Zelltod-induzierenden Aktivit{\"a}t auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Dom{\"a}ne sowie aus einer TRAIL-Dom{\"a}ne bestehen. Der CD70-spezifische monoklonale Antik{\"o}rper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antik{\"o}rper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist f{\"u}r den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellul{\"a}rer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinit{\"a}t der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion f{\"u}hrt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). F{\"u}r die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Pr{\"a}ferenz f{\"u}r den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Pr{\"a}ferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellul{\"a}ren GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zus{\"a}tzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalit{\"a}tsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) best{\"a}tigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifit{\"a}t der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten l{\"o}slichen TRAIL-Trimeren waren nur die quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 h{\"o}her als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizit{\"a}tsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verst{\"a}rkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte gr{\"o}ßtenteils erst nach Oligomerisierung {\"u}berhaupt eine Bioaktivit{\"a}t bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verst{\"a}rkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizit{\"a}tsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizit{\"a}t der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verst{\"a}rkte (Abb. 15, 17). In {\"U}bereinstimmung mit der verst{\"a}rkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antik{\"o}rpers f{\"u}hrte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivit{\"a}t von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer st{\"a}rkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss. Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivit{\"a}t von l{\"o}slichem TRAIL {\"u}ber ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerw{\"u}nschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Dar{\"u}ber hinaus k{\"o}nnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die prim{\"a}r durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen {\"u}ber Funktionalit{\"a}t, Halbwertszeiten, sowie Effektivit{\"a}t und Vertr{\"a}glichkeit treffen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}