@phdthesis{Eckert2008,
  author    = {Eckert, Roland},
  title     = {Untersuchungen zu Uridinplasmaspiegeln bei HIV-Patienten und Probanden},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28269},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {HINTERGRUND: Langzeitnebenwirkungen der antiretroviralen Therapie werden u.a. auf mitochondriale Toxizit{\"a}t von NRTIs zur{\"u}ckgef{\"u}hrt, wobei es zu einer Dysfunktion der Atmungskette und nachgeschalteter Stoffwechselwege wie der de-novo-Pyrimidinsynthese kommen kann. Experimentell konnte gezeigt werden, dass das Pyrimidinnukleosid Uridin einige dieser Toxizit{\"a}tseffekte reduzieren konnte. METHODIK: Nach Etablierung einer HPLC-Methodik zur Evaluation von Uridin im menschlichen Serum wurden Uridinspiegel von HIV-positiven Patienten mit Uridinspiegeln einer HIV-negativen Kontrollgruppe verglichen sowie mit Demografie, Nebenwirkungen bzw. Koerkrankungen, antiretroviraler Therapie und Therapiedauer korreliert. ERGEBNISSE: Die 182 HIV-Patienten wiesen signifikant niedrigere Uridinspiegel als die 30 Kontrollpersonen auf, blieben aber noch im physiologischen Normbereich gesunder Erwachsener. Demografische Faktoren sowie Marker der HIV-Infektion zeigten keine signifikante Korrelation mit Uridin. HIV-Patienten mit Begleiterkrankungen boten im Vergleich zu HIV-Patienten ohne Begleiterkrankungen signifikant verminderte Uridinspiegel. Bei Differenzierung nach den einzelnen Befunden zeigte sich, dass nur Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 und chronischen Lebererkrankungen wie Steatosis Hepatis signifikant erniedrigte Spiegel aufwiesen. Im Vergleich von 4 HIV-Patientengruppen mit unterschiedlicher antiretroviraler Therapie verhielten sich die Uridinspiegel analog zur potenziellen mitochondrialen Toxizit{\"a}t des jeweiligen Therapieregimes. Die Patientengruppe mit dideoxy-NRTI-haltiger Therapie wies die niedrigsten Uridinplasmaspiegel auf und zeigte im Vergleich zur Patientenguppe ohne antiretrovirale Therapie signifikant erniedrigte Uridinplasmaspiegel. Mit zunehmender Therapiedauer zeigte sich bei der Therapiegruppe mit dideoxy-haltiger HAART abfallende, bei den anderen 3 Therapiegruppen konstante bis leicht ansteigende Spiegel. SCHLUSSFOLGERUNG: Bei HIV-positiven Patienten scheint die Einnahme von (di)deoxy-NRTIs sowie Koerkrankungen wie Fettleber und Diabetes mellitus Typ 2 mit signifikant niedrigeren Uridinspiegeln assoziiert zu sein. Ob eine Uridinsubstitution zur Vermeidung von NRTI-assoziierten Langzeitnebenwirkungen sinnvoll ist, m{\"u}ssen weitere Untersuchungen zeigen.},
  subject      = {Uridin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gaertner2008,
  author    = {G{\"a}rtner, Kathleen},
  title     = {Absch{\"a}tzung der Genauigkeit der foamyviralen Genomreplikation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-29252},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Foamyviren (FVs) sind die genetisch stabilsten Viren der Retrovirus-Familie. Dies steht im Gegensatz zur Fehlerrate, die f{\"u}r die rekombinante FV Reverse Transkriptase (RT) gefunden wurde. Um die Genauigkeit der FV Genomreplikation in vivo zu ermitteln, analysierten wir das Auftreten von Mutationen nach FV-Vektortransfer in einer einzigen Replikationsrunde. Die Sequenzanalyse von mehr als 90000 Nukleotiden ergab 39 Mutationen. Dies entspricht einer Fehlerrate von ungef{\"a}hr 4 x 10-4 pro Base und Replikationszyklus, wobei alle Mutationen Transitionen von G zu A waren. Eine schwache Expression von APOBEC-Enzymen in den vektorproduzierenden Zellen konnte als wahrscheinlichste Ursache f{\"u}r diesen Typ an Mutationen nachgewiesen werden. Das akzessorische FV Bet Protein wirkt APOBEC entgegen. Kotransfektion von Zellen mit einem bet-Expressionsplasmid resultierte in einer signifikanten Reduktion an Mutationen bei {\"u}ber 170000 zus{\"a}tzlich sequenzierten Basen. Zwei Mutationen konnten nicht der APOBEC-Aktivit{\"a}t zugeschrieben werden, deshalb postulieren wir eine idealisierte FV-Mutationsrate von angen{\"a}hert 7,5 x 10-6 pro Base und Replikationszyklus. Im Gegensatz zu in vitro-Analysen wurde nur eine einzige Deletion und keine Insertion bei mehr als 260000 sequenzierten Basen identifiziert. Die Analyse der Rekombinationsrate von FV-Vektorgenomen ergab mehr als ein zus{\"a}tzliches Template-Switching-Ereignis pro reverser Transkription. Wir konnten auch zeigen, dass ein bestimmtes FV-Partikel in der Lage zum Crosstransfer eines heterologen FV-Genoms ist, jedoch mit einer reduzierten Effizienz als bei Verwendung des homologen Vektors. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse einerseits, dass das Kopieren des FV-Genoms mit h{\"o}herer Genauigkeit geschieht als bisher angenommen, auf der anderen Seite ist Rekombination bei FV-Genomen wahrscheinlich.},
  subject      = {Retroviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kretzschmar2008,
  author    = {Kretzschmar, Benedikt},
  title     = {AZT-Resistenz bei Foamyviren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30272},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Azidothymidin (AZT) ist ein nukleosidischer Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NRTI), der bei HIV-Infektionen in Kombination mit anderen antiretroviralen Substanzen eingesetzt wird. AZT zeigt dar{\"u}berhinaus auch eine gute Wirksamkeit gegen Foamyviren, eine Subfamilie der Retroviren mit charakteristischen Besonderheiten in ihrer Molekularbiologie und ihrem Replikationszyklus, deren Vertreter verschiedene Affenarten und andere S{\"a}ugetiere infizieren, wobei sie sich sowohl im jeweils nat{\"u}rlichen Wirt als auch bei seltener zuf{\"a}lliger Infektion des Menschen apathogen zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das AZT-resistente Foamyvirus SFVmacAZTres untersucht, das in Anwesenheit steigender AZT-Konzentrationen in Zellkultur selektiert worden war. Hierzu wurde SFVmacAZTres zun{\"a}chst einer genotypischen Analyse unterzogen, wobei im Vergleich mit der wildtypischen Ausgangssequenz zwei Mutationen in gag und vier Mutationen in pol nachgewiesen wurden, die zu {\"A}nderungen auf Aminos{\"a}ureebene f{\"u}hrten. Mittels PCR wurden Fragmente, die alle sechs Mutationen oder nur die vier pol-Mutationen enthielten, aus der Sequenz von SFVmacAZTres amplifiziert und jeweils in einen SFVmac-Klon eingef{\"u}gt. Im weiteren Verlauf zeigte sich dabei kein Unterschied zwischen diesen beiden Konstrukten bez{\"u}glich der Replikation in Abwesenheit oder Anwesenheit von AZT, so dass gefolgert werden konnte, dass die gag-Mutationen keinen Beitrag zur AZT-Resistenz leisten. Die pol-Mutationen befanden sich s{\"a}mtlich im f{\"u}r die Reverse Transkriptase kodierenden Bereich und f{\"u}hrten zu den Aminos{\"a}uresubstitutionen K211I, I224T, S345T und E350K. An Position 224 fand sich dabei in einer ver{\"o}ffentlichten Sequenz bereits ein Threonin, so dass hier unabh{\"a}ngig von der Selektion in Anwesenheit von AZT m{\"o}glicherweise ein Polymorphismus vorliegt. Der Vergleich der vier Mutationen der RT von SFVmacAZTres mit den bei HIV bekannten Mustern an Mutationen wie den TAMs und dem Q151M-Komplex zeigte keine {\"U}bereinstimmungen. Um den jeweiligen Beitrag der vier nachgewiesenen pol-Mutationen zur AZT-Resistenz zu untersuchen, wurden sie einzeln und in Kombinationen mittels zielgerichteter Mutagenese in einen SFVmac-Klon eingef{\"u}gt und die entsprechenden Konstrukte auf ihre Replikation in Abwesenheit und Anwesenheit von 0,5 µM, 5µM und 50 µM AZT untersucht. Hierf{\"u}r wurden 293T-Zellen mit dem jeweiligen Plasmid transfiziert und nach {\"U}berpr{\"u}fung der gleichm{\"a}ßigen Expression von Gag und Pol mittels Western Blot der virushaltige {\"U}berstand auf Zielzellen gegeben und der Titer ausgez{\"a}hlt. Es konnte gezeigt werden, dass keines der Konstrukte mit Einzel , Doppel- und Dreifachmutationen eine {\"a}hnlich ausgepr{\"a}gte AZT-Resistenz wie die Vierfachmutante aufwies, allerdings einige in unterschiedlichen Ausmaß teilresistent waren, w{\"a}hrend andere weder ohne noch mit AZT gut replizierten. S345T erwies sich vor E350K als die Mutation mit dem gr{\"o}ßten Beitrag zur AZT-Resistenz, I224T erh{\"o}hte den Titer in Abwesenheit und Anwesenheit um etwa den gleichen Faktor, wohingegen sich K211I in den meisten Kombinationen eher negativ auswirkte. Der Klon, in den alle vier Mutationen mittels zielgerichteter Mutagenese eingef{\"u}hrt worden waren, zeigte die gleiche AZT-Resistenz wie das in Zellkultur selektierte Virus. Damit war gezeigt, dass diese vier Mutationen sowohl notwendig als auch hinreichend f{\"u}r die AZT-Resistenz von SFVmacAZTres sind. Die pol-Mutationen von SFVmacAZTres wurden weiterhin soweit m{\"o}glich an entsprechenden Stellen in Klon des prototypischen Foamyvirus PFV eingef{\"u}hrt, bei dem es zuvor nicht gelungen war, ein resistentes Isolat in Zellkultur zu generieren. Das PFV-Konstrukt mit den Mutationen aus SFVmacAZTres zeigte sich jedoch nicht AZT-resistent, sondern wies einen Replikationsdefekt auf. Einige HIV-Mutationen, die in den PFV-Klon eingef{\"u}gt wurden, f{\"u}hrten ebenfalls zu keiner AZT-Resistenz. Es bestehen also bez{\"u}glich AZT-Resistenz und damit gewisser Eigenschaften der Reversen Transkriptase deutliche Unterschiede zwischen PFV und SFVmac. Die durchgef{\"u}hrten Arbeiten stellen die Grundlage f{\"u}r weitere Untersuchungen dar, in denen beispielsweise dem biochemischen Mechanismus der AZT-Resistenz von SFVmacAZTres nachgegangen werden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse k{\"o}nnen zum Verst{\"a}ndnis allgemeiner Mechanismen der NRTI-Resistenz bei Retroviren ebenso beitragen wie zur weiteren Charakterisierung der foamyviralen Reversen Transkriptase an sich.},
  subject      = {Spumaviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Spannaus2015,
  author    = {Spannaus, Ralf},
  title     = {Regulation der foamyviralen Proteaseaktivit{\"a}t},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation k{\"o}nnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschr{\"a}nktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2' und P2 auf die Aminos{\"a}urereste Valin und Valin/Asparagin beschr{\"a}nkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschr{\"a}nkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollst{\"a}ndige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivit{\"a}t-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollst{\"a}ndige cDNA bilden k{\"o}nnen. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilit{\"a}t der wenigen Env-Trimere auf der H{\"u}llmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molek{\"u}l als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschr{\"a}nkten Env-Mobilit{\"a}t, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da f{\"u}r die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleins{\"a}ure ben{\"o}tigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Dom{\"a}nen f{\"u}r die Aktivierung der Protease ben{\"o}tigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivit{\"a}t resultierte, war die funktionelle RNaseH-Dom{\"a}ne essenziell f{\"u}r die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Dom{\"a}nen von anderen Retroviren resultierte in genomunabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in Zellen und genomabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden.},
  subject      = {Spumaviren},
  language  = {de}
}