@phdthesis{Hassel2003,
  author    = {Hassel, Jessica C.},
  title     = {Untersuchungen zur Apoptoseregulation durch die Melanom induzierende Rezeptortyrosinkinase Xmrk},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-11319},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {{\"U}berexpression der konstitutiv aktiven Rezeptortyrosinkinase Xmrk im Zahnkarpfen Xiphophorus f{\"u}hrt zur Ausbildung maligner Melanome. Expressionsstudien in transgenen Medaka-Fischen haben gezeigt, daß Xmrk allerdings nur in bestimmten Geweben wie Hirn, Epithelien, Auge und Pigmentzellen zur Tumorbildung f{\"u}hrt. Zellen, die durch Xmrk transformiert werden k{\"o}nnen, scheinen somit {\"u}ber entsprechende Komponenten der durch Xmrk induzierten intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion verf{\"u}gen zu m{\"u}ssen. Bisher wurde eine Reihe von Signalproteinen identifiziert, die von Xmrk rekrutiert und aktiviert werden. Dazu geh{\"o}ren die PLC-g, die Adapterproteine Shc und Grb2, die PI3K, die Fyn-Kinase aus der Familie der Src-Kinasen und der Transkriptionsfaktor STAT5. Um die Signaltransduktion von Xmrk in induzierbarer Form untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde eine mit EGF stimulierbare Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk, deren extrazellul{\"a}rer Anteil vom humanen EGF-R und deren intrazellul{\"a}rer Anteil von Xmrk stammt, in der IL-3 abh{\"a}ngigen murinen pro-B-Zellinie Ba/F3 exprimiert. EGF-Stimulation dieser als BaF Hm bezeichneten Zellen f{\"u}hrt zu IL-3 unabh{\"a}ngigem Wachstum und zu Langzeit{\"u}berleben. Stimulation des aus der gleichen Genfamilie stammenden EGF-Rezeptors hingegen, wird er in Ba/F3 Zellen exprimiert, kann kein Langzeit{\"u}berleben vermitteln. Erste Untersuchungen zeigten, daß das durch HER-mrk vermittelte Langzeit{\"u}berleben in Ba/F3 Zellen nicht auf einer h{\"o}heren Rezeptorexpression verglichen mit den EGF-R exprimierenden Zellen beruht. Allerdings korreliert die Rezeptordichte mit der DNA-Syntheseleistung der Ba/F3 Zellen. Durch verschiedene carboxyterminal verk{\"u}rzte HER-mrk Rezeptormutanten wurde eine unterschiedliche Anzahl von Substratbindungsstellen von Xmrk deletiert. Expression dieser HER-mrk Rezeptormutanten in Ba/F3 Zellen zeigte, daß f{\"u}r die Ausl{\"o}sung der Replikation der DNA keine C-terminale Substratbindungsstelle notwendig ist, w{\"a}hrend f{\"u}r eine Vollendung der Zellteilung mit Zellvermehrung und f{\"u}r Langzeit{\"u}berleben zwei membrannahe Substratbindungsstellen ausreichend sind. Der Vergleich der durch die verschiedenen Rezeptoren induzierten Signalwege bzw. der Substratinteraktionen von HER-mrk, seinen Mutanten und dem EGF-R gab Hinweise auf f{\"u}r die Antiapoptose entscheidende Signalwege. Untersuchungen zur Aktivierung von STAT1, 3 und 5 zeigten, daß HER-mrk zu einer Aktivierung aller drei STAT-Proteine f{\"u}hrt, w{\"a}hrend der EGF-R in Ba/F3 Zellen nur STAT1 und 3, nicht aber STAT5 aktivieren kann. Die HER-mrk Rezeptormutanten zeigten, daß f{\"u}r die Aktivierung von STAT5 durch HER-mrk keine carboxyterminale Substratbindungsstelle notwendig ist, diese aber m{\"o}glicherweise durch Stabilisierung der Rezeptorbindung seine Aktivierung verst{\"a}rken. F{\"u}r die Aktivierung von STAT1 und 3 hingegen sind carboxyterminale Substratbindungsstellen entscheidend. Das f{\"u}r ein antiapoptotisches Protein kodierende STAT5-Zielgen bcl-X wurde als HER-mrk Zielgen identifiziert. Auch die schw{\"a}chere STAT5 Aktivierung durch die trunkierte HER-mrk Rezeptormutante Hm delta1006 hatte eine bcl-X Transkription zur Folge, w{\"a}hrend der EGF-R bcl-X nicht induzierte. Untersuchungen weiterer antiapoptotischer Signalwege zeigten, daß die mrk-Kinase sowie ihre Rezeptormutante Hm delta1006 im Gegensatz zum EGF-R auch zu einer Induktion von bcl-2 f{\"u}hren. Da diese Mutante kein Langzeit{\"u}berleben vermittelt, ist somit die Induktion der Genexpression antiapoptotischer Proteine wie Bcl-XL und Bcl-2 nicht ausreichend f{\"u}r Antiapoptose. Es bedarf somit der Kombination mehrerer antiapoptotischer Signalwege, um Langzeit{\"u}berleben zu sichern. Expression der Rezeptorchim{\"a}re HER-mrk in murinen Melanozyten f{\"u}hrt bei Stimulation der mrk-Kinase zur Transformation der Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine starke Induktion von bcl-X nach HER-mrk Stimulation in den Melanozyten nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung humaner Melanomzellinien, die in der Expression verschiedener Rezeptortyrosinkinasen oft ein sehr unterschiedliches Muster zeigen, konnte eine konstitutive Aktivit{\"a}t von STAT5 in allen untersuchten Zellinien nachgewiesen werden, w{\"a}hrend STAT1 und 3 nur eine schwache und inhomogene Basalaktivit{\"a}t aufwiesen. Es zeigt sich folglich ein {\"a}hnliches Bild wie im Xiphophorus-Melanom, in dem ausschließlich STAT5 konstitutiv aktiv ist. Die untersuchten humanen Melanomzellinien zeigten durchweg eine Expression von Bcl-XL. Andere Signalwege wie z.B. die Aktivierung der MAPK hingegen zeigten ein heterogenes Muster bei den verschiedenen Zellinien. Erste Experimente in A375 Zellen deuten darauf hin, daß die Expression von dominant negativem STAT5 zur Reduktion der bcl-X Transkription und zur Apoptose der Zellen f{\"u}hrt (Wellbrock, unver{\"o}ffentlicht). Der STAT5/Bcl-XL Signalweg scheint folglich ganz entscheidend f{\"u}r die Antiapoptose von Melanomen zu sein.},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schust2006,
  author    = {Schust, Jochen},
  title     = {Neue Ans{\"a}tze zur Identifizierung niedermolekularer Inhibitoren der STAT3-Aktivierung und -Homodimerisierung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-19952},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Die STATs (signal transducers and activators of transcription) sind eine Familie latent zytoplasmatischer Transkriptionsfaktoren, die Signale von der Zellmembran in den Zellkern weiterleiten. Ein Mitglied der Proteinfamilie, STAT3, ist aufgrund {\"u}berm{\"a}ßiger Tyrosinkinase-Aktivit{\"a}t in einer breiten Vielzahl von Krebszelllinien und menschlichen Tumoren konstitutiv-aktiv. Um kleine organische Molek{\"u}le zu identifizieren, die die Funktion der SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 blockieren und dadurch die Aktivit{\"a}t und die Dimerisierung des Proteins inhibieren, wurde ein Hochdurchsatz-Verfahren entwickelt, welches auf Fluoreszenzpolarisation beruht. Das Prinzip dieses Verfahrens war die Bindung eines Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids, welches von gp130, einer Untereinheit des Interleukin-6-Rezeptors, abgeleitet war, an nicht phosphoryliertes STAT3-Protein. Der Kd Wert dieser Bindung betrug 150 nM und der Assay war stabil im Hinblick auf die Salzkonzentration, der Konzentration an Dimethylsulfoxid und der Zeit. Der Assay wurde auf ein 384-Lochplattenformat angepasst und wies einen Z'-Wert von 0,87 auf. Das Fluorscein-markierte Phosphotyrosin-Peptid band spezifisch an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 und die Bindung konnte durch Phosphotyrosin-Peptide unterschiedlich stark inhibiert werden. Die Hochdurchsatz-Analyse mehrerer Substanzbibliotheken f{\"u}hrte schließlich zur Identifikation eines spezifischen STAT3-Inhibitors, Stattic (STAT three inhibitory compound). Stattic ist das erste nicht-peptidische kleine Molek{\"u}l, welches selektiv die Funktion der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne beeintr{\"a}chtigte. Dabei spielte der Aktivierungszustand von STAT3 in vitro keine Rolle. Die gleichzeitige Inkubation mit Stattic f{\"u}hrte im Fluoreszenzpolarisations-Assay zur Inhibition der Bindung des Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3. Diese antagonistische Reaktion stellte sich als stark temperaturabh{\"a}ngig heraus und hatte in vitro bei der physiologisch relevanten Temperatur von 37°C nach 60 Minuten einen IC50 Wert von 5,1 µM. Zusammen mit einer Abh{\"a}ngigkeit von der Zeit wiesen die Ergebnisse auf eine irreversibel ablaufende Reaktion unter Kn{\"u}pfung einer kovalenten Bindung zwischen Stattic und STAT3 hin. Die Inhibition war spezifisch gegen{\"u}ber der Bindung verschiedener Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptide an die jeweiligen Proteine STAT1, STAT5b und Lck und Stattic hatte ebenfalls nur einen sehr geringen Effekt auf die Proteindimerisierung von c-Myc/Max und Jun/Jun. Die genauere Betrachtung der Kinetik der antagonistischen Reaktion zeigte eine signifikante Verlangsamung der Reaktionsgeschwindigkeit beim Vergleich zwischen STAT3 und STAT1 bzw. STAT3 und STAT5b. Die Inhibierung der Bindung des entsprechenden Fluorescein-markierten Phosphotyrosin-Peptids an das Protein Lck durch Stattic war hingegen nicht zeitabh{\"a}ngig. Diese Versuche zeigten eine deutliche Pr{\"a}ferenz der Bindung von Stattic an das Protein STAT3. Die Verdr{\"a}ngung des Fluorescein-markierten Phosphoytrosin-Peptids von der STAT3-SH2-Dom{\"a}ne durch Stattic verlief kompetitiv zur Inhibition mit einem Phophotyrosin-Peptid, welches an die SH2-Dom{\"a}ne von STAT3 bindet. In Verbindung mit den vorherigen Experimenten wies dies auf eine kovalente Bindung von Stattic innerhalb des STAT3-Proteins hin. Eine abschließende Struktur-Wirkungs-Beziehung in vitro zeigte die Notwendigkeit sowohl von der Nitrogruppe als auch von der Doppelbindung der Vinylsulfongruppe in Stattic f{\"u}r die Bindung an STAT3 und untermauerte die These, dass Stattic kovalent innerhalb des STAT3-Proteins bindet. In zellbiologischen Systemen wurde die Wirksamkeit von Stattic anhand verschiedener molekularbiologischer Assays best{\"a}tigt. Stattic inhibierte selektiv die Tyrosinphosphorylierung von STAT3 in HepG2 Zellen, in NIH3T3/v-Src Zellen und in den Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-435S. Aber auch bereits phosphorylierte STAT3-Proteine wurden durch Stattic in vitro an der Homodimerisierung gehindert, was in einer EMSA-Analyse gezeigt wurde. Somit inhibierte Stattic in vitro selektiv die Signalkette von STAT3 unabh{\"a}ngig von dessen Aktivierungszustand. Andere Signalketten oder die Funktion der in der Signalkette {\"u}ber STAT3 liegenden Tyrosinkinasen wurden in Zellen nicht beeinflusst. Im Folgenden konnte demonstriert werden, dass Stattic als direkter STAT3-Inhibitor dessen Lokalisierung in den Zellkern inhibierte, nicht jedoch die Lokalisierung des Gegenspielers STAT1. Weiterhin reduzierte der Einsatz von Stattic selektiv das von v-Src in NIH3T3 Zellen induzierte und von STAT3-abh{\"a}ngige Wachstum von Kolonien in Weichagar. Dass Stattic schließlich selektiv die Apoptoserate in Zellen mit konstitutiver STAT3-Aktivt{\"a}t erh{\"o}hte, best{\"a}tigte die bisherigen Daten. Mit Stattic konnte daher ein neues biologisches Werkzeug generiert werden, um selektiv STAT3 in Zelllinien oder Tumoren in Tiermodellen auszuschalten, die eine konstitutive STAT3-Aktivit{\"a}t aufweisen.},
  subject      = {STAT},
  language  = {de}
}
@phdthesis{ThangarajSelvaraj2013,
  author    = {Thangaraj Selvaraj, Bhuvaneish},
  title     = {Role of CNTF-STAT3 signaling for microtubule dynamics inaxon growth and maintenance: Implications in motoneuron diseases},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-76889},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Neurotrophic factor signaling modulates differentiation, axon growth and maintenance, synaptic plasticity and regeneration of neurons after injury. Ciliary neurotrophic factor (CNTF), a Schwann cell derived neurotrophic factor, has an exclusive role in axon maintenance, sprouting and synaptic preservation. CNTF, but not GDNF, has been shown to alleviate motoneuron degeneration in pmn mutant mice carrying a missense mutation in Tbce gene, a model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). This current study elucidates the distinct signaling mechanism by which CNTF rescues the axonal degeneration in pmn mutant mice. ...},
  subject      = {Ciliary neurotrophic factor},
  language  = {en}
}