@phdthesis{Stempka2011, author = {Stempka, Martin}, title = {Expression und Reinigung der SARS-Coronavirus-M^pro und deren Co-Kristallisation mit spezifischen Inhibitoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57083}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom") handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivit{\"a}t einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schl{\"u}sselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren f{\"u}r diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolek{\"u}len an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Molek{\"u}ls pro Enzym-Monomer: {\"u}berraschenderweise hatten bis zu vier Molek{\"u}le MH211A bzw. zwei Molek{\"u}le UK-VI-1g an ein Proteasemolek{\"u}l gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminos{\"a}uren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der N{\"a}he der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimts{\"a}ure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei m{\"o}gliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer R{\"o}ntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass fr{\"u}her ver{\"o}ffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal {\"u}berdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und fr{\"u}heren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.}, subject = {SARS}, language = {de} } @phdthesis{Schiller2009, author = {Schiller, Markus}, title = {Neue Derivate der Etacryns{\"a}ure: Synthese und biologische Aktivit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39368}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Etacryns{\"a}ure - ein langj{\"a}hrig eingesetztes Diuretikum - und verschiedene ihrer Derivate sind als nichtpeptidische Inhibitoren von Cystein-Proteasen bekannt. Einige Amid-Derivate besitzen bez{\"u}glich des SARS-CoV sowohl enzymhemmende (SARS-CoV-Mpro) als auch antivirale Wirkung. Das elektrophile Strukturfragment des Molek{\"u}ls, das als Michael-Akzeptor eine Reaktion mit dem active-site Cystein-Rest der Protease eingehen kann, ist die a,b-unges{\"a}ttigte Carbonyleinheit in der Acyl-Seitenkette. Ausgehend von der Etacryns{\"a}ure als Leitstruktur wurden durch Strukturvariationen neue Etacryns{\"a}ure-Derivate, bevorzugt Amid-Derivate, dargestellt. Zus{\"a}tzlich zu diesen Verbindungen wurden außerdem weitere Etacryns{\"a}ure-Derivate synthetisiert, die durch Biotin- und Deuterium-Markierung als Modellsubstanzen zum In-vitro-Nachweis des Wirkstoffes in biochemischen und spektroskopischen Assays dienen. Als deuterierte Spezies wurde mit der d9-Etacryns{\"a}ure ein hochdeuteriertes Wirkstoff-Analogon dargestellt. Der Grad der Deuterium-Markierung konnte durch Kupplung von d13-n-Hexylamin an die d9-Etacryns{\"a}ure noch auf ein d22-Amid-Derivat erweitert werden. Insgesamt konnten neben dem direkten d9-Analogon des Wirkstoffes drei weitere Amid-Derivate erhalten werden. Zur Testung der erhaltenen Substanzen an der SARS-CoV-Mpro war die Synthese eines FRET-Substrats erforderlich. Daf{\"u}r wurde mittels automatisierter SPPS ein Dekapeptid mit dem FRET-Donor-Akzeptor-Paar Anthranils{\"a}ure - Nitrotyrosin hergestellt. Das Substrat besitzt die Sequenz H2N-Abz-Ser-Val-Thr-Leu-Gln-Ser-Gly-Tyr(NO2)-Arg(Mts)-COOH. Der Km-Wert f{\"u}r die SARS-CoV-Mpro wurde unter Ber{\"u}cksichtigung des inner filter effect zu 190 ± 23 µM bestimmt. Zur Evaluation der enzymhemmenden Aktivit{\"a}t wurden die synthetisierten Inhibitoren an den drei Enzymen SARS-CoV-Mpro, SARS-CoV-PLpro und Cathepsin L getestet. Als potenteste Inhibitoren wurden das Bromanisol MS07 (Ki = 52.7 µM, SARS-CoV-Mpro) sowie das Norethyl-Derivat der Etacryns{\"a}ure MS21 (Ki = 22.8 µM, Cathepsin L) identifiziert. Alle getesteten Verbindungen zeigten an der SARS-CoV-PLpro keine Aktivit{\"a}t. Im Rahmen des SFB 630 wurden mit den synthetisierten Verbindungen weitere Testungen an Bakterien, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei sowie an Makrophagen durchgef{\"u}hrt. Dabei zeigten die Verbindungen MS38, MS40 und MS41 eine besondere Wirksamkeit. Es konnten zwar im Wachstumstest sowie im Biofilmtest Aktivit{\"a}ten gegen den Bakterienstamm Staphylococcus epidermidis sowie die Hemmung der Biofilmbildung von S. epidermidis festgestellt werden. Die zur Hemmung notwendigen Mindestkonzentrationen lagen oberhalb der Konzentrationen, die auch cytotoxisch auf Makrophagen wirkt. {\"A}hnliches gilt f{\"u}r die Aktivit{\"a}t an L. major. Bez{\"u}glich T. b. brucei zeigen diese drei Verbindungen jedoch eine erh{\"o}hte Aktivit{\"a}t mit MHK-Werten von < 1 µM. Das bedeutet, dass f{\"u}r eine Hemmung eine Konzentration erforderlich ist, die um Faktor 4 bis 11 unterhalb der cytotoxischen Konzentration liegt. Dieser Wert konnte nur noch durch das Biotin-markierte Derivat MS57 (IC50 T. b. brucei: 0.69 µM; IC50 Makrophagen: 33.8 µM) {\"u}bertroffen werden. Weitere Untersuchungen mit der Biotin-markierten Verbindung MS57 zeigten zudem eine Hemmung von Falcipain-2 und -3 sowie von Plasmodium falciparum mit IC50-Werten von 3.0 µM (FP-2) 11.9 µM (FP-3) und 9.0 µM (P.f.). Weiterhin konnte mit Hilfe der Massenspektrometrie eine Bindung von MS57 an FP-2 nachgewiesen werden. Diese findet aber offensichtlich nicht im aktiven Zentrum des Enzyms statt. Die deuterierten Derivate der Etacryns{\"a}ure kamen als Modellsubstanzen zur Etablierung eines CARS-Mikroskopie-Assays zur spektroskopischen Wirkstoffdetektion zum Einsatz. Dabei war es bisher m{\"o}glich, das CARS-Signal der d9-Etacryns{\"a}ure in DMSO-L{\"o}sung bis zu einer Konzentration von 500 µM zu erfassen. Quantenchemische Berechnungen zur Simulation des Reaktionsmechanismus des active-site-Cystein-Restes der SARS-CoV-Mpro mit Michael-Systemen als elektrophilem warhead zeigten, dass es sich dabei um einen zweistufigen Prozess handelt, bei dem nach erfolgter Deprotonierung des Thiols der Angriff an der Doppelbindung erfolgt. Zudem ergaben die Berechnungen, dass sowohl Halogenarylsubstituenten am Carbonylkohlenstoff sowie exo-konfigurierte Systeme sich energetisch g{\"u}nstig auswirken. Diese Trends konnten durch kinetische NMR-Experimente durch Umsetzung einer Reihe von Modellsubstanzen mit p-Methoxythiophenolat best{\"a}tigt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass f{\"u}r die betrachteten Systeme die Umsetzung innerhalb von wenigen Minuten, sp{\"a}testens aber innerhalb von 90 Minuten zu 99 \% erfolgt ist.}, subject = {Etacryns{\"a}ure}, language = {de} } @phdthesis{Rupp2009, author = {Rupp, Ingrid}, title = {Die Gametogenese des humanpathogenen Malariaerregers Plasmodium falciparum - eine Charakterisierung von daran beteiligten Proteasen sowie die Beschreibung und Funktionsanalyse von dabei auftretenden interzellul{\"a}ren Gametenfilamenten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-47830}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Malaria stellt mit einer Mortalit{\"a}t von {\"u}ber einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit f{\"u}r den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegen{\"u}ber den verf{\"u}gbaren Medikamenten erh{\"o}hen mehr denn je den Druck, neue Therapiem{\"o}glichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechm{\"u}cke w{\"u}rde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers f{\"u}hren. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzukl{\"a}ren und neue Angriffspunkte f{\"u}r Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der m{\"a}nnlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien ben{\"o}tigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivit{\"a}t von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-{\"a}hnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-{\"a}hnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen f{\"u}r den erfolgreichen Abschluss der m{\"a}nnlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zus{\"a}tzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 n{\"a}her untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte f{\"u}r Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci f{\"u}r Rekombinationsereignisse zug{\"a}nglich sind. Die Ergebnisse der {\"u}brigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 f{\"u}r Rekombinationsereignisse unzug{\"a}nglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien f{\"u}r PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre m{\"o}gliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubul{\"a}ren Zellausl{\"a}ufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausl{\"a}ufer der parasit{\"a}ren Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gef{\"u}llt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abst{\"a}nden von beulenartigen Ausw{\"o}lbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausl{\"a}ufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die F{\"a}higkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adh{\"a}rieren. Die Filamente waren bereits f{\"u}nf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 \% der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfl{\"a}che verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechm{\"u}cke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese f{\"u}r diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adh{\"a}siven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechm{\"u}cke auftreten. M{\"o}glicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden.}, subject = {Plasmodium falciparum}, language = {de} } @article{OliAbdelmohsenHentscheletal.2014, author = {Oli, Swarna and Abdelmohsen, Usama Ramadan and Hentschel, Ute and Schirmeister, Tanja}, title = {Identification of Plakortide E from the Caribbean Sponge Plakortis halichondroides as a Trypanocidal Protease Inhibitor using Bioactivity-Guided Fractionation}, series = {MARINE DRUGS}, volume = {12}, journal = {MARINE DRUGS}, number = {5}, issn = {1660-3397}, doi = {10.3390/md12052614}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-116536}, pages = {2614-2622}, year = {2014}, abstract = {In this paper, we report new protease inhibitory activity of plakortide E towards cathepsins and cathepsin-like parasitic proteases. We further report on its anti-parasitic activity against Trypanosoma brucei with an IC50 value of 5 mu M and without cytotoxic effects against J774.1 macrophages at 100 mu M concentration. Plakortide E was isolated from the sponge Plakortis halichondroides using enzyme assay-guided fractionation and identified by NMR spectroscopy and mass spectrometry. Furthermore, enzyme kinetic studies confirmed plakortide E as a non-competitive, slowly-binding, reversible inhibitor of rhodesain.}, language = {en} }