@phdthesis{Zinke2012,
  author    = {Zinke, Michael Benedikt},
  title     = {Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. {\"A}tiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich w{\"a}hrend des Krankheitsverlaufes eine ausgepr{\"a}gte Immunantwort des nat{\"u}rlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt f{\"u}hrt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiem{\"o}glichkeit diesbez{\"u}glich k{\"o}nnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen f{\"u}r einen m{\"o}glichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgew{\"a}hlt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgew{\"a}hlt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden f{\"u}r weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgew{\"a}hlten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine {\"a}ußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und f{\"u}hrten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die F{\"a}higkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung" stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird.},
  subject      = {RNS-Interferenz},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Lim2007,
  author    = {Lim, Hee-Young},
  title     = {Functional studies of GR and MR function by RNA interference},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-23646},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Steroidhormone Corticosteron/Cortisol und Aldosteron werden in Folge von Stress oder eines ver{\"a}nderten Salz-Wasser-Haushalt durch die Nebenniere synthetisiert und sezerniert. Dies wird durch negative R{\"u}ckkopplungsmechanismen kontrolliert, die als HPA-Achse und RAAS bezeichnet werden. Die Aktivit{\"a}t dieser Steroidhormone wird durch den Glukokortikoid Rezeptor (GR) und den Mineralokortikoid-Rezeptor (MR) vermittelt, die im Zytosol als Komplex mit Hitze-Schock-Proteinen vorliegen. Sowohl der GR als auch der MR geh{\"o}ren zur Kern-Rezeptor Superfamilie und besitzen eine gemeinsame Proteinstruktur die aus drei verschiedenen Dom{\"a}nen besteht. Trotzdem haben sie verschiedene Affinit{\"a}ten f{\"u}r ihre Liganden, ihre Aktivit{\"a}t h{\"a}ngt von der Hormonkonzentration ab, sie werden durch Pr{\"a}-Rezeptor-Mechansimen wie der 11b-HSD2 reguliert und ihre Gewebeverteilung ist unterschiedlich. Aldosteron wirkt in epithelialen und nicht-epithelialen Zellen {\"u}ber den MR und reguliert den Salz-Wasser-Haushalt, die Herzfunktion, die neuronale Erregbarkeit und die Adipozyten-Differenzierung. Bislang war die Analyse der Geninaktivierung in vivo auf M{\"a}use beschr{\"a}nkt, obwohl Krankheitsmodelle in der Ratte die Verh{\"a}ltnisse im Menschen manchmal besser widerspiegeln. Da embryonale Stammzellen und damit die gezielte Genmanipulation in Ratten nicht verf{\"u}gbar sind, haben wir MR knock-down Ratten mittels lentiviral eingef{\"u}hrter shRNAs hergestellt. Die F1 Nachkommen der Gr{\"u}nder-Ratten zeigten unterschiedlich stark reduzierte MR mRNA und Protein Niveaus in Niere und Hippocampus, den Hauptexpressions-Regionen des MR. Im Gegensatz dazu war die Expression des GR unver{\"a}ndert, was die Spezifit{\"a}t der Geninaktivierung belegt. Die zwei MR Zielgene Sgk1 und ENaC waren hochreguliert w{\"a}hrend die mRNA Spiegel anderer Gene wie IK1 und SCD2 erniedrigt waren. {\"A}hnlich wie in den knock-out M{\"a}usen und Patienten zeigten die knock-down Ratten die typischen Merkmale des Pseudohypoaldosteronismus Typ I wie erh{\"o}hte Serumspiegel von Aldosteron und Renin sowie Wachstumsretardation. Weiterhin fanden wir einen linearen Zusammenhang zwischen der MR Expression in der Niere, den Serum Aldosteron-Werten und dem K{\"o}rpergewicht. Zusammengefasst sind unsere MR knock-down Ratten unter den ersten Beispielen f{\"u}r RNAi in vivo und belegen, dass diese Technik es erlaubt, abgestufte Auspr{\"a}gugen der Geninktivierung wie in humanen genetischen Erkrankungen zu erreichen. Weiterhin haben wir die Rolle des GR und des MR f{\"u}r die immunmodulatorische Aktivit{\"a}t der Glukokortikoide in peritonealen Makrophagen untersucht. GCs sind an der Kontrolle der Makrophagenfunktion beteiligt und regulieren so die Reaktion gegen{\"u}ber Pathogenen. Aus diesem Grund werden GCs weitverbreitet zur Behandlung von Enz{\"u}ndungen und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Allerdings ist bez{\"u}glich dieser GC Aktivit{\"a}ten weder bekannt welche Kontrolle die Hormonkonzentration spielt noch kennt man den differentiellen Beitrag des GR und des MR. Zuerst best{\"a}tigten wir die Expression beider Rezeptoren in peritonealen Makrophagen w{\"a}hrend die 11b-HSD2 nicht exprimiert war. Anschließend zeigten wir, dass niedrigte Corticosteron-Level die NO Produktion sowie die mRNA Expression von pro-inflammatorischen Zytokinen, Chemokinen und Enzymen die f{\"u}r die Mediator-Synthesee ben{\"o}tigt werden erh{\"o}hen. Im Gegensatz dazu war die Makrophagen Funktion bei hohen Corticosteron-Konzentrationen stark reprimiert. Eine wichtige Beobachtung war, dass die Inaktivierung des GR durch lentiviral eingef{\"u}hrte siRNAs sowohl die immunstimulatorischen als auch die immunsuppressiven GR Aktivit{\"a}ten aufhob w{\"a}hrend die Inaktivierung des MR keine Konsequenzen hatte. Weiterhin f{\"u}hrte der Verlust endogenener GCs nach Adrenalektomie in vivo zu einem pr{\"a}-aktivierten Zustand der Makrophagen, welcher durch Corticosteron moduliert werden konnte. Wir schließen hieraus, dass GCs in Abh{\"a}ngigkeit von ihrer Konzentration unterschiedliche Effekte auf die Makrophagen Funktion haben und dass diese durch den GR vermittelt werden, obwohl der MR ebenfalls exprimiert ist. Zusammengefasst best{\"a}tigen unsere Ergebnisse dass die lenivirale Transduktion von shRNAs eine effiziente Methode zur Geninaktivierung in prim{\"a}ren Zellen und transgenen Ratten darstellt und es so erlaubt, funktionelle Studien durchzuf{\"u}hren die zuvor auf M{\"a}use beschr{\"a}nkt waren.},
  language  = {en}
}