@phdthesis{Kottmair2014,
  author    = {Kottmair, Mathias},
  title     = {Bambi - Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in h{\"o}heren Tieren, die viele Vorg{\"a}nge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen {\"u}ber absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt {\"u}ber promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabh{\"a}ngig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranst{\"a}ndigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegen{\"u}ber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg {\"u}ber Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war. In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne von hBambi anhand der gel{\"o}sten Kristallstruktur der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlussk{\"o}rpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualit{\"a}tskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekund{\"a}rstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinit{\"a}t zu ann{\"a}hernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodom{\"a}nen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur f{\"a}lschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird {\"u}berdies nicht {\"u}ber die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabh{\"a}ngige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich best{\"a}tigten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chim{\"a}re Konstrukte aus f{\"u}r Bambi- und BR1A-Dom{\"a}nen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgef{\"u}hrt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, h{\"o}here Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chim{\"a}ren Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antik{\"o}rper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellul{\"a}ren BR1A-Dom{\"a}ne mit zugeh{\"o}riger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, n{\"a}mlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein f{\"u}r die Strukturaufkl{\"a}rung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalit{\"a}t dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verst{\"a}ndnis der ICD aufkl{\"a}rende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament f{\"u}r weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hellmann2013,
  author    = {Hellmann, Tina Verena},
  title     = {Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die gr{\"o}ßte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schl{\"u}sselfunktionen w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Embryogenese inne und regulieren dar{\"u}ber hinaus die Organogenese sowie die Hom{\"o}ostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale {\"u}ber zwei Typen transmembran{\"a}rer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur f{\"u}nf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegen{\"u}ber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuit{\"a}t der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden k{\"o}nnen, m{\"u}ssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. K{\"u}rzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben - die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. F{\"u}r das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abh{\"a}ngige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widerspr{\"u}chlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zun{\"a}chst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies erm{\"o}glichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodom{\"a}nen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten dar{\"u}ber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodom{\"a}nen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der l{\"o}sliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabh{\"a}ngig inhibiert, w{\"a}hrend die membranverankerte RGMb-Variante eine Verst{\"a}rkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodom{\"a}nen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivit{\"a}t neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich f{\"u}r die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere {\"U}berlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren f{\"u}r die Ausbildung der beobachteten Selektivit{\"a}t verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellul{\"a}rer Ebene analysieren zu k{\"o}nnen, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte f{\"u}r BMP-Rezeptoren sowie f{\"u}r RGMb synthetisiert und ein funktionelles F{\"a}rbeprotokoll f{\"u}r die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt f{\"u}r die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Dar{\"u}ber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, m{\"o}glicherweise v{\"o}llig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifit{\"a}t und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden k{\"o}nnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge f{\"u}r eine zuk{\"u}nftige detaillierte Aufkl{\"a}rung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abh{\"a}ngigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellul{\"a}rer Ebene dar.},
  subject      = {Knochen-Morphogenese-Proteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kraich2008,
  author    = {Kraich, Michael},
  title     = {Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberfl{\"a}chenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die {\"u}berlappenden, biologischen Funktionen erkl{\"a}ren lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminos{\"a}ureebene nur etwa 25\% Sequenzidentit{\"a}t besitzen und stark unterschiedliche Affinit{\"a}ten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinit{\"a}t und die Spezifit{\"a}t der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabh{\"a}ngig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien f{\"u}r IL-13 und die extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es m{\"o}gliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuf{\"u}hren.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-{\"a}hnliche Dom{\"a}ne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminos{\"a}urereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten f{\"u}r die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch f{\"u}r die niederaffine Bindung von IL-4 von gr{\"o}ßter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope f{\"u}r IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und {\"u}berlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es m{\"o}glich, ein Strukturmodell der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Dom{\"a}ne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminos{\"a}urerest auf der Oberfl{\"a}che von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzukl{\"a}ren, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach h{\"o}herer Affinit{\"a}t an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinit{\"a}tssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformations{\"a}nderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zus{\"a}tzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen f{\"u}hrt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabh{\"a}ngig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zus{\"a}tzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinit{\"a}t zwischen Ligand und Rezeptor erh{\"o}ht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfl{\"a}che zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette m{\"o}glicherweise einen Mechanismus dar, {\"u}ber den Proteine die Affinit{\"a}t von Wechselwirkungen {\"u}ber einen großen Bereicht variieren k{\"o}nnen, ohne dabei Spezifit{\"a}t einzub{\"u}ssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmolek{\"u}le f{\"u}r die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, k{\"o}nnen die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen {\"u}ber den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Molek{\"u}le zu entwickeln.},
  subject      = {Renaturierung <Biochemie>},
  language  = {de}
}