@phdthesis{Spannaus2015,
  author    = {Spannaus, Ralf},
  title     = {Regulation der foamyviralen Proteaseaktivit{\"a}t},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-113401},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Alle Retroviren prozessieren ihre Pol- und Strukturproteine mit Hilfe der viralen Protease. In dieser Arbeit wurden zentrale Mechanismen der Regulation der foamyviralen Protease untersucht und charakterisiert. Dazu wurde eine chromatographische Virusreinigungsmethode entwickelt und die relative Pol- und Env-Enkapsidierung bestimmt. Foamyviren enthalten weniger Pol als andere Retroviren aber deutlich mehr Env als humane Immunodefizienzviren. Die Pol-Inkorporation k{\"o}nnte durch die limitierte Prozessierung mit nur einer einzigen Schnittstelle in Gag und Pol kompensiert werden. Deshalb wurde untersucht, ob die foamyvirale Protease ein beschr{\"a}nktes Schnittstellenrepertoire aufweist. In Zellkulturen sind die Schnitt-stellenpositionen P2' und P2 auf die Aminos{\"a}urereste Valin und Valin/Asparagin beschr{\"a}nkt. Demnach hat die foamyvirale Protease ein eingeschr{\"a}nkteres Schnittstellenrepertoire als die Protease des humanen Immunodefizienzvirus. Weiterhin wurde hier gezeigt, dass die vollst{\"a}ndige reverse Transkription die Prozessierung von Gag voraussetzt und Proteaseaktivit{\"a}t-defiziente oder Gag-Schnittstellen-defiziente Viren keine vollst{\"a}ndige cDNA bilden k{\"o}nnen. Demnach kompensieren Foamyviren die niedrige Proteasekonzentration, indem sie sicherstellen, dass die reverse Transkription erst nach der Gag-Maturation vollendet werden kann. Weiterhin wird bei humanen Immunodefizienzviren durch die Gag-Maturation die essenzielle Mobilit{\"a}t der wenigen Env-Trimere auf der H{\"u}llmembran getriggert. Die erstmals in dieser Arbeit bei Foamyviren quantifizierte Env-Menge ergab, dass Foamyviren 28 mal mehr Env- pro Gag-Molek{\"u}l als humane Immunodefizienzviren besitzen. Wahrscheinlich dient dieser hohe Env-Gehalt der Kompensation der eingeschr{\"a}nkten Env-Mobilit{\"a}t, die durch die limitierte Gag-Prozessierung an nur einer carboxyterminalen Schnittstelle verursacht wird. Da f{\"u}r die Aktivierung der foamyviralen Protease virale Ribonukleins{\"a}ure ben{\"o}tigt wird, wurde untersucht, welche Pol-Dom{\"a}nen f{\"u}r die Aktivierung der Protease ben{\"o}tigt werden. Im Gegensatz zur Integrase, deren Deletion in reduzierter Proteaseaktivit{\"a}t resultierte, war die funktionelle RNaseH-Dom{\"a}ne essenziell f{\"u}r die Gag-Prozessierung. Die Substitution der foamyviralen RNaseH durch RNaseH-Dom{\"a}nen von anderen Retroviren resultierte in genomunabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in Zellen und genomabh{\"a}ngiger Proteaseaktivit{\"a}t in den rekombinanten Viren. Demnach scheint die dimerstabilisierende Funktion der RNaseH durch direkte Protein-Protein-Interaktion oder durch unspezifische RNA-Bindung verursacht zu werden.},
  subject      = {Spumaviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Thuemer2009,
  author    = {Th{\"u}mer, Leonore},
  title     = {Charakterisierung eines Foamyvirus-Isolats des Klammeraffens - SFVspm - aus der Neuen Welt},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48942},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Foamyviren geh{\"o}ren zur Familie der Retroviren und sind in vielen verschiedenen Primaten-Spezies pr{\"a}valent. Auch einzelne Foamyvirus-Infektionen des Menschen sind nach engem Kontakt zu Primaten beschrieben worden. Untersuchungen auf molekularer Ebene lagen bisher nur f{\"u}r Foamyviren der Altweltaffen vor. In der vorliegenden Arbeit wurde die komplette Nukleotidsequenz des Neuweltaffen-Foamyvirus des Klammeraffens (SFVspm) entschl{\"u}sselt und molekular charakterisiert. DNA wurde aus SFVspm infizierten Zellen isoliert. Ausgehend von einem 425 bp langen bekannten Abschnitt des Integrase-Gens wurde das foamyvirale Genom mithilfe der Polymerasekettenreaktion in f{\"u}nf Abschnitten amplifiziert. Die Primer wurden anhand konservierter Sequenzen im SFV-Genom generiert. Die Genomabschnitte des 5'-Endes bis zum Integrase-Gen von SFVspm wurden in Plasmidvektoren kloniert und anschließend sequenziert, die Genomabschnitte vom Integrase-Gen zum 3'-Ende wurden direkt nach der PCR-Amplifikation sequenziert. Die Sequenzen der einzelnen SFVspm-Fragmente wurden zu einem zusammenh{\"a}ngenden Genom zusammengesetzt, wobei die Consensus-Sequenz aus mindestens drei unabh{\"a}ngigen Sequenzierungen pro Nukleotid ermittelt wurde. Anhand von Homologie-Vergleichen konnte das SFVspm mit einer Gr{\"o}ße von 12212 bp als komplexes Retrovirus der Unterfamilie der Spumaretrovirinae identifiziert werden. Es besitzt alle konservierten Protein-Domainen, die charakteristisch f{\"u}r Primaten-Foamyviren sind. SFVspm stellt somit das erste vollst{\"a}ndig sequenzierte und molekulargenetisch charakterisierte Neuweltaffen-FV dar. Zur Entwicklung eines diagnostischen Tests zum Nachweis einer SFVspm-Infektion wurde ein 765 bp langer Abschnitt des gag-Gens als Antigen exprimiert und ein Antik{\"o}rper im Kaninchen-Serum generiert. In einem Western Blot zeigte sich f{\"u}r eine Detektion von SFVspm-Gag-Antigen bzw. Anti-SFVspm-Gag eine gute Spezifit{\"a}t und Sensitivit{\"a}t. Die auf Western Blot basierte Methodik wurde schließlich in Kombination mit einer PCR des Integrase-Gens zum Nachweis einer Infektion mit Neuweltaffen-Foamyvirus in Callithrix spp. angewandt. Es wurden Seren und Lymphozyten-DNA zw{\"o}lf verschiedener Callithrix-Affen, sowie Gewebeproben aus Milz, Leber und Mundschleimhaut untersucht, wobei in keinem Tier eine SFV-Infektion nachgewiesen werden konnte. Da Foamyviren aufgrund ihrer genetischen Stabilit{\"a}t interessante Marker f{\"u}r phylogenetische Untersuchungen sind, wurden anhand der Kenntnis der Genomsequenz von SFVspm und f{\"u}nf Altweltaffen-FV phylogenetische Stammb{\"a}ume basierend auf Nukleotid- und Aminos{\"a}uresequenzen und der Maximum-Likelihood-Methode gezeichnet und SFVspm evolution{\"a}r eingeordnet. SFVspm zeigte sich als das evolution{\"a}r divergenteste Foamyvirus aus der Teilordnung der Primaten-Foamyviren. Dies spiegelt die phylogenetische Auftrennung ihrer Wirte, der Altweltaffen und Neuweltaffen, wider und bekr{\"a}ftigt eine gemeinsame Evolution von Foamyviren und ihren Wirten.},
  subject      = {Foamyviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Wiktorowicz2009,
  author    = {Wiktorowicz, Tatiana},
  title     = {Herstellung eines neuen foamyviralen Vektors durch Einengung der cis-aktiven Sequenzen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40008},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Im Vergleich zu anderen Retroviren, zeichnen sich Foamyviren durch eine Reihe von Eigenschaften aus, die sie besonders attraktiv f{\"u}r die Vektorentwicklung und somatische Gentherapie machen. Foamyviren exprimieren ihr Pol Prekursorprotein unabh{\"a}ngig von Gag, d.h. von ihrer eigenen gespleisten mRNA. Zwar ist der genaue Pol-Verpackungsmechanismus von Foamyviren noch nicht vollst{\"a}ndig aufgekl{\"a}rt, fr{\"u}here Studien zeigten jedoch, dass die pr{\"a}genomische RNA essentiell f{\"u}r die Pol-Enkapsidierung ist. Zwei Pol-Verpackungssequenzen (PES) wurden identifiziert, welche sich in den cis-aktiven Sequenzen (CAS) der pr{\"a}genomischen RNA befinden (Heinkelein et al., 1998; Peters et al., 2005). In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die PESI und PESII Sequenzen alleine ausreichend f{\"u}r die Pol-Verpackung sind. Zus{\"a}tzich wurde der Einfluss von verschiedenen Teilen der ca. 2000 nt langen CASII Sequenz auf den Vektortransfer ohne Verlust der Pol-Enkapsidierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PESI und PESII alleine nicht ausreichend f{\"u}r die Pol-Verpackung ins foamyvirale Partikel sind. Die Verk{\"u}rzung des CASII Elements zeigte keinen Effekt auf die Pol-Verpackung und den Vektortransfer. Das Einf{\"u}gen eines zus{\"a}tzlichen zentralen Polypurintraktes f{\"u}hrte jedoch zur signifikanten Erh{\"o}hung der Transduktionseffizienz von FV Vektoren. Diese Ergebnisse f{\"u}hrten zur Entwicklung eines neuen foamyviralen Vektors (pTW01), der ca. 850nt k{\"u}rzer ist als die fr{\"u}her etablierten FV Vektoren, aber immer noch die gleiche Transduktionseffizienz auf Fibroblasten und humanen Stammzellen zeigt. Dieser Vektor mit einer h{\"o}heren Verpackungskapazit{\"a}t und Sicherheit, eignet sich hervorragend f{\"u}r den Einsatz in gentherapeutischen Studien. Zus{\"a}tzlich konnte gezeigt werden, dass eine heterologe Verpackung zwischen zwei unterschiedlichen Foamyviren (PFV und SFVmac) zu einem geringen Prozentsatz stattfindet. Als erster Schritt in der Entwickung eines neues Systems f{\"u}r eine einfache und kosteng{\"u}nstige Vektorvirusproduktion wurde gezeigt, dass die Expression der foamyviralen Gag, Pol und Env Proteine in Saccharomyces cerevisiae stattfinden kann.},
  subject      = {Gentheraphie},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nowrouzi2007,
  author    = {Nowrouzi, Ali},
  title     = {Molekulare Untersuchungen zur Integration von Foamyviren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25030},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Die Integration der viralen DNA in die des Wirtsgenoms ist ein essentieller Schritt im Lebenszyklus der Retroviren. Das wissenschaftliche Interesse an der Analyse von retroviralen Integrationsmustern ist, vor allem in Hinblick auf die Anwendung von retroviral basierten Vektoren in der somatischen Gentherapie, neu angefacht worden. Entgegen der Annahme, dass die retrovirale Integration dem Zufallsprinzip folgend stattfindet, konnten in den letzten Jahren f{\"u}r verschiedene Genera der Retroviren virusspezifische Integrationsmuster enth{\"u}llt werden, die auf eine Bevorzugung von bestimmten chromosomalen Regionen hindeuten, deren Mechanismen noch nicht ausreichend gekl{\"a}rt sind. F{\"u}r die Sicherheit von therapeutisch anwendbaren Vektoren ist die Analyse von retroviralen Intgerationsmuster daher unerl{\"a}sslich geworden. Foamyvirus (FV)-basierte Vektoren besitzen ein großes Potential, in der somatischen Gentheraphie ihre Anwendung zu finden, so dass eine Analyse ihrer Integrationsmuster im humanen Genom erforderlich ist. Hierf{\"u}r wurden humane 293-Zellen mit FV-basierten Vektoren transduziert und mittels inverser PCR 628 FV-Integrationsstellen kloniert, die zur Analyse von verschieden Aspekten des foamyviralen Integrationsmusters im humanen Genom lokalisiert wurden. Als Vergleich und als Kontrolle wurden 141 Murine Leuk{\"a}mie Virus-(MLV)- und 87 Humane Immundefiziens Virus-(HIV)-Integrationsstellen ebenfalls kloniert und analysiert. Im Vergleich zu HIV, welches die Integration in Gene bevorzugt, und MLV, welches eine starke Pr{\"a}ferenz zur Integration in regulatorische Bereiche in der N{\"a}he von Transkriptionsstartstellen (TSS) von Genen besitzt, konnten mit den hier ermittelten FV-Daten weder Pr{\"a}ferenzen zur Integration in Gene, noch starke Pr{\"a}ferenzen f{\"u}r regulatorische Bereiche beobachtet werden. Eine leichte Bevorzugung zur Integration in der N{\"a}he der TSS war zu erkennen, die allerdings deutlich schw{\"a}cher ausfiel als bei MLV. Weiterhin wurden bei der Betrachtung der Basenzusammensetzungen in der Umgebung der FV-Integrationsstellen statistisch signifikante Pr{\"a}ferenzen f{\"u}r bestimmte Basen an bestimmten Positionen beobachtet, die ein schwaches Palindrom bildeten, dessen Symmetrieachse sich im Zentrum der nach der Integration duplizierten zellul{\"a}ren Sequenz sich befand. Eine aktive Teilnahme von mit der viralen Integrase (IN) interagierenden zellul{\"a}ren Proteinen an der retroviralen Integrationsreaktion in vivo und an der Wahl der retroviralen Integrationsstellen ist sehr wahrscheinlich. Solche mit der IN interagierende zellul{\"a}re Proteine sind f{\"u}r FV noch unbekannt, so dass hierf{\"u}r ein experimentelles Testsystem etabliert wurde. Mit Hilfe von humanen Zellen, welche mittels retroviralem Gentransfer stabil C-terminal mit einem FLAG-Peptid fusionierte FV IN-Proteine expremierten, wurden in Pull-down-Experimenten und Maldi-Tof-Massenspektrometrie zwei zellul{\"a}re Proteine (NF90 und ADAR1) identifiziert, welche mit dem FV IN-Protein interagieren und aufgrund ihrer Spezifit{\"a}ten potentzielle Kofaktoren der foamyviralen Integration darstellen k{\"o}nnten. Eine RNAi-basierte Runterregulierung der Expression beider Proteine konnte, aufgrund der essentiellen Rolle beider Proteine an der Regulation der Zellteilung, keine experimentellen Daten liefern, die eine Analyse {\"u}ber die Funktion beider Proteine an der Integrationsreaktion von FV zulassen. Die Funktion beider Proteine muss in biochemischen Versuchen noch evaluiert werden und k{\"o}nnte einen interessanten Einblick in die Wechselwirkungen von FV mit ihrem Wirt liefern. Neben der Identifikation der zwei mit der IN interagierenden zellul{\"a}ren Proteine zeigen die hier pr{\"a}sentierten Daten zusammenfassend, dass das Integrationsmuster der FV sich von MLV und HIV-1 unterscheidet und nahezu dem Zufallsprinzip folgt. Aufgrund der im Vergleich zu MLV deutlich schw{\"a}cheren Pr{\"a}ferenz zur Integration in der N{\"a}he von regulatorischen Bereichen und der im Vergleich von HIV-1 {\"u}berhaupt nicht vorhandene Bevorzugung zur Integration in Gene stellen FV-basierte Vektoren interessante alternative Vektorsysteme f{\"u}r die somatische Gentheraphie dar.},
  subject      = {Retroviren},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Peters2006,
  author    = {Peters, Katrin},
  title     = {Mechanismus der Polymerase-Inkorporation in foamyvirale Partikel},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17690},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {In allen Retroviren, mit Ausnahme der Foamyviren (FV), wird das Pol-Protein als Gag-Pol-Fusionsprotein exprimiert. Dieser Mechanismus sichert die Inkorporation von Pol in das virale Partikel. FV unterscheiden sich in vielen Merkmalen von den Orthoretroviren, unter anderem wird das Pol-Protein von einer eigenen gespleißten mRNA translatiert. Diese von Gag unabh{\"a}ngige Expression f{\"u}hrt zu der Frage nach dem Mechanismus der Pol-Inkorporation in foamyvirale Partikel. Unter Nutzung eines transienten FV-Vektor Transfektionssystems, das auf der Kotransfektion von vier separaten Expressionseinheiten zur Produktion von Gag, Pol, Env und einer Vektor-RNA beruht, konnte gezeigt werden, daß (pr{\"a})genomische RNA f{\"u}r die effiziente Partikelinkorporation von Pol notwendig ist. Protein-Protein-Interaktionen zwischen Pol und Gag sind deshalb nicht ausreichend f{\"u}r die Bildung vollst{\"a}ndiger Viruspartikel. Im n{\"a}chsten Schritt wurde untersucht, ob es m{\"o}glich ist spezifische Sequenzen in der Virus-RNA zu identifizieren, die f{\"u}r die Inkorporation des Pol-Proteins essentiell sind. Empririsch wurden bereits zwei cis-aktive Sequenzen (CAS) identifiziert, die, zusammen mit den long terminal repeats (LTR) und benachbarten Sequenzen f{\"u}r die reverse Transkription und Integration, ausreichend f{\"u}r effizienten FV-Vektortransfer sind. Daher m{\"u}ssen RNA-Elemente, die f{\"u}r die Verpackung des Pol-Proteins n{\"o}tig sind, in diesen beiden CAS liegen. Durch das Einf{\"u}hren von Deletionen und anschließender Analyse der Proteinzusammensetzung und des RNA-Gehaltes von Viruspartikeln, wurden die f{\"u}r die Pol-Inkorporation essentiellen RNA-Sequenzen identifiziert. In dieser Arbeit konnten zwei RNA-Sequenzelemente definiert werden, die f{\"u}r die Partikelinkorporation des Pol-Proteins notwendig sind, diese wurden PES (Pol encapsidation sequences) genannt. Keines der beiden Sequenzelemente hat einen signifikanten Einfluß auf die Verpackung der Vektor-RNA, wohingegen bereits die Deletion einer der PES zu einer signifikanten Reduktion der Pol-Verpackung f{\"u}hrt. Eine PES, die m{\"o}glicherweise nur 30 nt umfaßt, liegt unmittelbar 5' der PBS (Nukleotide 318-345, relativ zu PFV Transkriptionsstart) und die zweite PES mit einer wahrscheinlichen L{\"a}nge von 370 nt liegt in der 3' Region des pol-Gens (Nukleotide 4980-5351). Diese Ergebnisse f{\"u}hren zu einem Model, in dem die (pr{\"a})genomische RNA von FV als eine Art Br{\"u}ckenmolek{\"u}l zwischen Gag und Pol fungiert. Die RNA interagiert auf der einen Seite {\"u}ber die PES mit Pol und auf der anderen Seite mit Gag {\"u}ber die GRI-Box im carboxyterminalen Bereich des Proteins und vermittelt so die Inkorporation des Pol-Proteins in das Gag-Kapsid. Weiterhin wurden die Voraussetzungen auf Proteinebene f{\"u}r die Verpackung des Pol-Proteins untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, daß nur das Pol-Vorl{\"a}uferprotein und weder die einzelne Reverse Transkriptase- noch die Integrase-Untereinheit in das foamyvirale Partikel verpackt wird. Die enzymatischen Aktivit{\"a}ten der Protease, der Reversen Transkriptase oder der Integrase des Pol-Proteins sind f{\"u}r die Verpackung jedoch nicht essentiell.},
  subject      = {Spumaviren},
  language  = {de}
}