@phdthesis{Prager2024,
  author    = {Prager, Lisa},
  title     = {Spatiotemporale Entwicklung der Immunantwort nach Pneumovirus-Infektion},
  doi       = {10.25972/OPUS-17988},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-179885},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2024},
  abstract  = {Das humane Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) gilt als wichtiger Krankheitserreger f{\"u}r S{\"a}uglinge und Kleinkinder sowie f{\"u}r {\"a}ltere Personen und immunsupprimierte Patienten. Krankheitssymptome und teils schwerwiegende Verl{\"a}ufe werden dabei eher einer Immunpathogenese zugeschrieben als der Virusvermehrung selbst. Aus Ermangelung eines ad{\"a}quaten Tiermodells wird h{\"a}ufig das RSV-verwandte Pneumonievirus der Maus (PVM) als Ersatzmodell f{\"u}r schwere Pneumovirusinfektionen verwendet. In dieser Dissertation wurde zum einen die spatiotemporale Rekrutierung von zellul{\"a}ren Komponenten der angeborenen und adaptiven Immunantwort im Verh{\"a}ltnis zum Verlauf einer PVM-Infektion in immunkompetenten und immunsupprimierten Wirten untersucht. Zum anderen wurde die Pathogenese einer Pneumovirusinfektion anhand des PVM-Modells in Mauslinien mit definierten Immundefizienzen analysiert. Wie bereits in einer fr{\"u}heren Untersuchung ermittelt, korrelierte die Rekrutierung von CD8+ T-Lymphozyten mit der Viruseliminierung (Frey et al., 2008). B-Lymphozyten wurden aktiv in das Lungengewebe PVM infizierter C57BL/6-M{\"a}use rekrutiert, wobei sie perivaskul{\"a}re und peribronchiale Foki, die ebenfalls CD4+ T-Zellen enthielten, bildeten. Dies k{\"o}nnte auf die Bildung terti{\"a}rer lymphoider Gewebe hindeuten. Die Rekrutierung von Zellen der angeborenen Immunantwort (NK-Zellen, neutrophile Granulozyten) geschah parallel bzw. verz{\"o}gert zur Virusvermehrung und damit eher sp{\"a}t w{\"a}hrend der Infektion. Die Rekrutierung von eosinophilen Granulozyten erfolgte erst in der Eliminationsphase der PVM-Infektion zusammen mit CD4+-T-Zellen. Zus{\"a}tzlich wurde ermittelt, dass Alveolarmakrophagen (AMΦ) in vivo mit PVM infiziert und dabei transient depletiert wurden. Die Depletion der AMΦ schien dabei nicht durch Lymphozytenpopulationen zu erfolgen. Die Charakterisierung der PVM-Infektion bei M{\"a}usen mit definierten Immundefizienzen ergab, dass B-Lymphozyten zur partiellen Viruskontrolle in T-Zell-defizienten M{\"a}usen beitragen und dadurch zur Protektion vor letalen Verl{\"a}ufen bei diesen M{\"a}usen f{\"u}hren. Die Letalit{\"a}t bei diesen M{\"a}usen, insbesondere in Abwesenheit von funktionellen B-Zellen, war mit Kontrollverlust {\"u}ber die Virusvermehrung assoziiert. B-Lymphozyten 2 wurden effizient in das infizierte Lungengewebe von T-Zell-defizienten M{\"a}usen rekrutiert. Das Serum T-Zell-defizienter M{\"a}use wies eine PVM-neutralisierende Aktivit{\"a}t auf, die mit dem Erscheinen PVM-spezifischer IgM-Antik{\"o}rper, T-Zell-unabh{\"a}ngig synthetisiert, korrelierte. IgG-Antik{\"o}rper waren jedoch zu diesen Zeitpunkten (14 d.p.i.) nicht nachweisbar. Dies wurde m{\"o}glicherweise durch unvollst{\"a}ndigen oder verz{\"o}gerten Reifungsprozess von B-Lymphozyten in T-Zell-defizienten M{\"a}usen reflektiert, da verschiedene Antik{\"o}rperklassen, wie IgM- und IgG-Antik{\"o}rper zeitgleich exprimiert wurden. Eine hohe Heterogenit{\"a}t bzgl. der klinischen Symptome und dem Ausgang der Infektion schien außerdem ein Kennzeichen von PVM-Infektionen unter bestimmten Immundefizienzen zu sein. Der adoptive B-Zell-Transfer in B6.Rag1-/--M{\"a}use ver{\"a}ndert die Krankheitsverl{\"a}ufe nach PVM-Infektion, da einige B-Zell-transplantierte M{\"a}use ohne klinische Symptome zu zeigen {\"u}berlebten und andere zwar Gewicht verloren und die Versuchsabbruchkriterien erreichten, aber die Heterogenit{\"a}t der Krankheitsverl{\"a}ufe reduziert war. Adoptiv transferierte B-Lymphozyten wurden außerdem in lymphatische Organe und in infiziertes Lungengewebe rekrutiert und waren in der Lage zu Plasmazellen zu reifen. Es gibt somit erste Indizien, dass B-Zellen zu einem Schutz bei einer akuten PVM-Infektion beitragen.},
  subject      = {RS-Virus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gotthard2023,
  author    = {Gotthard, Hannes},
  title     = {Targeting Colorectal Cancer Stem Cells with Hemibodies},
  doi       = {10.25972/OPUS-30309},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-303090},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2023},
  abstract  = {The cancer stem cell hypothesis is a cancer development model which elicited great interest in the last decades stating that cancer heterogeneity arises from a stem cell through asymmetrical division. The Cancer Stem Cell subset is described as the only population to be tumorigenic and having the potential to renew. Conventional therapy often fails to eradicate CSC resulting in tumor relapse. Consequently, it is of great inter-est to eliminate this subset of cells to provide the best patient outcome. In the last years several approaches to target CSC were developed, one of them being immunotherapeu-tic targeting with antibodies. Since markers associated with CSC are also expressed on normal stem cells or healthy adjacent tissue in colorectal cancer, dual targeting strate-gies are preferred over targeting only a single antigen. Subsequently, the idea of dual targeting two CSC markers in parallel by a newly developed split T cell-engaging anti-body format termed as Hemibodies emerged. In a preliminary single cell RNA sequenc-ing analysis of colorectal cancer cells CD133, CD24, CD166 and CEA were identified as suitable targets for the combinatorial targeting strategy. Therefore, this study focused on trispecific and trivalent Hemibodies comprising a split binding moiety against CD3 and a binding moiety against either CD133, CD24, CD166 or CEA to overcome the occurrence of resistance and to efficiently eradicate all tumor cells including the CSC compartment. The study showed that the Hemibody combinations CD133xCD24, CD133xCD166 and CD133xCEA are able to eliminate double positive CHO cells with high efficacy while having a high specificity indicated by no killing of single antigen positive cells. A thera-peutic window ranging between one to two log levels could be achieved for all combina-tions mentioned above. The combinations CD133xCD24 and CD133xCD166 further-more proved its efficacy and specificity on established colorectal cancer cell lines. Be-sides the evaluation of specificity and efficacy the already introduced 1st generation of Hemibodies could be improved into a 2nd generation Hemibody format with increased half-life, stability and production yield. In future experiments the applicability of above-mentioned Hemibodies will be proven on patient-derived micro tumors to also include variables like tumor microenvironment and infiltration.},
  subject      = {Monoklonaler bispezifischer Antik{\"o}rper},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Karch2022,
  author    = {Karch, Katharina},
  title     = {Mapping and Neutralization of Antibodies against Neurofascin, Contactin 1, Contactin associated protein 1 and Cortactin},
  doi       = {10.25972/OPUS-28022},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-280223},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Immune-mediated polyneuropathies like chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy or Guillain-Barr{\´e} syndrome are rare diseases of the peripheral nervous system. A subgroup of patients harbors autoantibodies against nodal or paranodal antigens, associated with a distinct phenotype and treatment response. In a part of patients with pathologic paranodal or nodal immunoreactivity the autoantigens remain difficult or impossible to determine owing to limitations of the used detection approach - usually ELISAs (enzyme-linked-immunosorbent-assays) - and incomplete knowledge of the possible autoantigens. Due to their high-throughput, low sample consumption and high sensitivity as well as the possibility to display many putative nodal and paranodal autoantigens simultaneously, peptide microarray-based approaches are prime candidates for the discovery of novel autoantigens, point-of-care diagnostics and, in addition, monitoring of pathologic autoimmune response. Current applications of peptide microarrays are however limited by high false-positive rates and the associated need for detailed follow-up studies and validation. Here, robust peptide microarray-based detection of antibodies and the efficient validation of binding signals by on-chip neutralization is demonstrated. First, autoantigens were displayed as overlapping peptide libraries in microarray format. Copies of the biochips were used for the fine mapping of antibody epitopes. Next, binding signals were validated by antibody neutralization in solution. Since neutralizing peptides are obtained in the process of microarray fabrications, neither throughput nor costs are significantly altered. Similar in-situ validation approaches could contribute to future autoantibody characterization and detection methods as well as to therapeutic research. Areas of application could be expanded to any autoimmune-mediated neurological disease as a long-term vision.},
  subject      = {Microarray},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Nelke2022,
  author    = {Nelke, Johannes},
  title     = {Entwicklung multi-funktioneller TNFRSF Rezeptorspezifischer Antik{\"o}rper-Fusionsproteine mit FcγR-unabh{\"a}ngiger Aktivit{\"a}t},
  doi       = {10.25972/OPUS-27985},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-279855},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2022},
  abstract  = {Antik{\"o}rper, die gegen eine klinisch relevante Gruppe von Rezeptoren innerhalb der Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Superfamilie (TNFRSF) gerichtet sind, darunter CD40 und CD95 (Fas/Apo-1), ben{\"o}tigen ebenfalls eine Bindung an Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγRs), um eine starke agonistische Wirkung zu entfalten. Diese FcγR-Abh{\"a}ngigkeit beruht weitgehend auf der bloßen zellul{\"a}ren Verankerung durch die Fc-Dom{\"a}ne des Antik{\"o}rpers und ben{\"o}tigt dabei kein FcγR-Signalling. Ziel dieser Doktorarbeit war es, das agonistische Potenzial von αCD40- und αCD95-Antik{\"o}rpern unabh{\"a}ngig von der Bindung an FcγRs durch die Verankerung an Myelomzellen zu entfalten. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Antik{\"o}rpervarianten (IgG1, IgG1-N297A, Fab2) gegen die TNFRSF-Mitglieder CD40 und CD95 genetisch mit einem einzelkettig kodierten B-Zell-aktivierenden Faktor (scBaff) Trimer als C-terminale myelom-spezifische Verankerungsdom{\"a}ne fusioniert, welche die Fc-Dom{\"a}ne-vermittelte FcγR-Bindung ersetzt. Diese bispezifischen Antik{\"o}rper-scBaff-Fusionsproteine wurden in Bindungsstudien und funktionellen Assays mit Tumorzelllinien untersucht, die einen oder mehrere der drei Baff-Rezeptoren exprimieren: BaffR, Transmembran-Aktivator und CAML-Interaktor (TACI) und B-Zell-Reifungsantigen (BCMA). Zellul{\"a}re Bindungsstudien zeigten, dass die Bindungseigenschaften der verschiedenen Dom{\"a}nen innerhalb der Antik{\"o}rper-scBaff-Fusionen gegen{\"u}ber der Zielantigene vollst{\"a}ndig intakt blieben. In Ko-Kulturversuchen von CD40- und CD95-responsiven Zellen mit BaffR-, BCMA- oder TACI-exprimierenden Verankerungszellen zeigten die Antik{\"o}rper-Fusionsproteine einen starken Agonismus, w{\"a}hrend in Ko-Kulturen mit Zellen ohne Expression von Baff-interagierenden Rezeptoren nur eine geringe Rezeptorstimulation beobachtet wurde. Die hier vorgestellten αCD40- und αCD95-Antik{\"o}rper-scBaff-Fusionsproteine zeigen also Myelom-spezifische Aktivit{\"a}t und versprechen im Vergleich zu herk{\"o}mmlichen CD40- und CD95-Agonisten geringere systemische Nebenwirkungen.},
  subject      = {Antigen CD40},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Rothaug2019,
  author    = {Rothaug, Moritz},
  title     = {Entwicklung neuer Antik{\"o}rper Fusionsproteine},
  doi       = {10.25972/OPUS-17704},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-177043},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Bei agonistischen Antik{\"o}rpern gegen Rezeptoren der TNFRSF reicht eine einfache Bindung der Antik{\"o}rper an die Rezeptoren oft nicht aus, um ein intrazellul{\"a}res Signal zu erzeugen. Es konnte herausgefunden werden, dass die Verankerung der Antik{\"o}rper {\"u}ber ihren Fc-Anteil an Fc gamma Rezeptoren ihre F{\"a}higkeit zur agonistischen Aktivierung der TNFR extrem steigert. Diese Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der Frage, ob die Verankerung {\"u}ber andere Rezeptoren m{\"o}glich ist. Mit scFv:CD70 als Beispiel, konnte diese Frage positiv beantwortet werden.},
  subject      = {Antik{\"o}rper-Fusionsproteine},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gutmann2019,
  author    = {Gutmann, Marcus},
  title     = {Functionalization of cells, extracellular matrix components and proteins for therapeutic application},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-170602},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Glycosylation is a biochemical process leading to the formation of glycoconjugates by linking glycans (carbohydrates) to proteins, lipids and various small molecules. The glycans are formed by one or more monosaccharides that are covalently attached, thus offering a broad variety depending on their composition, site of glycan linkage, length and ramification. This special nature provides an exceptional and fine tunable possibility in fields of information transfer, recognition, stability and pharmacokinetic. Due to their intra- and extracellular omnipresence, glycans fulfill an essential role in the regulation of different endogenous processes (e.g. hormone action, immune surveillance, inflammatory response) and act as a key element for maintenance of homeostasis. The strategy of metabolic glycoengineering enables the integration of structural similar but chemically modified monosaccharide building blocks into the natural given glycosylation pathways, thereby anchoring them in the carbohydrate architecture of de novo synthesized glycoconjugates. The available unnatural sugar molecules which are similar to endogenous sugar molecules show minimal perturbation in cell function and - based on their multitude functional groups - offer the potential of side directed coupling with a target substance/structure as well as the development of new biological properties. The chemical-enzymatic strategy of glycoengineering provides a valuable complement to genetic approaches. This thesis primarily focuses on potential fields of application for glycoengineering and its further use in clinic and research. The last section of this work outlines a genetic approach, using special Escherichia coli systems, to integrate chemically tunable amino acids into the biosynthetic pathway of proteins, enabling specific and site-directed coupling with target substances. With the genetic information of the methanogen archaea, Methanosarcina barkeri, the E. coli. system is able to insert a further amino acid, the pyrrolysine, at the ribosomal site during translation of the protein. The natural stop-codon UAG (amber codon) is used for this newly obtained proteinogenic amino acid. Chapter I describes two systems for the integration of chemically tunable monosaccharides and presents methods for characterizing these systems. Moreover, it gives a general overview of the structure as well as intended use of glycans and illustrates different glycosylation pathways. Furthermore, the strategy of metabolic glycoengineering is demonstrated. In this context, the structure of basic building blocks and the epimerization of monosaccharides during their metabolic fate are discussed. Chapter II translates the concept of metabolic glycoengineering to the extracellular network produced by fibroblasts. The incorporation of chemically modified sugar components in the matrix provides an innovative, elegant and biocompatible method for site-directed coupling of target substances. Resident cells, which are involved in the de novo synthesis of matrices, as well as isolated matrices were characterized and compared to unmodified resident cells and matrices. The natural capacity of the matrix can be extended by metabolic glycoengineering and enables the selective immobilization of a variety of therapeutic substances by combining enzymatic and bioorthogonal reaction strategies. This approach expands the natural ability of extracellular matrix (ECM), like the storage of specific growth factors and the recruitment of surface receptors along with synergistic effects of bound substances. By the selection of the cell type, the production of a wide range of different matrices is possible. Chapter III focuses on the target-oriented modification of cell surface membranes of living fibroblast and human embryonic kidney cells. Chemically modified monosaccharides are inserted by means of metabolic glycoengineering and are then presented on the cell surface. These monosaccharides can later be covalently coupled, by "strain promoted azide-alkyne cycloaddition" (SPAAC) and/or "copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition" (CuAAC), to the target substance. Due to the toxicity of the copper catalysator in the CuAAC, cytotoxicity analyses were conducted to determine the in vivo tolerable range for the use of CuAAC on living cell systems. Finally, the efficacy of both bioorthogonal reactions was compared. Chapter IV outlines two versatile carrier - spacer - payload delivery systems based on an enzymatic cleavable linker, triggered by disease associated protease. In the selection of carrier systems (i) polyethylene glycol (PEG), a well-studied, Food and Drug Administration approved substance and very common tool to increase the pharmacokinetic properties of therapeutic agents, was chosen as a carrier for non-targeting systems and (ii) Revacept, a human glycoprotein VI antibody, was chosen as a carrier for targeting systems. The protease sensitive cleavable linker was genetically inserted into the N-terminal region of fibroblast growth factor 2 (FGF-2) without jeopardizing protein activity. By exchanging the protease sensitive sequence or the therapeutic payload, both systems represent a promising and adaptable approach for establishing therapeutic systems with bioresponsive release, tailored to pre-existing conditions. In summary, by site-specific functionalization of various delivery platforms, this thesis establishes an essential cornerstone for promising strategies advancing clinical application. The outlined platforms ensure high flexibility due to exchanging single or multiple elements of the system, individually tailoring them to the respective disease or target site.},
  subject      = {Glykosylierung},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Bersi2017,
  author    = {Bersi, Heidi},
  title     = {Etablierung eines 3D in vitro Blutgef{\"a}ß-/Gewebemodells zur Testung spezifischer Therapeutika zur Leuk{\"a}miebehandlung},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-152506},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {In Deutschland erkranken j{\"a}hrlich etwa 500.000 Menschen an Krebs, wovon circa 12.000 die Diagnose „Leuk{\"a}mie" gestellt bekommen [1]. Unter den Leuk{\"a}mien weist die akute myeloische Leuk{\"a}mie (AML) die ung{\"u}nstigste Prognose auf, sodass hier erheblicher Forschungsbedarf besteht. Zus{\"a}tzlich schnitten viele potentielle Therapeutika, die sich in bisherigen pr{\"a}klinischen Testsystemen als vielversprechend erwiesen haben, in klinischen Studien schlecht ab [8]. Ziel dieser Arbeit war daher die Etablierung eines 3D in vitro Blutgef{\"a}ß-/Gewebemodells als verbessertes pr{\"a}klinisches System zur Testung von Therapeutika, die zur erfolgreichen Behandlung von Leuk{\"a}mien beitragen sollen. Das 3D Blutgef{\"a}ßmodell bestand aus humanen prim{\"a}ren Endothelzellen, welche als Monolayer auf der Serosaseite einer dezellularisierten, porzinen, intestinalen Kollagenmatrix (SIS-Ser) wuchsen. Nach 14-t{\"a}giger Zellkultur wurden dem Versuchsansatz entsprechend nichtadh{\"a}rente THP-1 Zellen (AML-M5-Zelllinie) und Tipifarnib oder entsprechende Kontrolll{\"o}sungen beziehungsweise bimolekulare Antik{\"o}rperkonstrukte mit PBMCs als Effektorzellen hinzupipettiert. Nach 5-t{\"a}giger Inkubation mit Tipifarnib beziehungsweise 24-st{\"u}ndiger Behandlung mit Antik{\"o}rperkonstrukten wurde der therapiebedingte Anstieg der Apoptoserate in den malignen THP-1 Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse der Modell{\"u}berst{\"a}nde ermittelt. Zum Ausschluss verbliebener und durchflusszytometrisch zu analysierender Zellen wurde, stellvertretend f{\"u}r alle Suspensionszellen, eine Anti-CD13/DAB-F{\"a}rbung durchgef{\"u}hrt, welche negativ ausfiel. M{\"o}gliche Kollateralsch{\"a}den am Endothel wurden mittels histologischen F{\"a}rbemethoden an Gewebeparaffinschnitten untersucht. In der Durchflusszytometrie zeigte Tipifarnib sowohl im 2D als auch im 3D Modell {\"a}quivalente, dosisabh{\"a}ngige und antileuk{\"a}mische Auswirkungen auf die THP-1 Zellen. Bei Applikation der Antik{\"o}rperkonstrukte ließ lediglich die Kombination beider Hemibodies signifikante Effekte auf die THP-1 Zellen erkennen. Dabei zeigten sich bei konstanten Konzentrationen der Antik{\"o}rperkonstrukte im 3D Modell deutlich h{\"o}here Apoptoseraten (58\%) als im 2D Modell (38\%). Stellt man Vergleiche von Tipifarnib mit den T-Zell-rekrutierenden Antik{\"o}rperkonstrukten an, so ließen sich im 2D Modell {\"a}hnliche Apoptoseraten in den THP-1 Zellen erzielen (jeweils 38\% bei Anwendung von 500 nM Tipifarnib). In den 3D Modellen erzielten jedoch die niedriger konzentrierten Antik{\"o}rperkonstrukte bei k{\"u}rzerer Inkubationsdauer eine noch h{\"o}here spezifische Apoptoserate in den THP-1 Zellen (im Mittel 58\%) als 500 nM Tipifarnib (mittlere Apoptoserate 40\%). Bez{\"u}glich der Nebenwirkungen ließ sich im 3D Modell nach Applikation von Antik{\"o}rperkonstrukten kein wesentlicher Einfluss auf das Endothel erkennen, w{\"a}hrend Tipifarnib/DMSO als auch die mit DMSO versetzten Kontrolll{\"o}sungen zu einer dosisabh{\"a}nigen Destruktion des urspr{\"u}nglichen Endothelzellmonolayers f{\"u}hrten. Damit stellt die hier beschriebene, hoch spezifische, Hemibody-vermittelte Immuntherapie einen vielversprechenden Ansatz f{\"u}r zuk{\"u}nftige onkologische Therapien dar. Mithilfe des etablierten humanen 3D in vitro Modells konnte im Vergleich zur konventionellen Zellkultur eine nat{\"u}rlichere Mikroumgebung f{\"u}r Zellen geschaffen und die Auswirkungen der Testsubstanzen sowohl auf maligne Zellen, als auch auf die Gef{\"a}ßstrukturen untersucht werden.},
  subject      = {Tissue Engineering},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kums2017,
  author    = {Kums, Juliane},
  title     = {Entwicklung und Charakterisierung von \(Gaussia\) \(princeps\) Luziferase-Antik{\"o}rper-Fusionsproteinen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-146777},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2017},
  abstract  = {Antik{\"o}rper, die Oberfl{\"a}chenantigene erkennen, sind sowohl in der Diagnostik als auch in der Therapie verschiedener Erkrankungen von enormer Bedeutung. Damit Antik{\"o}rper in diesen Bereichen eingesetzt werden k{\"o}nnen, ist es sehr wichtig, dass die Interaktion eines Antik{\"o}rpers oder auch eines Antik{\"o}rperkonjugats mit seinem Antigen oder Fc-Rezeptoren ausreichend charakterisiert wird. Hierf{\"u}r werden meist zellfreie Verfahren angewandt, wie die isotherme Titrationskalorimetrie oder die Oberfl{\"a}chenplasmonenresonanzspektroskopie. Diese unterliegen verschiedenen Limitationen, beispielsweise der Verf{\"u}gbarkeit von rekombinantem Antigen. Vor allem aber werden zellul{\"a}re Einfl{\"u}sse, die die Bindungseigenschaften der Antik{\"o}rper beeinflussen, nicht ber{\"u}cksichtigt. Aber auch die derzeit angewandten Verfahren f{\"u}r zellul{\"a}re Bindungsstudien k{\"o}nnen problematisch sein, da sie meist auf Antik{\"o}rpern basieren, die biochemisch markiert worden sind, was zu funktionellen Beeintr{\"a}chtigungen f{\"u}hren kann. Außerdem zeigen solche Antik{\"o}rper h{\"a}ufig keine einheitliche St{\"o}chiometrie der jeweiligen Reporterstoffe und die Reproduzierbarkeit des Markierungsverfahrens ist in den meisten F{\"a}llen nicht gew{\"a}hrleistet. Positionsspezifische Markierungen sind jedoch vergleichsweise sehr aufwendig. Um die genannten Probleme zu umgehen, wurden in der vorliegenden Arbeit am Beispiel des Fn14-spezifischen Antik{\"o}rpers 18D1 Antik{\"o}rper-Fusionsproteine hergestellt und charakterisiert, die an verschiedenen Positionen genetisch mit der Gaussia princeps Luziferase (GpL) fusioniert worden sind. Dabei zeigte sich, dass die Positionierung der Luziferase am C-Terminus der leichten Kette des Antik{\"o}rpers (GpL(CT-LC)) die Bindungseigenschaften der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine an Fn14 und an die verschiedenen Fcγ-Rezeptoren (FcγR) nicht oder nur in geringem Umfang beeinflusst. Auch die agonistische Aktivit{\"a}t der GpL-18D1-IgG1-Fusionsproteine, welche abh{\"a}ngig ist von der Oligomerisierung {\"u}ber Protein G oder der FcγR-Bindung, wurde durch die GpL-Markierung nicht wesentlich beeinflusst. Diese Ergebnisse ließen sich am Bespiel von 18D1 ebenfalls auf die dimeren Antik{\"o}rper-Isotypen IgG2, mIgG1 und mIgG2A {\"u}bertragen. GpL-Fusionsproteine der Antik{\"o}rper E09-IgG1 (CD95-spezifisch), G28.5-IgG1 (CD40-spezifisch) und BHA10-IgG1 (LTβR-spezifisch) zeigten gleichfalls keine gravierenden Ver{\"a}nderungen der Bindungseigenschaften oder den funktionellen Eigenschaften, was f{\"u}r eine breite Anwendbarkeit von GpL-Antik{\"o}rper-Fusionsproteinen spricht. Zusammenfassend betrachtet zeigen die hier pr{\"a}sentierten Ergebnisse, dass die genetische Fusion der Gaussia princeps Luziferase an das C-terminale Ende der leichten Antik{\"o}rperkette eine sehr gute M{\"o}glichkeit darstellt, Antigen-Antik{\"o}rper-Interaktionen zu charakterisieren ohne dabei mit den Eigenschaften des Antik{\"o}rpers zu interferieren. Dabei besticht dieser Ansatz im Vergleich zu anderen g{\"a}ngigen Verfahren durch seine Reproduzierbarkeit, eine einfache Handhabung, geringe Kosten und eine extrem hohe Sensitivit{\"a}t. Außerdem k{\"o}nnte dieses Antik{\"o}rper-Fusionsproteinformat zuk{\"u}nftig auch in vielen Bereichen als Tracer eingesetzt werden mit dem Vorteil, dass keinerlei Radioaktivit{\"a}t ben{\"o}tigt werden w{\"u}rde.},
  subject      = {Luciferasen},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klein2015,
  author    = {Klein, Dennis},
  title     = {The pathogenic role of endogenous antibodies in a mouse model for Charcot-Marie-Tooth 1B neuropathy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-121941},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2015},
  abstract  = {Charcot-Marie-Tooth (CMT) type 1 neuropathies are a genetically heterogeneous group of non-treatable inherited disorders affecting the peripheral nervous system that lead to sensory and motor dysfunction. Secondary low grade inflammation, implicating the innate and adaptive immune system, could previously be identified as a substantial disease modifier in two mouse models for CMT1, CMT1B and 1X, respectively. However, the exact mechanism how the adaptive immune system contributes to disease pathogenesis is not completely understood. Based on observations that the accumulation of endogenous antibodies to myelin components is important for rapid myelin clearance after nerve injury during Wallerian degeneration, a possibly similar mechanism was considered for endogenous antibodies as disease amplifier in mice heterozygously deficient for P0 (P0het), mimicking some typical features of CMT1B. In this study an increased antibody deposition was detected in the affected peripheral nerves of P0het myelin mutant mice. By crossbreeding P0het mutants with mice specifically lacking B-lymphocytes, and therefore antibodies (JHD-/-), a decline of endoneurial macrophages together with a substantially ameliorated demyelination could be demonstrated in 6-month-old mutant mice. Moreover, reconstitution with murine IgGs reverted the neuropathic phenotype, substantiating that endogenous antibodies are potentially pathogenic at this early stage of disease. Unexpectedly, in 12-months-old P0het mutants, JHD deficiency resulted in disease aggravation accompanied by an increased inflammatory reaction and M2-polarized macrophage response. These observations suggest that in a mouse model for CMT1B, the lack of endogenous antibodies has a dichotomous effect: ameliorating early macrophage-mediated demyelination, as opposed to increasing inflammatory reactions leading to disease aggravation at older ages.},
  subject      = {Maus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Huang2013,
  author    = {Huang, Ting},
  title     = {Vaccinia Virus-mediated Therapy of Solid Tumor Xenografts: Intra-tumoral Delivery of Therapeutic Antibodies},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-91327},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Over the past 30 years, much effort and financial support have been invested in the fight against cancer, yet cancer still represents the leading cause of death in the world. Conventional therapies for treatment of cancer are predominantly directed against tumor cells. Recently however, new treatments options have paid more attention to exploiting the advantage of targeting the tumor stroma instead. Vaccinia virus (VACV) has played an important role in human medicine since the 18th century as a vaccination against smallpox. In our laboratory, the recombinant, replication-competent vaccinia virus, GLV-1h68, was shown to enter, colonize and destroy cancer cells both in cell culture, and in vivo, in xenograft models (Zhang, Yu et al. 2007). In addition, combined therapy of GLV-1h68 and anti-VEGF immunotherapy significantly enhanced antitumor therapy in vivo (Frentzen, Yu et al. 2009). In this study, we constructed several new recombinant VACVs carrying genes encoding different antibodies against fibroblast activation protein (FAP) in stroma (GLV-1h282), nanobody against the extracellular domain of epidermal growth factor receptor (EGFR, GLV-1h442) or antibodies targeting both vascular endothelial growth factor (VEGF) and EGFR (GLV-1h444) or targeting both VEGF and FAP (GLV-1h446). The expression of the recombinant proteins was first verified using protein analytical methods, SDS-gel electrophoresis, Western blot analysis, immunoprecipitation (IP) assays and ELISA assays. The proteins were detected after infection of the cells with the different VACVs and the recombinant proteins purified by affinity adsorption. The purified antibodies were shown to specifically bind to their respective antigens. Secondly, the infection and replication capability of all the virus strains was analyzed in cell culture using several human tumor cell lines (A549, FaDu or DU145), revealing that all the new recombinant VACVs were able to infect cancer cells with comparable efficiency to the parental viruses from which they were derived. Thirdly, the antitumor efficacy of the new recombinant VACVs was evaluated in vivo using several human cancer xenograft models in mice. In A549 and DU145 xenografts, the new recombinant VACVs exhibited an enhanced therapeutic efficacy compared to GLV-1h68 with no change in toxicity in mice. In the FaDu xenograft, treatment with GLV-1h282 (anti-FAP) significantly slowed down the speed of tumor growth compared to GLV-1h68. Additionally, treatment with the recombinant VACVs expressed the various antibodies achieved comparable or superior therapeutic effects compared to treatment with a combination of GLV-1h68 and the commercial therapeutic antibodies, Avastin, Erbitux or both. Next, the virus distribution in tumors and organs of treated mice was evaluated. For most of the viruses, the virus titer in tumors was not signficantly diffferent than GLV-1h68. However, for animals treated with GLV-1h282, the virus titer in tumors was significantly higher than with GLV-1h68. This may be the reason for enhanced antitumor efficacy of GLV-1h282 in vivo. Lastly, the underlying mechanisms of therapeutic antibody-enhanced antitumor effects were investigated by immunohistochemistry. Blood vessels density and cell proliferation in tumors were suppressed after treatment with the antibody-encoded VACVs. The results indicated that the suppression of angiogenesis or cell proliferation in tumors may cause the observed therapeutic effect. In conclusion, the results of the studies presented here support the hypothesis that the treatment of solid tumors with a combination of oncolytic virotherapy and immunotherapy has an additive effect over each treatment alone. Moreover, expression of the immunotherapeutic antibody by the oncolytic VACV locally in the tumor enhances the antitumor effect over systemic treatment with the same antibody. Combined, these results indicate that therapy with oncolytic VACVs expressing-therapeutic antibodies may be a promising approach for the treatment of cancer.},
  subject      = {Vaccinia-Virus},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Trebing2014,
  author    = {Trebing, Johannes},
  title     = {CD70-abh{\"a}ngige und spezifische Aktivierung von TRAILR1 oder TRAILR2 durch scFv:CD70-TRAIL-Mutanten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-111592},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, den T-Zell-inhibierenden Effekt eines CD70-blockierenden Antik{\"o}rpers mit einer Fc-unabh{\"a}ngigen Zelltod-induzierenden Aktivit{\"a}t auf CD70-exprimierende Tumoren zu kombinieren. Dazu wurden Fusionsproteine hergestellt und untersucht, die aus einer CD70-bindenden scFv-Dom{\"a}ne sowie aus einer TRAIL-Dom{\"a}ne bestehen. Der CD70-spezifische monoklonale Antik{\"o}rper lαhCD70 sowie der beretis bekannte hCD70-spezifische Antik{\"o}rper 1F6 blockieren mit hoher Effizienz die CD27/CD70-Interaktion von CD70-exprimierenden Zelllinien (Mino, OVCAR-3, U-266) und inhibieren dadurch die Induktion der IL8-Produktion durch diese Zellen in kokultivierten HT1080-CD27-Zellen. IL8 wird durch den klassischen NFκB-Signalweg reguliert und ist f{\"u}r den pro-angiogenetischen Effekt von entscheidender Bedeutung (Abb. 2, 3). Mit Hilfe zellul{\"a}rer Gleichgewichtsbindungsstudien mit mono- und trimeren scFv:lαhCD70-GpL-Fusionsproteinen (Abb. 4) auf Mino- und OVCAR-3-Zellen konnte gezeigt werden, dass die Trimerisierung in beiden Zelllinien zu einer Steigerung der apparenten Affinit{\"a}t der scFv:lαhCD70-CD70 Interaktion f{\"u}hrt und damit einen Effekt auf die CD70-Belegung hat (Abb. 5). F{\"u}r die Konstruktion der Fusionsproteine wurde sowohl Wildtyp-TRAIL als auch TRAIL-Mutanten mit Pr{\"a}ferenz f{\"u}r den TRAILR1 oder TRAILR2 verwendet. Die TRAILR-Pr{\"a}ferenz der verwendeten TRAIL-Mutanten (wt, mutR1, mutR2) wurde nicht nur in zellul{\"a}ren GpL-Bindungsstudien (Abb. 7) sondern zus{\"a}tzlich auch in TRAILR Immobilisierungsexperimenten (Abb. 8) bewiesen. Hier zeigte sich, dass bei TRAILR1 keine Interaktion mit TRAILmutR2, so wie bei TRAILR2 keine signifikante Bindung mit TRAILmutR1 erfolgte. Nur der TRAIL-Wildtyp band signifikant an beide TRAIL-Todesrezeptoren. Vitalit{\"a}tsexperimente (Abb. 10) und Western-Blot Analysen der Caspase-Prozessierung (Abb. 11) best{\"a}tigten die starke TRAILR1- bzw. TRAILR2-Spezifit{\"a}t der TRAILmutR1- und TRAILmutR2-Varianten. Im Gegensatz zu den unvernetzten l{\"o}slichen TRAIL-Trimeren waren nur die quervernetzten TRAIL-TNC-Varianten in der Lage, eine signifikante Apoptose-Signalkaskade bei relativ geringen Konzentrationen zu induzieren. Die toxischen ED50-Konzentrationen der unoligomerisierten TRAIL-Formen lagen um einen Faktor 100 h{\"o}her als die der oligomerisierten Varianten. Zusammenfassend zeigten die ED50-Werte der Zytotoxizit{\"a}tsexperimente von M2-oligomerisierten zu -unoligomerisierten trimeren TRAIL-Varianten bei allen Fusionskonstrukten und Zelllinien eine eindeutige Verst{\"a}rkung der Apoptoseinduktion durch die M2-Quervernetzung. Bei Jurkat- und Mino-Zellen konnte gr{\"o}ßtenteils erst nach Oligomerisierung {\"u}berhaupt eine Bioaktivit{\"a}t bzw. eine Zelltodinduktion beobachtet werden. In OVCAR-3-Zellen zeigte sich eine 100-1000 fache apoptotische Verst{\"a}rkung durch die Oligomerisierung (Abb. 10). Weiterhin zeigten Zytotoxizit{\"a}tsexperimente, dass sich durch Bindung an hCD70 das Ausmaß der Toxizit{\"a}t der Fusionsproteine auf allen CD70-exprimierenden Zelllinien 10-100x verst{\"a}rkte (Abb. 15, 17). In {\"U}bereinstimmung mit der verst{\"a}rkten TRAIL-Todesrezeptor-Aktivierung durch die CD70-Bindung der scFv-TRAIL-Fusionsproteine, konnte durch eine CD70-Blockade die Caspase-8 Aktivierung und die Prozessierung von Caspase-3 signifikant unterbunden werden (Abb. 18). Die Trimerisierung des scFv:lαhCD70-Antik{\"o}rpers f{\"u}hrte zu keiner Apoptose und beeinflußte auch nicht die Aktivit{\"a}t von TRAIL (Abb. 19) was belegt, dass die beobachteten Effekte auf einer st{\"a}rkeren TRAIL-induzierten Apoptose nach CD70-Bindung der Konstrukte beruhen muss. Die Fusionsproteine beseitigen somit nachweislich einerseits das Problem der limitierenden Aktivit{\"a}t von l{\"o}slichem TRAIL {\"u}ber ihre Verankerung an CD70 (Abb. 15-20) und anderseits die potentielle unerw{\"u}nschte CD70-vermittelte protumorale CD27-Stimulation (Abb. 3). Dar{\"u}ber hinaus k{\"o}nnten die TRAILR-spezifischen TRAIL-Mutanten helfen, Nebeneffekte zu reduzieren, die prim{\"a}r durch den jeweils anderen TRAIL-Todesrezeptor vermittelt werden. Jedoch sind weiter Forschungen insbesondere in vivo Experimente notwendig, um Aussagen {\"u}ber Funktionalit{\"a}t, Halbwertszeiten, sowie Effektivit{\"a}t und Vertr{\"a}glichkeit treffen zu k{\"o}nnen.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Aumueller2014,
  author    = {Aum{\"u}ller, Ruth Inge},
  title     = {CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106813},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-gen{\"u}ber dem TNFL CD95L entdeckt (28 \%). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in ver{\"a}nderten Zellen Apoptose zu induzieren, w{\"a}hrend gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert l{\"o}sliches TRAIL haupts{\"a}chlich den Todesrezeptor TRAILR1, w{\"a}hrend membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivit{\"a}t l{\"o}slicher TNFL zu steigern. Hierzu z{\"a}hlen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molek{\"u}lanordnung {\"u}ber die TNC-Dom{\"a}ne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antik{\"o}rpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabh{\"a}ngigen Membranst{\"a}ndigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberfl{\"a}chenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die f{\"u}r die Apoptoseinduktion ben{\"o}tigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verst{\"a}rkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivit{\"a}t des monoklonalen Antik{\"o}rperfragments scFv:CD40 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Die Antik{\"o}rperdom{\"a}ne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung f{\"a}hig, sondern konnte zus{\"a}tzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der l{\"o}sliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberfl{\"a}chenimmobilisierung {\"u}ber Antigen-Antik{\"o}rper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizit{\"a}t {\"u}berf{\"u}hrt werden kann. Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit m{\"o}glich die selektive Toxizit{\"a}t von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivit{\"a}t effizient zu nutzen. Zus{\"a}tzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerw{\"u}nschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden k{\"o}nnen. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abh{\"a}ngig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen k{\"o}nnen in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgef{\"u}hrt werden.},
  subject      = {Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hartmann2014,
  author    = {Hartmann, Sonja},
  title     = {Relevance of antibodies targeting the beta1-adrenergic receptor for renal function},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-106285},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2014},
  abstract  = {Functionally active (conformational) autoantibodies directed against the β1-adrenergic receptor (β1-AR) are supposed to have a pathogenic relevance in human heart failure, particularly in idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). Prevalence of anti-β1-autoantibodies (anti-β1-aabs) in the healthy population is almost negligible, whereas it amounts to up to 30\% in heart failure patients with idiopathic DCM. As β1-ARs are not restricted to the heart and are also highly expressed in particular segments of the nephron, it is conceivable that such autoantibodies might also affect kidney function to some extent through the activation of renal β1-ARs. In the kidney, β1-ARs are highly abundant in the juxtaglomerular apparatus, the distal convoluted tubules, the collecting duct, and the renal arteries. However, the functional significance of β1-ARs at these particular sites along the nephron is poorly understood, as are the effects of conformational stimulating anti-β1-aabs on renal β1-ARs. From the available literature, it is well known that the β1-adrenergic system is involved in, e.g., the regulation of renin-secretion from juxtaglomerular cells. In addition, the β1-adrenergic system is thought to be involved in the regulation of the urine pH via type B-intercalated cells in the collecting duct. In contrast, the regulation of salt- and fluid-secretion in the medullary collecting duct appears to occur independently from the SNS. As a consequence, the present work aimed to unravel the potential pathophysiological links between renal function, alterations in the cardiovascular system, and circulating agonist-like anti- β1-abs. We analyzed possible renal effects of anti-β1-abs in a human-analogous rat model. After immunization with a GST-fusion protein containing the second extracellular loop (β1-ECII) of the human β1-AR, Lewis-rats develop functionally active, stimulating, conformational anti-β1-ECII-abs. Within the first 6 months, anti-β1-ECII-ab-positive animals develop a hypertensive phenotype, which after 9 months evolves into a DCM phenotype. In n=40 GST/ β1-ECII-immunized Lewis rats and n=40 age-matched, 0.9\% NaCl-injected control animals, we sequentially (i.e. at months 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 after start of immunization) analyzed the changes in renal function on a molecular, functional, and structural level. We could show that the presence of stimulating anti-β1-ECII-abs - even though having detrimental effects on the heart - has only a minor impact on kidney function and structure. Within the first 3 months after induction of anti-β1-ECII-abs, the levels and activity of renin were significantly increased in immunized compared to corresponding control animals, which was confirmed by experiments on isolated perfused kidneys, in which anti-β1-ECII-abs were able to directly induce the liberation of renin. However, within several weeks the initial anti-β1-ECII-ab-mediated RAAS activation was counter-regulated by auto-regulatory mechanisms activated in the kidney. Similarly, glomerular filtration rate (GFR) and renal blood flow (RBF) were initially decreased in the presence of the stimulating anti-β1-ECII-abs, but returned to control values within 3 months after immunization of the animals. Although expression of several pro-fibrotic markers was significantly up-regulated in anti-β1-ECII-ab-positive rats, no significant differences were noted on a histomorphological level with regard to the occurrence of renal fibrosis, glomerular damage, tubular damage, and perivascular fibrosis. Only a mild decrease in glomerular filtration function was observed in the kidneys of anti-β1-ECII-ab-positive animals from immunization-month 12 on, apparent by increased levels of urinary protein. Even though anti-β1-ECII-abs were able to induce mild changes in renal function, their effects were not strong enough to critically damage the kidneys in our rat-model. Differences between immunized anti-β1-ECII-ab-positive and corresponding control rats at later time-points (that is, from immunization-month 12 on) are most likely secondary to the progressive heart failure phenotype that immunized animals develop in the course of the experiment. The present study is the first to focus on the effects of stimulating anti-β1-ECII-abs on the kidney, and on the prevalence of these effects for the heart (referred to as cardio-renal crosstalk). Although our results were obtained in a rat model, they might contribute to better understand the situation in anti-β1-AR-aab-positive human patients. Following the results of our experiments, treatment of such patients should focus on direct and specific neutralization/elimination of stimulating anti-β1-ECII-aab or at least comprise therapeutic strategies that counteract the anti-β1-ECII-aab-effects on the heart by standard treatment for heart failure (i.e. ACE inhibitors, AT1-receptor blockers, and β-blockers) according to current guidelines.},
  subject      = {Nierenfunktion},
  language  = {en}
}
@article{UlrichsEcksteinKorsgrenetal.1994,
  author    = {Ulrichs, Karin and Eckstein, V. and Korsgren, O. and Tibell, A. and Groth, C. G. and M{\"u}ller-Ruchholtz, W.},
  title     = {Characterization of natural and induced human xenophile antibodies before and after transplantation of the fetal porcine endocrine pancreas},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-86985},
  year      = {1994},
  abstract  = {No abstract available.},
  subject      = {Bauspeicheldr{\"u}se},
  language  = {de}
}
@article{UlrichsEcksteinTibelletal.1994,
  author    = {Ulrichs, Karin and Eckstein, V. and Tibell, A. and Groth, C. G. and Korsgren, O. and M{\"u}ller-Ruchholtz, W. and Thiede, A.},
  title     = {Nat{\"u}rliche und induzierte xenoreaktive Antik{\"o}rper vor und nach klinischer Transplantation f{\"o}taler porziner Pankreasinselzellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72967},
  year      = {1994},
  abstract  = {No abstract available.},
  subject      = {Antik{\"o}rper},
  language  = {de}
}
@article{UlrichsMuellerRuchholtz1993,
  author    = {Ulrichs, Karin and M{\"u}ller-Ruchholtz, W.},
  title     = {Pharmakologische Beeinflussung nat{\"u}rlicher Antik{\"o}rper als Vorbedingung f{\"u}r die erfolgreiche Xenotransplantation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73216},
  year      = {1993},
  abstract  = {No abstract available.},
  subject      = {Heterotransplantation},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Banaszek2013,
  author    = {Banaszek, Agnes},
  title     = {Dual Antigen-Restricted Complementation of a Two-Part Trispecific Antibody for Targeted Immunotherapy of Blood Cancer},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-90174},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Cancer cells frequently escape from immune surveillance by down-regulating two important components of the immune defence: antigen-presenting MHC and costimulatory molecules. Therefore several novel anti-tumour compounds that aim to assist the immune system in recognising and fighting cancer are currently under development. Recombinant bispecific antibodies represent one group of such novel therapeutics. They target two different antigens and recruit cytotoxic effector cells to tumour cells. For cancer immunotherapy, bispecific T cell-engaging antibodies are already well characterised. These antibodies target a tumour-associated antigen and CD3ε, the constant molecule of the T cell receptor complex. On the one hand, this study presents the development of a bispecific antibody targeting CD3ε and the rhabdomyosarcoma-associated fetal acetylcholine receptor. On the other hand, it describes a novel two-part trispecific antibody format for the treatment of leukaemia and other haematological malignancies in the context of haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). For HSCT, an HLA-identical donor is preferred, but very rarely available. In an HLA-mismatched setting, the HLA disparity could be exploited for targeted cancer treatment. In the present study, a two-part trispecific HLA-A2 × CD45 × CD3 antibody was developed for potential cases in which the patient is HLA-A2-positive, but the donor is not. This holds true for about half the cases in Germany, since HLA-A2 is the most common HLA molecule found here. Combinatorial targeting of HLA-A2 and the leucocyte-common antigen CD45 allows for highly specific dual-antigen restricted tumour targeting. More precisely, two single-chain antibody constructs were developed: i) a single-chain variable fragment (scFv) specific for HLA-A2, and ii) a scFv against CD45, both linked to the VL and the VH domain of a CD3ε-specific antibody, respectively. It turned out that, after the concomitant binding of these constructs to the same HLA-A2- and CD45-expressing cell, the unpaired variable domains of a CD3ε-specific antibody assembled to a functional scFv. In a therapeutic situation, this assembly should exclusively occur on the recipient's blood cancer cells, leading to T cell-mediated cancer cell destruction. In this way, a relapse of disease might be prevented, and standard therapy (radiation and chemotherapy) might be omitted. For both approaches, the antibody constructs were periplasmically expressed in E. coli, purified via His tag, and biochemically characterised. Their binding to the respective targets was proven by flow cytometry. The stimulatory properties of the antibodies were assayed by measuring IL-2 release after incubation with T cells and antigen-expressing target cells. Both the bispecific antibody against rhabdomyosarcoma and the assembled trispecific antibody against blood cancer mediated T-cell activation in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations. For the trispecific antibody, this effect indeed proved to be dual antigen-restricted, as it could be blocked by prior incubation of either HLA-A2- or CD45-specific scFv and did not occur on single-positive (CD45+) or double-negative (HLA-A2- CD45-) target cells. Furthermore, antibodies from both approaches recruited T cells for tumour cell destruction in vitro.},
  subject      = {Immuntherapie},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Schlippverh:Woelfel2011,
  author    = {Schlipp [verh.: W{\"o}lfel], Angela},
  title     = {Characterization of anti-beta1-adrenoceptor antibodies with F{\"o}rster resonance energy transfer microscopy},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67162},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a "NDPK"-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data.},
  subject      = {Adrenerger Rezeptor},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Bruder2012,
  author    = {Bruder, Jessica},
  title     = {Antigenerkennung bei autoaggressiven Lymphozyten},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-73342},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes k{\"o}rpereigenes Gewebe angreift und zerst{\"o}rt. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antik{\"o}rper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose n{\"a}her untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entz{\"u}ndliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerst{\"o}rt. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in {\"a}hnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Fr{\"u}here Untersuchungen der Antigenspezifit{\"a}t dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausf{\"u}hrliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberfl{\"a}chen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantik{\"o}rpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antik{\"o}rper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und R{\"u}ckenmark an und zerst{\"o}ren sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinit{\"a}tsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden" (OKB) Antik{\"o}rper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifit{\"a}t von f{\"u}nf IgG OKB-Antik{\"o}rpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazellul{\"a}re Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukle{\"a}re Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivit{\"a}ten gegen intrazellul{\"a}re Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse k{\"o}nnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantik{\"o}rpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten.},
  subject      = {Multiple Sklerose},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kaiser2012,
  author    = {Kaiser, Fabian Marc Philipp},
  title     = {Analysis of Cross-Clade Neutralizing Antibodies against HIV-1 Env Induced by Immunofocusing},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-75494},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Despite intense research efforts, a safe and effective HIV-1/AIDS vaccine still remains far away. HIV-1 escapes the humoral immune response through various mechanisms and until now, only a few nAbs have been identified. A promising strategy to identify new epitopes that may elicit such nAbs is to dissect and analyze the humoral immune response of sera with broadly reactive nAbs. The identified epitopes recognized by these antibodies might then be incorporated into a vaccine to elicit similar nAbs and thus provide protection from HIV-1 infection. Using random peptide phage display libraries, the Ruprecht laboratory has identified the epitopes recognized by polyclonal antibodies of a rhesus monkey with high-titer, broadly reactive nAbs that had been induced after infection with a SHIV encoding env of a recently transmitted HIV-1 clade C. The laboratory analyzed phage peptide inserts for conformational and linear homology with computational assistance. Several of the identified peptides mimicked domains of the original HIV-1 clade Env, such as conformational V3 loop epitopes and the conserved linear region of the gp120 C-terminus. As part of this work, these mimotopes were analyzed for cross-reactivity with other sera obtained from rhesus monkeys with nAbs and antibody recognition was shown for several mimotopes, particularly those representing the V3 loop. In addition, these mimotopes were incorporated into a novel DNA prime/phage boost strategy to analyze the immunogenicity of such phage-displayed peptides. Mice were primed only once with HIV-1 clade C gp160 DNA and subsequently boosted with mixtures of recombinant phages. This strategy was designed to focus the humoral immune response on a few, selected Env epitopes (immunofocusing) and induced HIV-1 clade C gp160 binding antibodies and cross-clade nAbs. Furthermore, the C-terminus of gp120, a conserved HIV Env region, was linked to the induction of nAbs for the first time. The identification of such conserved antigens may lead to the development of a vaccine that is capable of inducing broadly reactive nAbs that might confer protection form HIV-1 infection.},
  subject      = {Antik{\"o}rper},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Bourdet2011,
  author    = {Bourdet, Patric},
  title     = {Entwicklung einer auf Antik{\"o}rpern basierten Therapie von chirurgischen Infektionen verursacht durch methicillinresistente und -sensible Staphylococcus aureus (MRSA und MSSA)},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-56199},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Staphylococcus aureus ist einer der h{\"a}ufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Diese grampositiven Bakterien verursachen neben harmlosen oberfl{\"a}chlichen Hautinfektionen auch lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika wird zuk{\"u}nftig wahrscheinlich nicht ausreichen, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine M{\"o}glichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antik{\"o}rpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. Ziel dieser Arbeit war es, zun{\"a}chst zwei Proteine IsaA und IsaB herzustellen, um diese Proteine f{\"u}r Immunisierungsstudien zu nutzen. Zun{\"a}chst wurde das gereinigte IsaA-Protein verwendet, um ein Kaninchen zu immunisieren. Mit den daraus gewonnenen Antik{\"o}rpern wurden dann erste Tierversuche begonnen, um die Bedingungen f{\"u}r den therapeutischen Einatz von gegen IsaA-gerichteten Antik{\"o}rpern zu ermitteln und die Wirksamkeit einer Antik{\"o}rper-Behandlung zu evaluieren. F{\"u}r die Herstellung der gew{\"u}nschten Proteine wurden die Gensequenzen zun{\"a}chst aus verschiedenen S. aureus-St{\"a}mmen mittels PCR amplifiziert und in den kommerziellen Expressionsvektor pQE30 kloniert. Die amplifizierte Gensequenz stammt aus den klinischen St{\"a}mmen 418 (IsaA) bzw. 134 (IsaB). Nach der Klonierung wurden geeignete Expressions- und Reinigungsstrategien entwickelt. Dabei wurden folgende Bedingungen als optimal f{\"u}r Wachstum und {\"U}berexpression herausgearbeitet: IsaA: Induktion der {\"U}berexpression mit 100 µM IPTG, 3 h Wachstum bei 37°C. IsaB: Induktion der {\"U}berexpression mit 100 µM IPTG, 4 h Wachstum bei 37°C. Es stellte sich auch heraus, dass IsaA zun{\"a}chst in nur unzureichender Quantit{\"a}t vorhanden bzw. exprimiert worden war. Die Vermutung, dass IsaA {\"u}berwiegend im Pellet in sogenannten Einschlussk{\"o}rpern (inclusion bodies) eingeschlossen war, erkl{\"a}rte dieses Ph{\"a}nomen. Das Protein konnte erfolgreich aus dem Pellet isoliert werden. Die Produktion und Aufreinigung beider Proteine IsaA und IsaB unter optimierten Bedingungen ergab, dass beide Proteine nun in ausreichender Menge und Konzentration f{\"u}r die folgende Immunisierung und die weiteren Arbeiten vorlagen. Aus Kaninchen, die mit IsaA immunisiert wurden, konnten polyklonale Antik{\"o}rper gewonnen werden, die die Grundlage f{\"u}r einen ersten Tierversuch mit 24 Ratten bildeten. Hierbei zeigte sich, dass die Tiere, die mit 1.000.000.000 Bakterien infiziert worden waren deutlich st{\"a}rkere Infektionszeichen aufwiesen als diejenigen, die mit 100.000.000 Bakterien infiziert worden waren. Weiterhin wurde deutlich, dass die Tiere, die Serum (mit Antik{\"o}rper gegen IsaA) erhalten hatten, gegen{\"u}ber den Vergleichstieren mit Placebo einen deutlichen Vorteil hinsichtlich Infektionszeichen und Immunantwort hatten. Somit belegen die tierexperimentiellen Ergebnisse in dieser Arbeit erstmalig den therapeutischen Nutzen von Antik{\"o}rpern gegen IsaA. IsaA ist demnach ein geeignetes Target f{\"u}r eine Immuntherapie gegen S. aureus.},
  subject      = {MRSA},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Waeschle2010,
  author    = {W{\"a}schle, Katharina},
  title     = {Der Einfluss heterophiler Antik{\"o}rper auf die Thyreoglobulinbestimmung bei Patienten mit differenziertem Schilddr{\"u}senkarzinom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-54609},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {In der vorliegenden Studie wurde der m{\"o}gliche Einfluß von heterophilen Antik{\"o}rpern auf die Thyreoglobulinbestimmung in der Nachsorge beim Patienten mit differenziertem Schilddr{\"u}senkarzinom untersucht. Dazu wurde bei 201 Patientenseren der Thyreoglobulinwert auf herk{\"o}mmliche Weise und in einer Parallelbestimmung nach Vorbehandlung mit heterophilen Antik{\"o}rper blocking tubes bestimmt. Dieses Vorgehen erm{\"o}glichte es, einen direkten Vergleich beider Messergebnisse anzustellen und einen m{\"o}glichen Einfluß heterophiler Antik{\"o}rper aufzudecken. Dar{\"u}ber hinaus wurde das selbe Verfahren bei einer heterogenen Kontrollgruppe angewandt. In 99\% der Proben ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Messergebnissen. Somit ist ein Einfluß von heterophilen Antik{\"o}rpern auf die Thyreoglobulinbestimmung bei Patienten mit differenziertem Schilddr{\"u}senkarzinom unwahrscheinlich.},
  subject      = {Thyreoglobulin},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Metzen2010,
  author    = {Metzen, Daniela},
  title     = {Immunhistochemische F{\"a}rbungen zur Charakterisierung tumorspezifischer Antigene mittels humaner monoklonaler Antik{\"o}rper},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-51412},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Humane Antik{\"o}rper sind aufgrund ihrer spezifischen, zielgerichteten Eigenschaften die idealen therapeutischen Waffen unserer modernen Medizin. Schon im ausgehenden letzen Jahrhundert gelang es dem pathologischen Institut der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg einige rein humane monoklonale Antik{\"o}rper aus Geweben sowohl gesunder, als auch an einem Tumorleiden erkrankter Patienten zu isolieren. Zwei dieser Antik{\"o}rper galt es im Rahmen dieser Arbeit n{\"a}her zu untersuchen: LM-1 und PAM-1 , beides rein humane monoklonale IgM-Antik{\"o}rper. Mithilfe immunhistochemischer F{\"a}rbungen auf Paraffinschnitten von Adenocarcinomen des Colons, Carcinomen des Pancreas und Adeno- und Plattenepithelcarcinomen der Lunge ließ sich eindeutig demonstrieren, daß bei beiden Antik{\"o}rpern eine tumorspezifische Reaktivit{\"a}t ohne Kreuzreaktion mit den umgebenden gesunden Geweben auf fast allen der ausgew{\"a}hlten F{\"a}lle der begutachteten Tumorarten vorlag. Daraus l{\"a}sst sich eine zuverl{\"a}ssige und selektive Expression der jeweiligen Antigene auf den maligne entarteten Zellen folgern, die sich auch bei Betrachtung der Stadien der Tumoren und des Gradings der Zellen konstant zeigte. Damit scheint soweit keinen Zusammenhang zwischen der Entdifferenzierung der tumor{\"o}sen Zellen, als auch der Gr{\"o}ße und des Fortschreiten des Tumors erkennbar. Die hier demonstrierten Ergebnisse lassen sowohl PAM-1 als auch LM-1 als verl{\"a}ssliche Marker f{\"u}r multiple epitheliale Tumoren und deren Vorstufen erscheinen und k{\"o}nnen somit als wertvolles diagnostisches und wahrscheinlich auch therapeutisches Mittel eingestuft werden, doch muss die Diskussion dieser Aspekte weiterf{\"u}hrenden Untersuchungen {\"u}berlassen werden.},
  subject      = {Monoklonaler Antikrper},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hauff2009,
  author    = {Hauff, Cornelia},
  title     = {Aspects of the mode of action of bispecific T cell engager (BiTE) antibodies},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-48369},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Bispecific T cell engager (BiTE) display a novel design among the class of bispecific antibodies and hold great promise to fight diverse cancers. BiTE molecules consist of two different binding entities derived from two human IgG antibodies connected by a short peptide linker. Their binding arms are directed against the CD3e chain of the T cell receptor on T cells and against an antigen that is specific for (e.g., CD19 for lymphoma in MT103) or over-expressed on (e.g., EpCAM for epithelial cancer in MT110) tumor cells. Without requirement for pre- or co-stimulation, BiTE molecules efficiently redirect CD3+ T cells towards tumor cells expressing the relevant target antigen. Only a BiTE molecule simultaneously bound to both tumor cell and T cell activates the T cell to exert its cytolytic function resulting in tumor cell death. In T cells stimulated with both BiTE and target cells, elevated levels of caspase activation and increased expression of cytotoxic and signaling proteins are observed. These include cytolytic proteins granzyme B and perforin, activation markers CD69 and CD25 and adhesion molecules CD2 and LFA-1. Activated T cells secrete the usual mix of cytokines, among them pro-inflammatory cytokines IFN-g and TNF-a. The membrane of tumor cells expressing the relevant target antigen is perforated during the attack of BiTE-stimulated effector cells as can be concluded from adenylate kinase release from the cytosol of tumor cells. Ca2+-chelator EGTA completely blocked BiTE-mediated activation of caspases and tumor cell lysis. As perforin is strictly Ca2+-dependent, a major role for this pore-forming protein is assumed for the elimination of tumor cells via BiTE-stimulated T cells. Granzyme B and caspases are main players in BiTE-mediated elimination of tumor cells. Inhibitors of granzyme B or caspases reduce or block, respectively the activation of caspases. However, other signals of apoptosis (cleavage of PARP and fragmentation of DNA) were only reduced by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. Most interestingly, the lytic capacity of BiTE molecules was not impaired by granzyme B inhibitor or caspase inhibitor. It seems that there is no requirement for granzyme B and caspases to be present simultaneously. Instead the data presented provide evidence that they can be replaced one at a time by related proteins. Pre-incubation of effector cells with the glucocorticoids dexamethasone or methylprednisolone resulted in markedly decreased secretion of cytokines by T cells yet only a small reduction in the expression of activation markers and adhesion molecules on T cells and specific lysis of tumor cells upon BiTE stimulation. Soluble factors secreted in an undirected manner by BiTE-stimulated T cells do not mediate tumor cell death by themselves. Bystander cells negative for the antigen that is recognized by the BiTE molecule will not be compromised by BiTE activity. The cytokine TGF-b reduced proliferation as well as granzyme B and perforin expression of BiTE-stimulated T cells. Redirected lysis by BiTE-activated T cells was also decreased under the influence of TGF-b, however lysis was still performed at a reasonable rate (72 \% of target cells). TGF-b does not exert a deleterious effect on lytic potential of BiTE-stimulated T cells. The minimal anticipated biological effect level for the BiTE MT110 was determined for the entry of MT110 into phase I clinical studies. Experiments analyzing redirected lysis of tumor cells, expression of activation marker CD25 and cytokine release by T cells revealed a MABEL value of 50 pg/ml for MT110.},
  subject      = {Antik{\"o}rper},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Tomaschuetz2009,
  author    = {Tomasch{\"u}tz, Lena},
  title     = {Probleme angepasster HIV-Diagnostik in ressourcenarmen L{\"a}ndern am Beispiel Gikonkos, Ruanda - Situationsanalyse und potentielle L{\"o}sungsans{\"a}tze},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-39981},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Nachdem im Rahmen einer engen Zusammenarbeit zwischen dem Missions{\"a}rztlichen Institut in W{\"u}rzburg und dem Centre de Sant{\´e} in Gikonko, Ruanda bereits im Vorfeld dieser Arbeit erhebliche Probleme mit falsch positiven HIV-Schnelltestergebnissen aufgefallen waren, wurden 162 Patienten bez{\"u}glich ihres HIV-Status untersucht und bei einer kleineren Gruppe (46 Patienten) eine eingehende serologische Analyse durchgef{\"u}hrt. Dabei waren Ziele dieser Arbeit (1) den HIV-Status aller in Gikonko als HIV-positiv gef{\"u}hrten Patienten zu {\"u}berpr{\"u}fen, um so das diagnostische Problem genauer einsch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen; (2) die Reaktionsmuster der Tests zu analysieren, um m{\"o}gliche Schwachpunkte der einzelnen Schnelltests zu finden; (3) nach Ursachen sowie potentiellen Kreuzreaktivit{\"a}ten f{\"u}r uneindeutige oder falsch positive Testergebnisse zu suchen; (4) Risikogruppen zu definieren, in denen HIV-Schnelltests weniger aussagekr{\"a}ftig sind und (5) die angepasste HIV-Diagnostik in einigen ausgew{\"a}hlten F{\"a}llen mit genaueren Verfahren in Deutschland zu {\"u}berpr{\"u}fen und nach weiteren serologischen Auff{\"a}lligkeiten zu suchen. Hierf{\"u}r wurden Blutproben mithilfe der im ruandischen Testalgorithmus verwendeten Schnelltests (DetermineTM, UnigoldTM, CapillusTM, First ResponseTM) vor Ort auf HIV getestet. Von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. wider-spr{\"u}chlichen Ergebnissen wurden Serumproben nach Deutschland zu genaueren serologischen Analyse transportiert. Diese umfasste die virologische Untersuchung auf HIV mittels ELISA, Western Blot (im positiven Fall zur Best{\"a}tigung) sowie PCR, eine immunologische und autoimmunologische Untersuchung (Bestimmung von IgG, IgM, Rheumafaktor sowie ANCA), sowie eine parasitologische Untersuchung (Bestimmung von Malaria-Antik{\"o}rper) und die Messung von Werten der klinischen Chemie (Kreatinin, GOT, GPT). Erg{\"a}nzt wurde die serologische Analyse durch die Erhebung von Daten aus der Kartei des Krankenhauses sowie der Schwangerenambulanz in Gikonko. Es zeigte sich, dass unter Verwendung von HIV-Schnelltests bei nur 79\% der Patienten (n = 112) der HIV-positive Status best{\"a}tigt werden konnte, 15\% (n = 21) erhielten ein klar negatives Ergebnis und in 6\% (n = 8) f{\"u}hrten die HIV-Schnelltests zu keinem eindeutigen Ergebnis. Bei der virologischen Untersuchung in Deutschland wurden alle negativen Ergebnisse best{\"a}tigt; unter den acht uneindeutig getesteten Seren wurde in zwei F{\"a}llen eine HIV-Infektion nachgewiesen. Um Schwachpunkte oder Anf{\"a}lligkeiten einzelner Tests auf St{\"o}rfaktoren aufzeigen, wurden die Reaktionsmuster der HIV-Schnelltests entsprechend der genaueren serologischen Untersuchungen dargestellt und analysiert. Es zeigte sich, dass besonders DetermineTM und CapillusTM urs{\"a}chlich f{\"u}r uneindeutige Testergebnisse waren. Bei der genaueren Analyse von Seren von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. widerspr{\"u}chlichen Ergebnissen wurden bei 7\% (n = 3) Rheumafaktoren und bei 16\% (n = 5) ANCAs nachgewiesen. Außerdem zeigten 48\% der Proben (n = 22) stark erh{\"o}hte IgM-Werte. Es waren wiederum vornehmlich die Tests DetermineTM und CapillusTM, welche Probleme bei der Testung der entsprechenden Seren aufwiesen. Der Einfluss zweier {\"a}ußerer Faktoren hingegen war evident: Zum einen f{\"u}hrte die Interpretationsvorschrift der Hersteller, jegliche Reaktion als positiv zu werten, zu vielen falsch positiven Ergebnissen und zum anderen gen{\"u}gten die zur Verf{\"u}gung stehenden HIV-Schnelltests im l{\"a}ndlich gelegenen Gikonko, mit einer HIV-Pr{\"a}valenz von 4\%, den biomathematischen Anforderungen nicht. Die erhobenen Daten aus der Kartei des Centre de Sant{\´e} erh{\"a}rteten die Annahme, dass die Neutralit{\"a}t der interpretierenden Person durch eine verd{\"a}chtige Familien- oder Eigenanamnese bzw. eine entsprechende Klinik gef{\"a}hrdet wird. Die Analyse der Kartei der Schwangerenambulanz zeigte eine signifikante H{\"a}ufung falsch positiver Testergebnisse im letzten Trimenon.},
  subject      = {HIV},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Steigerwald2008,
  author    = {Steigerwald, Jutta},
  title     = {Der NK-Zellrezeptor NKG2D als Zielstruktur f{\"u}r eine Antik{\"o}rper-basierte therapeutische Immunmodulation},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33446},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen erm{\"o}glicht, infizierte oder transformierte k{\"o}rpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Z{\"o}liakie und RA zu f{\"u}hren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antik{\"o}rper gegen hNKG2D f{\"u}r einen m{\"o}glichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antik{\"o}rper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Dom{\"a}ne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Dom{\"a}nen verkn{\"u}pft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivit{\"a}t identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese f{\"u}hrte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminos{\"a}uren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivit{\"a}t wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinit{\"a}t und inhibitorischen Aktivit{\"a}t nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinit{\"a}tsmaturierung des E1VLV71KVH Antik{\"o}rpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in f{\"u}nf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollst{\"a}ndige IgG1/lambda-Antik{\"o}rper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivit{\"a}t, sowie ihrer Stabilit{\"a}t und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antik{\"o}rper wiesen nach der Affinit{\"a}tsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich h{\"o}heres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantik{\"o}rper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegen{\"u}ber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilit{\"a}t. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorg{\"a}nge der Antik{\"o}rper in die NK-Zelle beobachtet werden. F{\"u}r ein besseres Verst{\"a}ndnis NKG2D-abh{\"a}ngiger Regulationsvorg{\"a}nge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Erg{\"a}nzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen erm{\"o}glichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antik{\"o}rper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antik{\"o}rper eine ambivalente Funktionalit{\"a}t aufweisen. In L{\"o}sung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors {\"u}ber an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antik{\"o}rper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivit{\"a}t scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antik{\"o}rper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht m{\"o}glich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antik{\"o}rper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antik{\"o}rper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren.},
  subject      = {Antik{\"o}rper},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Querfurt2007,
  author    = {Querfurt, Alexander Pablo},
  title     = {Wertigkeit von Immunfluoreszenz und Polymerasekettenreaktion in der Diagnose und klinischen Bewertung bei der Afrikanischen Trypanosomiasis},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31511},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {In der vorliegenden Arbeit wurde ein repr{\"a}sentatives Kollektiv von 97 Schlafkrankheitspatienten aus Angola klinisch untersucht und von je 96 Patienten Blut- und Liquorproben gewonnen. Hauptfragestellungen waren, ob die PCR-Technik zur Diagnose und Stadieneinteilung der HAT beitr{\"a}gt und ob sich aus dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Immunglobulinen Zusammenh{\"a}nge mit dem klinischen Bild der Krankheit herstellen lassen. Da mehrfach von Inkonsistenzen bei den Ergebnissen einer von Moser et al. (1989) als sehr sensitiv publizierten PCR berichtet wurde und die viel versprechenden Resultate der von Kabiri et al. (1999) beschriebenen PCR nicht reproduziert werden konnten, wurde eine von Matovu et al. (2001) publizierte PCR zum Nachweis von trypanosomaler DNA (TbAT1-Gen) verwendet. Je nach analysiertem Medium und verwendetem Purifikations-Kit ergaben sich analytische Nachweisgrenzen von 10 bis 10² Parasiten/10 µl PCR-Ansatz, entsprechend rechnerischer Nachweisgrenzen von ca. 5000 Trypanosomen/ml Blut und ca. 3000 Trypanosomen/ml Liquor. Von 96 Blutproben waren 20 positiv in der PCR (20,8\%). Gemessen an den jeweiligen mikroskopischen Diagnostikmethoden kam dies einer Sensitivit{\"a}t von 31,1\% und einer Spezifit{\"a}t von 92,3\% gleich. Die Liquorproben von 55 Stadium-II-Patienten zeigten in 4 F{\"a}llen ein positives Resultat in der PCR (7,3\%), entsprechend einer Sensitivit{\"a}t von 21,4\% und einer Spezifit{\"a}t von 97,6\%. Alle Liquorproben von Stadium-I-Patienten waren negativ in der PCR. Die Ergebnisse der Blut- und Liquorproben waren in {\"u}ber 99\% der F{\"a}lle reproduzierbar. Es bestanden jeweils Zusammenh{\"a}nge zwischen den Resultaten der PCR mit denen der herk{\"o}mmlichen mikroskopischen Nachweismethoden wie LKP und Liquor-Mikroskopie. Neben der offensichtlich zu geringen analytischen Nachweisgrenze bei gleichzeitig niedriger Parasit{\"a}mie der Patienten kommen auch Faktoren wie DNA-Verlust durch das benutzte DNA-Purifikationskit oder Gen-Deletionen der Trypanosomen als Ursache f{\"u}r die hohe Anzahl der falsch-negativen PCR Ergebnisse in Betracht. Die Resultate der hier angewendeten PCR trugen nicht zur L{\"o}sung des diagnostischen Problems der serologisch positiven, aber aparasit{\"a}men Patienten bei, lieferten jedoch Hinweise, dass die Parasitenlast im Blut bei Patienten im fortgeschrittenen Stadium h{\"o}her ist als bei solchen im Anfangsstadium. Insgesamt stellt diese Methode aber keine Bereicherung in der Diagnosestellung oder der Stadieneinteilung bei der HAT dar und sollte speziellen Fragestellungen wie Melarsoprol-Resistenzbestimmungen vorbehalten werden. Der IFT wurde nach der von Wery et al. (1970) beschriebenen Methode in modifizierter Form durchgef{\"u}hrt. Im Serum fanden sich f{\"u}r spezifisches IgG hohe, f{\"u}r spezifisches IgM mittlere und f{\"u}r spezifisches IgA niedrige Titer. Die jeweiligen Titer waren in der vorliegenden Arbeit h{\"o}her als in der Referenzliteratur, wahrscheinlich bedingt durch die Subjektivit{\"a}t der Endpunktlesung. W{\"a}hrend insgesamt Patienten mit direktem Parasitennachweis signifikant h{\"o}here Serumspiegel an spezifischem IgM aufwiesen, konnte bei manchen Kranken trotz Trypanosomen-Pr{\"a}senz kein spezifisches IgM im Serum oder Liquor nachgewiesen werden. Bei Patienten im fortgeschrittenen Stadium waren die Spiegel der einzelnen Antik{\"o}rperklassen im Serum gegen{\"u}ber denen von Patienten im Anfangsstadium signifikant h{\"o}her. Dieses Ph{\"a}nomen k{\"o}nnte auf einer Akkumulation der spezifischen Immunglobuline gegen die st{\"a}ndig wechselnden Oberfl{\"a}chenantigene der Trypanosomen im Laufe der Krankheit beruhen. Die H{\"o}hen der jeweiligen spezifischen Antik{\"o}rperspiegel im Serum standen nicht in Zusammenhang mit pathologischen Befunden bei der Untersuchung von K{\"o}rpertemperatur, Blutdruck, Puls, Lymphadenopathien, Hepato- oder Splenomegalien, Bauchschmerz und Untergewicht. Das Fehlen eines Vergleichskollektives, die große Symptom-Variabilit{\"a}t und die Subjektivit{\"a}t einiger Untersuchungsmethoden erschwerten dabei allerdings die Objektivierung des klinischen Zustandes im Hinblick auf allgemeing{\"u}ltige Aussagen. Interessante Nebenfunde in dieser Arbeit waren die nach wie vor ungekl{\"a}rt hohe Pr{\"a}valenz von Untergewicht, Hinweise auf Kreislaufregulationsst{\"o}rungen und der Zusammenhang des Auftretens des Winterbottom-Zeichens mit der Zugeh{\"o}rigkeit zum Stadium II. Im Liquor konnte nur in wenigen F{\"a}llen bei Stadium-II-Patienten spezifisches IgG nachgewiesen werden. Das Vorkommen dieses Immunglobulins stand jedoch im Zusammenhang mit pathologischen Ergebnissen der Patienten in den Stand- und Gangversuchen. Aufgrund des Vorteils der einfachen und schnellen Durchf{\"u}hrbarkeit k{\"o}nnten sich diese Untersuchungen als sinnvolle Diagnostikerg{\"a}nzung in der Neuroinflammationsdetektion bei der HAT erweisen. Spezifisches IgM und IgA lagen im Liquor bei allen Proben unter der Testgrenze und bieten keine Anhaltspunkte f{\"u}r eine sinnvolle Verwendung als Diagnostik- oder Verlaufsparameter.},
  subject      = {Trypanosomiase},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kroiss2008,
  author    = {Kroiß, Matthias},
  title     = {Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen {\"U}berpr{\"u}fung zu unterziehen, wurde ein neues Affinit{\"a}tsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen st{\"o}chiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller {\"U}bereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche" RNAs verhindert. Folglich gen{\"u}gen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, w{\"a}hrend die {\"u}brigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen k{\"o}nnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindr{\"u}ckliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann.},
  subject      = {Taufliege},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Reiss2007,
  author    = {Reiß, Stefan},
  title     = {Molekulare Analyse der humoralen Immunit{\"a}t beim Magenkarzinom},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26592},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Vor fast 100 Jahren postulierte Paul Ehrlich ein k{\"o}rpereigenes System, das in der Lage ist, Tumorentstehung zu erkennen und zu eliminieren. Die Weiterentwicklung dieser Hypothese f{\"u}hrte in den Folgejahren zum Modell der „immunosurveillance", einer angeborenen Wachfunktion des Immunsystems, welche im Regelfall die Entstehung von manifesten Tumoren verhindern kann. Neben zellul{\"a}ren Bestandteilen wie Makrophagen und nat{\"u}rlichen Killerzellen kommt dabei eine entscheidende Bedeutung den B-Lymphozyten mit ihrer F{\"a}higkeit zur Produktion eines variablen Antik{\"o}rperrepertoires zu. Diese angeborene, IgM-vermittelte, humorale Abwehrfunktion richtet sich insbesondere auch gegen glykopeptidische Oberfl{\"a}chenantigene maligner k{\"o}rpereigener Zellen. Allerdings scheint sich in seltenen Einzelf{\"a}llen ein Tumorprozess durch Fluchtmechanismen dem Zugriff der Immunabwehr entziehen zu k{\"o}nnen. Die intensiven Wechselwirkungen von Immunsystem und Tumorwachstum sind Ziel weitreichender Forschung geworden, angetrieben von der Hoffnung, in naher Zukunft neue immunologische Therapieverfahren gegen maligne Tumoren aufbieten zu k{\"o}nnen. Bisher wenig untersucht ist allerdings die lokale Situation der humoralen Immunit{\"a}t innerhalb von Tumorgewebe. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit eine Sequenzanalyse des exprimierten Immunglobulin-Repertoires in situ, also aus gewebest{\"a}ndigen tumorinfiltrierenden B-Lymphozyten und solchen aus tumorfreiem Gewebe vorgenommen. Als Ausgangsmaterial diente Gewebe aus Magenkarzinomen und tumorfreier Magenschleimhaut des Magenantrums von acht Patienten mit fortgeschrittener Tumorerkrankung. Adenokarzinome des Magens stellen eine multifaktoriell bedingte, weltweit h{\"a}ufig auftretende Tumorentit{\"a}t mit besonders schlechter Prognose dar. In der Tat zeigen sich in den vorliegenden Ergebnissen signifikante Unterschiede zwischen Tumor und Antrum in den variablen Schwerkettengenen der gewebest{\"a}ndigen B-Lymphozyten. Diese betreffen sowohl die IgVH- Familienzugeh{\"o}rigkeit als auch die Mutationsraten und Mutationsmuster der einzelnen Sequenzen. Die entscheidenden Beobachtungen im Rahmen dieser Arbeit sind der in situ- Nachweis von naiven, nicht immunit{\"a}tsgereiften Immunglobulinen der prim{\"a}ren Immunantwort, insbesondere der mit Antitumoraktivit{\"a}t in Verbindung gebrachten IgVH3-Familie innerhalb des untersuchten Antrumgewebes sowie deren Fehlen innerhalb des Tumorprozesses. Der Nachweis affinit{\"a}tsgereifter Immunglobuline innerhalb des Tumorprozesses legt eine zwar intensive, aber letztendlich ineffektive Auseinandersetzung des Immunsystems mit dem sich offenbar in diesem Stadium nicht mehr als ausreichend immunogenen erweisenden Tumorprozess nahe. Diese Ergebnisse heben die entscheidende Bedeutung der naiven Immunit{\"a}t f{\"u}r die Verhinderung von Tumoren (Immun{\"u}berwachung) hervor. Unklar sind allerdings nach wie vor die Escape-Mechanismen, die es einem Tumor erlauben, sich dieser prim{\"a}ren Immunantwort zu entziehen. Weitere Forschungsarbeit im Bereich naiver Immunglobuline mit Antitumoraktivit{\"a}t, wie beispielsweise dem selektiv an Magenkarzinomzellen bindenden und Apoptose ausl{\"o}senden Antik{\"o}rper SC-1, k{\"o}nnte dazu beitragen, zuk{\"u}nftig v{\"o}llig neue adjuvante immunologische Therapieverfahren in der Tumortherapie zu etablieren.},
  subject      = {Magenkrebs},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bach2007,
  author    = {Bach, Patricia},
  title     = {Immunogenicity of antigen-displaying virus-like particles and their use as a potential vaccine against prion diseases},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25889},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a group of infectious neurodegenerative diseases that are associated with misfolding of the cellular form of the cellular prion protein (PrPC) into a disease associated conformer (PrPSc). No therapy for prion diseases is available at present. So far, anti-PrPC vaccination is hampered by immunological tolerance of the mammalian immune system to endogenous PrPC. The aim of this thesis was to set up a new vaccination strategy based on virus-like particles (VLP) to induce anti-PrPC antibody responses in PrPC-competent mice. In a first step it was assessed whether VLP have the capacity to induce antibody responses that are protective against conventional pathogens. For this purpose, VLP displaying the vesicular stomatitis virus-gylcoprotein (VLP-VSV) were generated and tested for their immunogenicity. Similarly to live vesicular stomatitis virus (VSV), replication deficient VLP-VSV induced T help-independent VSV neutralizing IgM responses that switched to the IgG subclass in a T help-dependent manner. Furthermore, type I IFN receptor (IFNAR) triggering only marginally affected VLP-VSV induced neutralizing IgM responses, whereas it was critically required to promote the IgG switch. The analysis of conditional knockout mice with a lymphocyte-specific IFNAR deletion revealed that IFNAR triggering of lymphocytes did not play a crucial role, neither upon VLP-VSV nor VSV immunization. Collectively, these data verified the high immunogenicity of VLP. Therefore, in a next step VLP were generated displaying the C-terminal half of PrP (residues 121-231aa) fused to the platelet derived growth factor receptor (PDGFR) transmembrane region (VLP-PrPD111) for anti-PrPC immunization. On the surface of such retroparticles, PrPC was expressed at high levels as determined by electron microscopy. VLP-PrPD111 immunization of Prnp-deficient (Prnp0/0) mice resulted in antibody response specifically binding the cellular form of PrPC. Upon intravenous injection of wild-type mice, high PrPC-specific IgM responses were induced, whereas the T cell-dependent switch from the IgM to the IgG subclass was less pronounced. As a consequence, anti-PrPC titers were rather short-lived. The impaired subclass switch was probably related with host T cell tolerance to endogenous PrPC. Attempts to increase anti-PrPC IgG responses in wild-type mice via administration of VLP-PrPD111 emulsified in various different adjuvants failed. Nevertheless, in single individuals low IgG antibodies were induced after immunization of VLP-PrPD111 emulsified in CFA. To circumvent T cell tolerance in wild-type mice, a multitude of different immunization strategies was tested, including priming and boosting protocols with different types of VLP or VLP expressing PrPC together with foreign T helper epitopes. Overall, those efforts did not improve anti-PrPC IgG responses in wild-type mice. Interestingly, anti-PrPC antibodies induced in Prnp0/0 mice reduced PrPSc levels in prion infected cell cultures, whereas serum of vaccinated wild-type mice did not. To assess the protective capacity of VLP-PrPD111 induced immune responses, vaccinated wild-type mice were infected with scrapie (RML 5.0). Unfortunately, vaccinated mice did not show a significant delay in the onset of scrapie. In a last part of the thesis it was studied whether in the absence of T cell help activated "memory" B cells were able to produce anti-PrPC specific antibodies. To address this question, PrPC-specific memory B cells were sorted from vaccinated Prnp0/0 mice and adoptively transferred into wild-type recipient mice. Upon VLP-PrPD111 challenge, no PrPC-specific IgG titers were induced in the recipients. Nevertheless, several VLP-PrPD111 challenged recipient mice were protected against scrapie infection. In conclusion, VLP were characterized as highly immunogenic vaccines that were used to elucidate various questions concerning adaptive immune response and basic mechanisms of PrPC-specific tolerance vs. immunity. Remarkably, VLP-PrPD111 was able to induce native PrPC-specific antibodies in wild-type mice but major difficulties associated with PrPC-specific tolerance made efficacious scrapie vaccination impossible. New vaccination approaches are being tested to overcome these limitations.},
  subject      = {Prion},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Kusnezow2006,
  author    = {Kusnezow, Wlad},
  title     = {Entwicklung von Antik{\"o}rper-Mikroarray : von Biophysik der Mikrospot-Reaktion bis zur Hochdurchsatzanalyse der Proteine},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-22534},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Obwohl Protein-Mikroarrays urspr{\"u}nglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repr{\"a}sentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilit{\"a}t der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilit{\"a}t und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antik{\"o}rper-Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen L{\"o}sungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begr{\"u}ndete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antik{\"o}rper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie f{\"u}r deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antik{\"o}rpern f{\"u}r verschiedene Oberfl{\"a}chen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antik{\"o}rper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberfl{\"a}chen am besten geeignet sind. Diese Oberfl{\"a}che ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde f{\"u}r alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antik{\"o}rper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der n{\"o}tigen Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu k{\"o}nnen, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und f{\"u}r den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM erm{\"o}glicht auf eine ph{\"a}nomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensit{\"a}t oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein m{\"u}ssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Ber{\"u}cksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die ph{\"a}nomenologischen TCM-Werte interpretieren zu k{\"o}nnen und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, f{\"u}r die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl f{\"u}r konventionelle als auch f{\"u}r Mikrospot-Immunoassays erm{\"o}glicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte f{\"u}r einen typischen Standard-Antik{\"o}rper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabh{\"a}ngige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegen{\"u}bersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen f{\"u}rs Design und die zuk{\"u}nftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antik{\"o}rper-Mikroarray ein kritischer Punkt f{\"u}r die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Gr{\"o}ße eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosit{\"a}t des Inkubationspuffers und Mischintensit{\"a}t die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Gr{\"o}ßenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gew{\"a}hrleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinit{\"a}t, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter ber{\"u}cksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivit{\"a}t von Antik{\"o}rper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivit{\"a}t und Reproduzierbarkeit der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen f{\"u}r die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet f{\"u}r eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivit{\"a}ten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antik{\"o}rper-Mikroarrays sowohl f{\"u}r eine markierte Antigenmischung als auch f{\"u}r komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verh{\"a}ltnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren {\"o}ffnet zus{\"a}tzliche M{\"o}glichkeiten f{\"u}r schnelle, kosteng{\"u}nstige und unbeschr{\"a}nkt erweiterungsf{\"a}hige Mikrospot-Immunoassays.},
  subject      = {Microarray},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Krinner2006,
  author    = {Krinner, Eva-Maria},
  title     = {Generierung humaner Antik{\"o}rper-Spezifit{\"a}ten zur Therapie entz{\"u}ndlicher Erkrankungen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20295},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Der Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) spielt eine zentrale Rolle in entz{\"u}ndlichen Prozessen. Die Behandlung mit Antik{\"o}rpern, die murines GM-CSF neutralisieren, zeigte signifikante Behandlungseffekte in Maus-Modellen f{\"u}r Rheumatoide Arthritis, Autoimmune Enzephalomyelitis, entz{\"u}ndliche Erkrankungen der Lunge und Psoriasis. Diese Arbeit beschreibt die Generierung des ersten vollst{\"a}ndig humanen Einzelketten (scFv)-Antik{\"o}rpers, der effektiv humanes GM-CSF (hGM-CSF) neutralisiert. Dieser humane scFv-Antik{\"o}rper wurde mit Hilfe der Phage-Display-Technologie, ausgehend von einem monoklonalen Ratten-Antik{\"o}rper mit hGM-CSF-neutralisierender Aktivit{\"a}t, konstruiert. In einem ersten Schritt wurde die VH-Dom{\"a}ne des parentalen Ratten-Antik{\"o}rpers mit einem humanen leichte Ketten V-Repertoire kombiniert. Nach Phage-Display-Selektion wurde ein dominanter Klon identifiziert, der f{\"u}r ein chim{\"a}res Ratte/Human scFv-Fragment kodiert. Dieser scFv-Antik{\"o}rper neutralisiert hGM-CSF mit einer halbmaximalen inhibitorischen Konzentration (IC50) im nanomolaren Bereich. Die humane leichte Kette dieses Klons wurde dann mit einem humanen schwere Ketten V-Repertoire kombiniert. Um die Bindungsspezifit{\"a}t des Ursprungsantik{\"o}rpers f{\"u}r den neutralisierenden Bereich auf dem Antigen zu erhalten, enthielt dieses Repertoire die Komplementarit{\"a}ts-bestimmende Region 3 (CDR3) der parentalen VH-Dom{\"a}ne. Nach Phage-Display-Selektion wurden mehrere scFv-Antik{\"o}rper identifiziert, die hGM-CSF im niedrig nanomolaren Konzentrationsbereich neutralisierten. Das scFv-Fragment mit der h{\"o}chsten hGM-CSF-neutralisierenden Aktivit{\"a}t (3077) wurde in verschiedene therapeutisch relevante Antik{\"o}rperformate {\"u}berf{\"u}hrt. Zum einen wurde das scFv-Fragment {\"u}ber einen zus{\"a}tzlichen C-terminalen Cystein-Rest an ein verzweigtes, 40 kD-grosses Polyethylenglycol (PEG) -Polymer konjugiert. Zum anderen wurde das scFv-Fragment durch Fusion mit humanen konstanten Immunglobulin-Dom{\"a}nen zu einem ganzen IgG1/kappa-Antik{\"o}rper vervollst{\"a}ndigt. Die so generierten Konstrukte mit identischer Spezifit{\"a}t wurden dann in vitro im Hinblick auf Bindungsaffinit{\"a}t, Neutralisierungsaktivit{\"a}t und Stabilit{\"a}t untersucht. Die Konjugation des PEG-Polymers hatte einen vernachl{\"a}ssigbaren Effekt auf das Neutralisierungspotential des scFv-Fragments in vitro, obwohl sie aufgrund einer verlangsamten Assoziationsrate eine reduzierte Bindungsaffinit{\"a}t verursachte. Der humane IgG1-Antik{\"o}rper zeigte sowohl eine verbesserte Bindungsaffinit{\"a}t als auch eine erh{\"o}hte Neutralisierungsaktivit{\"a}t im Vergleich zum nicht-PEGylierten wie auch zum PEGylierten scFv-Fragment. Wir konnten außerdem zeigen, dass die PEGylierung in der thermischen Stabilit{\"a}t des scFv-Antik{\"o}rpers einen deutlichen Anstieg um 10°C vermittelte. Aufgrund der hohen Neutralisierungsaktivit{\"a}t und Stabilit{\"a}t des IgG1-Antik{\"o}rpers 3077 wie auch des PEGylierten scFv-Fragments 3077 sind beide Molek{\"u}le - in unterschiedlichen klinischen Anwendungsbereichen - potentielle Kandidaten f{\"u}r eine Behandlung humaner entz{\"u}ndlicher Erkrankungen.},
  subject      = {GM-CSF},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Nitschke2006,
  author    = {Nitschke, Cindy},
  title     = {Humorale und zellul{\"a}re Immunantwort gegen das Prion-Protein},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-18409},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Das Prion-Protein spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von {\"u}bertragbaren spongiformen Enzephalopathien. Studien aus den letzten Jahren haben gezeigt, dass die Entwicklung einer Therapie f{\"u}r Prionenerkrankungen eine Induktion von Autoantik{\"o}rpern gegen das Prion-Protein voraussetzt. In dieser Arbeit wurden aktive Immunisierungsstrategien gegen das zellul{\"a}re Prion-Protein beschrieben und die zellul{\"a}ren und humoralen Immunantworten sowie deren Einfluss auf die Entstehung einer Prionenerkrankung analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Immunisierung mit rek. mPrP und Adjuvants eine Aktivierung und Proliferation von PrP-spezifischen T-Zellen in Prnp0/0-M{\"a}usen induziert wurde. Desweiteren konnten in PrP-defizienten M{\"a}usen spezifische Antik{\"o}rper gegen das Prion-Protein nachgewiesen werden, die in der Lage waren, die pathogene Form des PrPs (PrPSc) zu detektieren und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die Immunisierung mit rek. mPrP und CpG-1826 konnten in CD4+-T-Zellen erh{\"o}hte Zytokinspiegel von TNF\&\#61537; und IFN\&\#61543; induziert werden. Im Gegensatz dazu konnte keine T-Zell-Antwort und nur geringe Antik{\"o}rperkonzentrationen nach Proteinimmunisierung in Wildtypm{\"a}usen nachgewiesen werden. Die induzierten Antik{\"o}rper in Wildtypm{\"a}usen waren nicht in der Lage den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. In einem zweiten Ansatz wurde die Immunisierung mit zwei unterschiedlichen PrP-exprimierenden DNA-Vektoren durchgef{\"u}hrt. Hierf{\"u}r wurden der pCG-PrP-Vektor, der das Maus-PrP exprimiert, und der pCG-PrP-P30-Vektor, der zus{\"a}tzlich zum PrP f{\"u}r das P30-Th-Epitop des Tetanustoxins kodiert, verwendet. Dieses P30-Epitop wurde schon in fr{\"u}heren Arbeiten genutzt, um die Toleranz gegen k{\"o}rpereigene Proteine zu brechen. Die Ergebnisse zeigten, dass durch die DNA-Immunisierung eine PrP-spezifische Antik{\"o}rperantwort in Prnp0/0-M{\"a}usen induziert werden konnte. In Wildtypm{\"a}usen wurden allerdings nur geringe Antik{\"o}rpertiter nachgewiesen. Die Antik{\"o}rper aus den Prnp0/0-M{\"a}usen waren in der Lage PrPSc zu erkennen, und den PrPSc-Gehalt in Zellkultur zu reduzieren. Durch die DNA-Immunisierung wurde eine PrP-spezifische Aktivierung und Proliferation von T-Zellen in Prnp0/0-M{\"a}usen erreicht, die nach Immunisierung mit pCG-PrP-P30 st{\"a}rker war als nach Immunisierung mit pCG-PrP. Nach DNA-Vakzinierung konnte in Wildtypm{\"a}usen eine unspezifische Erh{\"o}hung der Zytokinantwort mit erh{\"o}hten TNF\&\#61537;- und IFN\&\#61543;-Spiegeln nachgewiesen werden. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Kombination aus DNA- und Proteinimmunisierung durchgef{\"u}hrt, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen. Die erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar mit denen, die nach DNA-Immunisierung allein erreicht wurden. Die Inokulation der immunisierten Wildtypm{\"a}use mit einem Maus-adaptierten Scrapiestamm (RML) zeigte keinen Schutz dieser Tiere vor einer Prionenerkrankung. Alle M{\"a}use aus der immunisierten und nicht immunisierten Gruppe erkrankten im gleichen Zeitraum an Scrapie, zeigten PrPSc Akkumulation im Gehirn und in der Milz und f{\"u}r Prionenerkrankungen typische histopathologische Ver{\"a}nderungen. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Immunisierungsstrategien entwickelt werden, um die Toleranz gegen das Prion-Protein zu brechen und einen Schutz vor Prionenerkrankungen zu induzieren.},
  subject      = {Prion},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kneitz2004,
  author    = {Kneitz, Ralf-Herbert},
  title     = {Untersuchung der Avidit{\"a}t von virusspezifischen Antik{\"o}rpern in Serum und Liquor bei Patienten mit Virusenzephalitiden und Multipler Sklerose},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13118},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Es wurden Avidit{\"a}ten von IgG-Antik{\"o}rper gegen neurotope Viren bei Patienten mit Subakuter Sklerosierender Panenzephalitis (SSPE), Varizella-Zoster-Virus-(VZV-) Infektion mit neurologischen Komplikationen, Multipler Sklerose (MS) und mit nichtentz{\"u}ndlichen, psychiatrischen Hirnerkrankungen untersucht. Es galt insbesondere f{\"u}r Masernvirus- und VZV-Antik{\"o}rper herauszufinden, ob es in gleichzeitig entnommenen Serum- und Liquorproben bei Patienten mit oben genannten Erkrankungen eine signifikante Differenz der Avidit{\"a}ten in Serum und Liquor gibt. Nach Evaluation einer Avidit{\"a}tsbestimmung von VZV-IgG-Antik{\"o}rpern wurden in insgesamt 71 Serum-Liquor-Paaren von Patienten mit oben genannten Krankheiten die Avidit{\"a}ten der IgG-Antik{\"o}rper erhoben. Bei zw{\"o}lf Serum-Liquor-Paaren von sechs SSPE-Patienten sind ausschließlich hochavide masernspezifische Antik{\"o}rper mit mittleren Avidit{\"a}ten von jeweils rund 60\% in Serum und Liquor entdeckt worden. In 28 Serum-Liquor-Paaren von zw{\"o}lf Patienten mit Varizella-Zoster-Virus-Infektion haben sich ebenfalls ausnahmslos hochavide VZV-spezifische Immunglobuline dargestellt. Die Avidit{\"a}tsindices betragen im Mittel 52\% im Serum und 55\% im Liquor. Aus einem Kontrollkollektiv von 18 psychiatrisch erkrankten Patienten mit jeweils einem Serum-Liquor-Paar sind neun Paare auf VZV-spezifische und 14 auf masernspezifische Avidit{\"a}t untersucht worden. Die VZV-Antik{\"o}rper weisen eine Avidit{\"a}t von rund 61\% in Serum und Liquor auf. Die der Masernvirusantik{\"o}rper betr{\"a}gt 55\% in Serum und Liquor. Von den 29 Serum-Liquor-Paaren von Patienten mit Multipler Sklerose sind 15 Paare auf VZV-spezifische und 19 auf masernspezifische Avidit{\"a}t untersucht worden. Die VZV-Antik{\"o}rper weisen eine Serumavidit{\"a}t von 53\% und eine Liquoravidit{\"a}t von 54\% auf. Die der Masernvirusantik{\"o}rper betr{\"a}gt 53\% im Serum und 57\% im Liquor. Das Spektrum der Avidit{\"a}ten ist deutlich weiter gestreut als in den anderen Krankheitskollektiven. W{\"a}hrend dort s{\"a}mtliche Avidit{\"a}ten im hochaviden Bereich liegen, sind die Antik{\"o}rper bei den MS-Patienten sowohl hoch- als auch niedrigavide. Im Schnitt liegen hohe Avidit{\"a}ten bei mehr als der H{\"a}lfte der MS-Patienten vor. Der direkte statistische Vergleich der Avidit{\"a}ten der einzelnen Serum- und Liquorkollektive zeigt keinen signifikanten Unterschied. Schließlich ist noch die Avidit{\"a}t des Serum von der des Liquor eines jeweiligen Paares subtrahiert worden. Außer bei den Patienten mit Multipler Sklerose sind diese Differenzbetr{\"a}ge bei den {\"u}brigen Patienten kleiner als 10\%. Bei einem Teil der MS-Patienten sind die Differenzen in beiden untersuchten Spezifit{\"a}ten gr{\"o}ßer als 10\%. 11\% der MS-Patienten mit VZV-Antik{\"o}rpern hat eine Avidit{\"a}tsdifferenz von mehr als 11\%. Bei 35\% der MS-Patienten mit Masernvirusantik{\"o}rpern ist die Differenz gr{\"o}ßer als 10\%. Bei Patienten, die diese Differenz aufweisen, liegt in jedem Fall eine Multiple Sklerose vor, d.h. die Spezifit{\"a}t betr{\"a}gt 100\%. Statistisch unterscheiden sich die Avidit{\"a}tsdifferenz der MS-Serum-Liquor-Paare signifikant von den {\"u}brigen Kollektiven. Anhand dieses Ergebnisses kann festgestellt werden, dass Differenzen von weniger als 10\% gleiche, Differenzen dar{\"u}ber signifikant unterschiedliche Avidit{\"a}t bedeuten. Diese Erkenntnis bietet einen neuen Ansatz f{\"u}r spezielle Fragestellungen in der Differentialdiagnostik neurologischer Erkrankungen mit intrathekaler, virusspezifischer Antik{\"o}rperproduktion. Serologisch k{\"o}nnte z.B. die Diagnose bei Patienten gefestigt werden, bei denen die Differenzierung zwischen Multipler Sklerose und neurologisch komplizierter Virusinfektion schwierig ist. Allerdings ist die Sensivit{\"a}t mit 11\% f{\"u}r die VZV-Antik{\"o}rper und 35\% f{\"u}r die Masernantik{\"o}rper recht gering. Diese statistisch signifikanten Unterschiede der Differenzen bei der Multiplen Sklerose k{\"o}nnten daher r{\"u}hren, dass intrathekale B-Lymphozyten ohne Einfluss erregerspezifischer Antigene unabh{\"a}ngig von den B-Zellen im Blut ihre Antik{\"o}rper synthetisieren. Das kann zu unterschiedlichen Avidit{\"a}ten in Liquores verglichen mit den Seren von Patienten mit Multipler Sklerose f{\"u}hren. Dagegen sind bei den Virusinfektionen die Antigene in beiden Kompartimenten pr{\"a}sent, weswegen die Antik{\"o}rper sowohl im Serum als auch im Liquor optimal reifen k{\"o}nnen. Das f{\"u}hrt zu hohen, nicht signifikant unterschiedlichen Avidit{\"a}ten.},
  language  = {de}
}