@phdthesis{Nieratschker2008, author = {Nieratschker, Vanessa}, title = {Charakterisierung der Serin-/Threonin-Proteinkinase SRPK3 in Drosophila melanogaster und Phosphorylierungsstudien an Synapsin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-27806}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In einer vorangegangenen Arbeit konnte eine hypomorphe Mutation innerhalb des Genlokus einer putativen Serin-/Threonin-Kinase als Ausl{\"o}ser der Aggregatbildung des Aktive-Zone- Proteins Bruchpilot in larvalen Motoneuronaxonen identifiziert werden (Nieratschker, 2004). Aufgrund der Homologien dieser Kinase zu SR-Proteinkinasen wurde der Name Serin- /Threonin-Proteinkinase 3 (SRPK3) vorgeschlagen. Laut urspr{\"u}nglicher Annotation der „Flybase" (http://flybase.bio.indiana.edu) codiert der Genlokus der Srpk3, der auf dem linken Arm des dritten Chromosoms innerhalb der Region 79D4 lokalisiert ist und sich {\"u}ber ca. 10,3 kb erstreckt, f{\"u}r zwei Transkripte (Srpk3-RC und Srpk3-RB). Diese beiden Transkripte haben unterschiedliche Transkriptions- und Translationsstartpunkte und unterscheiden sich in ihrem ersten kodierenden Exon, ab dem vierten Exon sind sie allerdings identisch. Das Srpk3-RCTranskript umfasst ca. 4,2 kb, das Srpk3-RB-Transkript ca. 3,8 kb. Die von diesen Transkripten kodierten Proteine bestehen aus 816 (Srpk3-RC) bzw. 749 (Srpk3-RB) Aminos{\"a}uren. Diese beiden urspr{\"u}nglich annotierten Transkripte konnten durch RT-PCR-Experimente best{\"a}tigt werden. Dabei wurde auch ein zus{\"a}tzliches, alternativ gespleißtes Exon von 159 bp entdeckt, das beiden Transkripten zugeordnet werden kann. Somit codiert der Srpk3-Genlokus f{\"u}r mindestens vier Transkripte, die Transkripte der RC/RF-Transkriptgruppe mit (Srpk3-RF) und ohne (Srpk3-RC) das alternativ gespleißte Exon und die Transkripte der RB/RETranskriptgruppe mit (Srpk3-RE) und ohne (Srpk3-RB) das alternativ gespleißte Exon. Die Existenz eines weiteren Transkriptes Srpk3-RD, die in der aktuellen Version der „Flybase" annotiert ist, konnte durch RT-PCR-Experimente nicht nachgewiesen werden. Zu Beginn dieser Arbeit lag eine hypomorphe Mutante f{\"u}r die SRPK3 schon vor (Srpk3P1; Eberle, 1995). Diese Linie tr{\"a}gt eine P-Elementinsertion innerhalb des ersten Exons der RC/RF-Transkriptgruppe, die das Leseraster dieser Transkriptgruppe zerst{\"o}rt, so dass in dieser Linie nur die RB/RE-Transkriptgruppe gebildet werden kann. Wie bereits erw{\"a}hnt, konnte diese Mutation in vorangegangenen Arbeiten bereits als der Ausl{\"o}ser der Aggregatbildung des Bruchpilot-Proteins in larvalen Motoneuronaxone, sowie einiger Verhaltensdefekte identifiziert werden (Nieratschker, 2004; Bock 2006). Diese Verhaltensdefekte {\"a}hneln stark denen, die durch einen knock-down der Bruchpilot-Expression mittels RNAi ausgel{\"o}st werden (Wagh et al., 2006; Bock, 2006), was auf eine Interaktion beider Proteine schließen l{\"a}sst. Um nun den Beweis f{\"u}hren zu k{\"o}nnen, dass tats{\"a}chlich diese Mutation die beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht, wurden Rettungsversuche durchgef{\"u}hrt. Die Srpk3-RF-cDNA war dabei in der Lage die durch die hypomorphe Mutation der SRPK3 verursachten Ph{\"a}notypen vollst{\"a}ndig, oder zumindest teilweise zu retten (vgl. auch Bock, 2006; Bloch, 2007). Damit konnte belegt werden, dass die hypomorphe Mutation der SRPK3 tats{\"a}chlich die in der Mutante Srpk3P1 beobachteten Ph{\"a}notypen verursacht. Um die durch in situ Hybridisierung erhaltenen Daten zur Lokalisation der SRPK3 im larvalen Gehirn (Nieratschker, 2004) best{\"a}tigen, sowie weitere Daten erhalten zu k{\"o}nnen, wurden Isoform-spezifische Antisera gegen die SRPK3 generiert. Diese Antiseren sind in der Lage {\"u}berexprimiertes Protein zu detektieren (Bloch, 2007), allerdings ist es mit diesen Antiseren nicht m{\"o}glich die SRPK3 in wildtypischen Pr{\"a}paraten nachzuweisen. Weitere Daten zur Lokalisation der SRPK3, die durch die Verwendung eines SRPK3-eGFPFusionsproteins erhalten wurden, zeigten, dass eine der ektopisch {\"u}berexprimierten SRPK3- Isoformen mit Bruchpilot an der Aktiven Zone kolokalisiert. Dieses Ergebnis, in Verbindung mit den durch die Mutation der SRPK3 verursachten Bruchpilot-Aggregaten in larvalen Motoneuronaxonen und den Verhaltensdefekten, gibt Hinweise auf eine m{\"o}gliche direkte Interaktion beider Proteine….}, subject = {Drosophila melanogaster}, language = {de} }