@phdthesis{Schauss2006,
  author    = {Schauß, Astrid Claudia},
  title     = {Charakterisierung des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1p mittels quantitativer hochaufl{\"o}sender Lichtmikroskopie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-17566},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Mitochondrien ver{\"a}ndern dynamisch durch ein balanciertes Verh{\"a}ltnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schl{\"u}lsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und {\"a}ußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verl{\"a}uft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubul{\"a}ren Strang an und trennt GTP-abh{\"a}ngig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung f{\"u}r die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p f{\"u}r die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschn{\"u}rungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Gr{\"o}ße der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zus{\"a}tzlich werden auch neue hochaufl{\"o}sende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Gr{\"o}ßenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsst{\"a}mmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, w{\"a}hrend in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gest{\"o}rt erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die {\"u}berwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarit{\"a}t ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsst{\"a}mmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerst{\"o}rung des Aktin-Ger{\"u}stes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zus{\"a}tzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer {\"A}hnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erf{\"u}llen.},
  subject      = {Hefeartige Pilze},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kukat2007,
  author    = {Kukat, Alexandra},
  title     = {Mitochondriale Fusions- und Fissionsvorg{\"a}nge am Modellsystem von Mega-Mitochondrien einer rho0-Zelllinie},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-26484},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2007},
  abstract  = {Viele Funktionen der Mitochondrien basieren auf Prozessen, an denen sowohl mitochondriale wie auch kernkodierte Genprodukte beteiligt sind. Durch zahlreiche Interaktionen ist der Einfluss dieser Einzelkomponenten auf das zellul{\"a}re System oftmals nur schwierig erkennbar. Mit Hilfe von rho0 -Zellen, deren Mitochondrien {\"u}ber kein eigenes Genom mehr verf{\"u}gen, kann die mitochondriale Genkomponente ausgeschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zun{\"a}chst die metabolischen, proliferativen und morphologischen Eigenschaften einer rho0-Zelllinie 143B.TK-K7 untersucht, welche durch die Expression einer mitochondrial zielgesteuerten Restriktionsendonuklease hergestellt wurde. W{\"a}hrend der Kultivierung bilden sich im Zytoplasma der 143B.TK-K7-Zellen mit fortlaufender Kultivierungszeit und zunehmenden Azidifizierung des Mediums Mega-Mitochondrien. Diese entstehen sowohl durch zahlreiche Fusionsereignisse als auch einem Schwellen durch vermehrten Wassereinfluss in die Mitochondrienmatrix. Alle Mitochondrien liegen dann als große kugelf{\"o}rmige Strukturen in der Zelle vor und nehmen somit die geringste Oberfl{\"a}che zu einem vorhandenen Volumen ein. Die Entstehung der Mega-Mitochondrien ist dabei abh{\"a}ngig von einer hohen Protonenkonzentration zus{\"a}tzlich zu einer ausreichend großen Menge an Laktat im Medium (Milchs{\"a}ure). Zudem zeigt sich, dass auch in Zellen, welche noch ein mitochondriales Genom besitzen, durch diese Bedingungen die Bildung von Mega-Mitochondrien induziert werden kann. Bei der Entstehung der Mega-Mitochondrien handelt es sich zun{\"a}chst nicht um apoptotische Vorg{\"a}nge, da durch den Austausch des aziden Mediums eine {\"a}ußerst schnelle R{\"u}ckbildung in ein, den rho0-Zellen {\"a}hnliches Mitochondriennetzwerk erfolgt. Metabolische Untersuchungen zeigen, dass f{\"u}r die R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien zu einem Netzwerk ausschließlich die im Medium vorhandene Protonenkonzentration ausreichend gering sein muss. Durch immunzytochemische Untersuchungen wurde deutlich, dass sowohl das mitochondriale Fusionsprotein MFN2 wie auch das Fissionsprotein DNM1L w{\"a}hrend der Entstehung und auch R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien in punktf{\"o}rmigen Bereichen an der {\"a}ußeren Mitochondrienmembran lokalisieren. Um zu {\"u}berpr{\"u}fen, ob die Bildung der Mega-Mitochondrien durch einer {\"U}berexpression von Proteinen der Fissionsmaschinerie verhindert wird, wurden PAGFP- bzw. EGFP-Fusionsproteine mit hFis1 und DNM1L hergestellt und in die 143B.TK-K7-Zellen transfiziert. Dabei f{\"u}hrt eine verst{\"a}rkte Expression von hFis1 zu aggregierten Mitochondrien, welche zwar anschwellen, nach einem Mediumwechsel jedoch trotzdem bestehen bleiben. Eine {\"U}berexpression von DNM1L hat keinen Einfluss auf die Entstehung und R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien. Durch Inhibierung des Tubulin- bzw. Aktin-Zytoskeletts, konnte gezeigt werden, dass eine Zerst{\"o}rung des Tubulin-Zytoskeletts auf die Entstehung und R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien keine Auswirkungen hat. Die Untersuchungen zu dem Einfluss des Aktin-Zytoskeletts zeigen, dass die Mega-Mitochondrien ringf{\"o}rmig von dem Aktin-Zytoskelett umgeben sind. Mit Hilfe von Fluoreszenzprotein-Markern f{\"u}r die {\"a}ußere und innere Mitochondrienmembran wurden die Mega-Mitochondrien als Modellsystem f{\"u}r mitochondriale Fusions- und Fissionsstudien verwendet. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit mitochondriale Fusion und Fission zum ersten Mal an lebenden Zellen direkt beobachtet werden und f{\"u}hrte nachfolgend zu der Einteilung von Fusionsvorg{\"a}ngen der Mitochondrien in einen Modus 1, bei dem eine zeitlich gekoppelte vollst{\"a}ndige Fusion von sowohl {\"a}ußerer wie auch innerer Membran geschieht und einen Modus 2, bei dem die Fusion der {\"a}ußeren Membranen ohne die Fusion der inneren Membranen erfolgt. In {\"a}hnlicher Weise kann die Fission von Mitochondrien unterteilt werden. In einem als Modus 1 bezeichneten Mechanismus beginnt die R{\"u}ckbildung der Mega-Mitochondrien zun{\"a}chst mit einer Tubulierung der Mitochondrien hin zu langen Mitochondrienschl{\"a}uchen, die einen nur geringen Durchmesser besitzen. Erst dann treten vermehrt zeitlich sehr schnell ablaufende Fissionsvorg{\"a}nge auf. Zus{\"a}tzlich wurde ein Modus 2-Mechanismus der Fission beobachtet, welcher aus einer unvollst{\"a}ndigen Fusion resultiert, bei dem die inneren Membranen noch nicht miteinander verschmolzen sind. Auf elektronenmikroskopischer Ebene finden w{\"a}hrend der Mega-Mitochondrien-Bildung drastische Ver{\"a}nderung von zwiebelringartigen Cristae hin zu einer Abnahme von inneren Membranstrukturen und der elektronendichte im Matrixraum statt. Somit ist im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine optische Beobachtung sowohl dieser Bewegungen wie auch von Fusions- und Fissionsprozessen und deren zeitlich Aufl{\"o}sung in vivo mit Hilfe der Mega-Mitochondrien gelungen.},
  subject      = {Mitochondrium},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Kukat2008,
  author    = {Kukat, Christian},
  title     = {Fusion, Fission und Nucleoids in Megamitochondrien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-30467},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2008},
  abstract  = {In rho0-Zellen, die {\"u}ber keine mitochondriale DNA (mtDNA) mehr verf{\"u}gen, entstehen w{\"a}hrend der Kultivierung Megamitochondrien durch endogene Milchs{\"a}ure-Azidifizierung des Kulturmediums. Diese Riesenorganellen bilden sich dabei durch mitochondriale Fusionsereignisse und/oder eine Hemmung der Fission. In Zellen mit mitochondrialem Genom ist es ebenso m{\"o}glich Megamitochondrien durch artifizielles Ans{\"a}uern des Kulturmediums zu induzieren. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit als Werkzeug verwendet, um Einblicke in mitochondriale Fusions- und Fissionsereignisse zu erlangen. Zun{\"a}chst wurde die Fusion mitochondrialer Matrixkompartimente mithilfe der photoaktivierbaren Variante des gr{\"u}nen fluoreszierenden Proteins (PA-GFP) untersucht. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Vermischen der Matrixkompartimente nach der Fusion ein sehr schneller Prozess ist. Die Analyse der Bildung und R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien erfolgte sowohl konfokal- als auch elektronenmikroskopisch, wobei sich zeigte, dass die Matrix der Riesenorganellen kaum mehr Cristae beinhaltet. Die R{\"u}ckbildung der Megamitochondrien zum normalen Netzwerk ist ein sehr schneller Prozess, bei dem schon nach 15 min keine vergr{\"o}ßerten Organellen mehr sichtbar sind. Dies indiziert, dass der R{\"u}ckbildungsprozess wahrscheinlich durch Ver{\"a}nderungen von verf{\"u}gbaren Proteinen durchgef{\"u}hrt wird, ohne die Induzierung von Proteinneusynthese. Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene zeigten, dass es w{\"a}hrend der R{\"u}ckbildung zur Formation von drei unterschiedlichen Mitochondrientypen kam, die sich in ihrer Morphologie stark unterschieden. Weiterhin wurden vergleichende Studien zur Bildung der Megamitochondrien durchgef{\"u}hrt, bei denen der Einfluss von Atmungsketten-Inhibitoren auf die Bildung von Milchs{\"a}ure-induzierten Riesenorganellen untersucht wurde. Die Resultate deuten f{\"u}r die Megamitochondrieninduktion auf eine Abh{\"a}ngigkeit auf ein intaktes Membranpotential hin. Immunzytochemisch wurde die endogene Lokalisation der mitochondrialen Fusions- und Fissionsproteine Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L am Modellsystem der Megamitochondrieninduktion aufgekl{\"a}rt. Es zeigte sich, dass diese Proteine punktf{\"o}rmig an der {\"a}ußeren Membran der Riesenorganellen lokalisieren Um das Modellsystem an lebenden Zellen zu nutzen, wurden Vektoren konstruiert, die fluoreszenzmarkierte Proteine der mitochondrialen Fusions- und Fissionsmaschinerie exprimierten. Hiermit konnte einerseits die Lokalisation von Mitofusin 1, Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L in lebenden Zellen nach Induktion der Megamitochondrien analysiert werden und andererseits der Einfluss der {\"U}berexpression dieser Proteine auf die Bildung der Riesenorganellen dokumentiert werden. Die Ergebnisse machten deutlich, dass nur die {\"U}berepxression von hFis1 die Bildung der Megamitochondrien verhinderte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Visualisierung und Dynamik mitochondrialer Nucleoids in lebenden Zellen. Nucleoids sind Protein-DNA-Komplexe, in denen mitochondriale Genome organisiert sind. Mit dem Farbstoff PicoGreen gelang es mtDNA in lebenden Zellen zu f{\"a}rben und Dynamikstudien der punktf{\"o}rmigen Strukturen mikroskopisch festzuhalten. W{\"a}hrend sich mtDNA im mitochondrialen Netzwerk nur marginal aufgrund stattfindender Fusions- und Fissionsereignisse bewegte kam es in den Milchs{\"a}ure-induzierten Megamitochondrien zu einer extensiven und extrem schnellen Bewegung von mitochondrialer DNA. In anschließenden Versuchen wurde der mitochondriale Transkriptions- und Verpackungsfaktor TFAM als fluoreszentes Fusionsprotein in Zellen transfiziert und Kolokalisationsstudien zeigten, dass das Fusionsprotein mit mtDNA kolokalisiert. In den Riesenorganellen pr{\"a}sentierten punktf{\"o}rmige TFAM-gef{\"a}rbte Nucleoids ein sehr dynamisches Verhalten mit schneller Bewegung. In rho0-Zellen ohne mitochondriale DNA war die TFAM-Fluoreszenz hingegen gleichm{\"a}ßig verteilt. Ein weiterer Nucleiodbestandteil ist das mitochondriale DNA-Einzelstrangbindeprotein SSBP1, welches in Megamitochondrien ebenso ein sehr dynamisches Verhalten aufwies. Eine mitochondrial-zielgesteuerte und EGFP-markierte Restriktionsendonuklease wies ebenfalls das typische, punktf{\"o}rmige Nucleoidmuster im mitochondrialen Netzwerk auf, was auf eine Interaktion mit der mtDNA schließen l{\"a}sst. In rho0-Zellen ohne mtDNA kam es jedoch zur gleichm{\"a}ßigen Verteilung des Konstruktes in den Mitochondrien. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit sowohl Einblicke in die Biologie der Megamitochondrien gewonnen, als auch Erkenntnisse {\"u}ber die Dynamik mitochondrialer Protein-DNA-Komplexe, wobei der Schwerpunkt hierbei auf einer Analyse mit Hilfe optischer Methoden lag.},
  subject      = {Mitochondrium},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Schaefer2011,
  author    = {Sch{\"a}fer, Ingo},
  title     = {Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Bei einer Vielzahl neuromuskul{\"a}rer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, k{\"o}nnen Mutationen in beiden Genomen die Ausl{\"o}ser dieser Erkrankungen darstellen. Ver{\"a}nderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Ausl{\"o}ser behandelt werden k{\"o}nnen. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste gr{\"u}n fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsf{\"a}higkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielf{\"u}hrend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung f{\"u}r die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden k{\"o}nnen. Durch eine Ans{\"a}uerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigs{\"a}ure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Gr{\"o}ße des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen f{\"u}r die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig gr{\"u}n fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt f{\"u}r die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor m{\"u}ssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine h{\"o}here Transfektionseffizienz zu erreichen.},
  subject      = {Mitochondrium},
  language  = {de}
}