@phdthesis{LalicMuelthaler2003, author = {Lalic-M{\"u}lthaler, Mio}, title = {Molekularbiologischer Nachweis und Immunologie des P60-Proteins, sowie In-vitro-Transkription PrfA-abh{\"a}ngiger bzw. -unabh{\"a}ngiger Gene von Listeria monocytogenes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-8760}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazellul{\"a}res Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems ausl{\"o}sen. In Folge seines ubiquit{\"a}ren Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegen{\"u}ber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegen{\"u}ber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche f{\"u}r die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenit{\"a}tskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Ged{\"a}chtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abh{\"a}ngig, w{\"a}hrend Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabh{\"a}ngig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verf{\"u}gbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gew{\"a}hrleisten, m{\"u}ssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in h{\"o}herer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, {\"u}ber eine Heparins{\"a}ule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivit{\"a}tsprofile. Demnach ben{\"o}tigen actA und hly f{\"u}r ihre optimale Transkription wom{\"o}glich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43).}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Huber2003, author = {Huber, Saskia}, title = {Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugeh{\"o}rigen Proteinfamilie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugeh{\"o}rige Proteinfamilie charakterisiert.}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Wagner2003, author = {Wagner, Nicole}, title = {Charakterisierung der Kernmembranproteine Lamin-B-Rezeptor und Bocksbeutel von Drosophila melanogaster}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7245}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Funktionelle Charakterisierung neuer Proteine der inneren Kernmembran von Drosophila melanogaster: Drosophila Lamin B Rezeptor (dLBR), ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran; Bocksbeutel alpha und Bocksbeutel beta, LEM-Dom{\"a}nen Proteine sowie deren potentiellen Interaktionspartner Drosophila Barrier-to-Autointegration Factor (dBAF).}, subject = {Taufliege}, language = {de} } @phdthesis{Langer2003, author = {Langer, Katharina}, title = {K+-Hom{\"o}ostase und kaliumabh{\"a}ngige Xylogenese in Populus tremula L. x Populus tremuloides Michx}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7068}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {Mit molekularbiologischen und biophysikalischen Analysen sowie immunologischen Nachweisen wurden Grundlagen des kaliumabh{\"a}ngigen Holzwachstums erforscht. Aus Holz-Kambium-Bast-Gewebe wurden mit PTK2 (Populus tremula K+ channel 2), KPT1 (K+ channel Populus tremula 1) und PtKUP1 (Populus tremula K+ uptake transporter 1) drei Volll{\"a}ngen putativer Kaliumtransporter isoliert. PTK2 ließ sich anhand der abgeleiteten Aminos{\"a}uresequenz der AKT2/3-Unterfamilie und KPT1 dem KAT1-Subtyp der Shaker-Familie zuordnen, w{\"a}hrend sich PtKUP1 in die Familie der KT/KUP/HAK-Transporter einreihte. Ein direkter Zusammenhang zwischen Kaliumtransport und holzbildenden Zellen konnte durch Verringerung der Gef{\"a}ßweiten und signifikante Schrumpfung der Streckungszone nach lokal begrenzter Applikation des Kaliumkanalblockers TEA+ sowie durch Kaliumlimitierende Bedingungen hergestellt werden. Die Transkripte von PTK2 und PTORK (Populus tremula outward rectifying K+ channel) wurden in den Leitgeweben des Stammes, dort besonders im Phloem und in Schließzellen lokalisiert. KPT1 wurde fast ausschließlich in den Schließzellen nachgewiesen. Die mRNA von PtKUP1 war ubiquit{\"a}r in geringen Mengen vorhanden. Funktionell wurde PTK2 als schwach spannungsabh{\"a}ngiger, K+-selektiver, nicht-gleichrichtender Kaliumkanal charakterisiert. Wie AKT2/3-{\"a}hnliche Kaliumkan{\"a}le, wurde PTK2 durch Protonen und spannungsabh{\"a}ngig durch Calcium geblockt. KPT1 und PtKUP1 komplementierten einen Bakterienstamm in seiner Kalium-Aufnahmedefizienz und repr{\"a}sentieren demnach Kalium-Aufnahmesysteme. In Protoplasten einer Pappel-Suspensionskultur konnte ein ausw{\"a}rtsgleichrichtender, kalium- und spannungsabh{\"a}ngiger, K+-Kanal nachgewiesen werden. Dieser Ausw{\"a}rtsgleichrichter zeigte langsame, sigmoidale Aktivierungskinetiken, {\"a}hnlich den Kaliumstr{\"o}men PTORK-exprimierender Oocyten. Des Weiteren wurde in der Suspensionskultur ein einw{\"a}rtsgleichrichtender, spannungsabh{\"a}ngiger K+-selektiver Kanal detektiert, der, wie PTK2 in Xenopus-Oocyten, spannungsabh{\"a}ngig durch Calcium geblockt wurde. Nach Zugabe extrazellul{\"a}ren C{\"a}siums kam der Einw{\"a}rtsstrom vollst{\"a}ndig zum Erliegen. F{\"u}r alle drei Kaliumkan{\"a}le der Pappel sowie den Kalium-Carrier wurden die Promotorregionen isoliert. Sie enthielten Motive f{\"u}r licht- und temperaturabh{\"a}ngige Transkription, gewebespezifische Expression im Leitgewebe, in Schließzellen und in Wurzeln, sowie hormonabh{\"a}ngige Transkription. Die Genaktivit{\"a}ten von PTORK und PTK2 wurden nach Transformation von A. thaliana mit geeigneten Promotor-GUS-Konstrukten im Phloem und Xylemparenchym von Blattstielen nachgewiesen. Erstmals f{\"u}r Pflanzen wurden mit PTORK und PTK2 Kaliumkanal-Proteine immunologisch durch Antik{\"o}rper in Phloem- und Strahlzellen w{\"a}hrend des aktiven Holzwachstums lokalisiert. W{\"a}hrend PTK2 gleichm{\"a}ßig in den Strahlzellen verteilt war, wurde im gleichen Zelltyp f{\"u}r PTORK eine polare Anordnung zu den angrenzenden Gef{\"a}ßen hin beobachtet. Um die verschiedenen Kaliumtransporter mit der kambialen Aktivit{\"a}t und dem Holzwachstum zu verkn{\"u}pfen, wurden die Expressionsprofile mit jahreszeitlichen {\"A}nderungen der Kaliumgehalte im Stamm verglichen. Die Transkriptanalyse von PTORK, PTK2, KPT1 und PtKUP1 {\"u}ber den Zeitraum eines Jahres in Stamm- und Blattknospen zeigte eine transkriptionelle Korrelation von PTORK und PTK2 mit der saisonal begrenzten Holzbildung. Ihre hohen Transkriptmengen im Herbst lassen, zusammen mit ihrer Lokalisation im Leitgewebe und ihren funktionellen Eigenschaften, auf eine Beteiligung der beiden Kaliumkan{\"a}le an Speicherungsvorg{\"a}ngen in die lebenden Mark- und Baststrahlen im Herbst schließen. Im Fr{\"u}hjahr dagegen, wenn sich die Kaliumstr{\"o}me umkehren, um „sink"-Gewebe mit Kalium zu versorgen, wird das Kalium vermutlich haupts{\"a}chlich {\"u}ber PTK2, der dann maximal exprimiert wird, aus den Strahlen und Gef{\"a}ßen zu den Meristemen in Stamm und Knospen transportiert. Die haupts{\"a}chlich in Schließzellen lokalisiert KPT1 wurde zur Knospen{\"o}ffnung transient induziert. Damit k{\"o}nnte gesichert werden, dass ausreichend osmotisch aktives Kalium f{\"u}r Zellexpansion und Stoma{\"o}ffnung in die Schließzellen gelangt. PtKUP1 war in allen Geweben w{\"a}hrend des gesamten Jahres niedrig exprimiert und sichert daher vermutlich eine Kaliumversorgung auch unter limitierenden Bedingungen. Zur Vermehrung und Schaffung neuen Pflanzenmaterials wurde eine sterile Agarkultur aus P. tremula x P. tremuloides sowie eine Pappel-Suspensionskultur aus oberirdischem, sich teilendem Sprossgewebe etabliert. Die Expressionsanalyse der Zellkultur deutete auf eine Ausstattung an Kaliumkan{\"a}len wie in Wurzelhaaren hin, mit hohen Transkriptzahlen f{\"u}r PTORK, geringer Expression von PTK2 und geringsten PtKUP1-Transkripten.}, subject = {Pappel}, language = {de} } @phdthesis{PicardMaureau2003, author = {Picard-Maureau, Marcus}, title = {Molekulare Analyse der Penetration von Foamyviren und Konstruktion und Charakterisierung von Adenovirus-Foamyvirus Hybridvektoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5445}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2003}, abstract = {In dieser Arbeit wurde zum einen die Penetration von Foamyviren (FV) unter besonderer Ber{\"u}cksichtung des FV H{\"u}llglykoproteins (Env) untersucht, zum anderen wurden Adenovirus-Foamyvirus (Ad-FV) Hybridvektoren zur Kombination der Vorteile beider Vektorsysteme konstruiert und analysiert. Das Ziel war die Herstellung von Ad-FV Vektoren mit hohen Titern, die stabil in das Genom des Wirts integrieren. {\"U}ber die Penetration von FV ist bisher wenig bekannt. Umh{\"u}llte Viren k{\"o}nnen entweder durch direkte Fusion der viralen H{\"u}lle mit der Zellmembran oder durch rezep-torvermittelte Endocytose, oft mit einem pH-abh{\"a}ngigen Fusionsschritt der viralen Membran mit der Membran intrazellul{\"a}rer Kompartimente, in Zielzellen gelangen. In dieser Studie wurde die Abh{\"a}ngigkeit der FV Env vermittelten Infektion verschie-dener FV Spezies von lysosomotropen Agenzien mit MuLV oder Prototyp FV (PFV) Pseudotypen analysiert. {\"A}hnlich wie bei Vesikul{\"a}res Stomatitis Virus Glykoprotein (VSV-G) Pseudotypen wurde die FV Env vermittelte Infektion von fast allen Agen-zien, die den endosomalen pH anheben, inhibiert. Allerdings hatte Chloroquin keine inhibitorische Wirkung auf die FV Env vermittelte Infektion im Gegensatz zu der VSV-G katalysierten, was auf einen unter-schiedlichen Penetrationsmechanismus schließen l{\"a}sst. Eine Analyse der pH-Abh{\"a}ngigkeit der FV Env Fusionsaktivit{\"a}t in einem Zell-Fusionsassay zeigte eine Induktion der Fusionsaktivit{\"a}t mit einer maximalen St{\"a}rke bei pH 5,5. Nur bei PFV Env wurde eine basale Fusionsaktivit{\"a}t bei neutralem pH detektiert. Die relativ schnelle Induktion der Fusionsaktivit{\"a}t in saurem Milieu weist auf eine Konformations{\"a}nderung des H{\"u}llglykoproteins zur Transformation in einen fusionsaktiven Status hin. Aufgrund dieser Daten kann man von einem endocytotischen, pH-abh{\"a}ngigen Penetrationsmechanismus von FV ausgehen. Zur Kombination der Vorteile von Adenoviren und FV wurde ein Ad-FV Hybridvektorsystem konstruiert um eine effizientes Werkzeug zum stabilen Gentransfer zu schaffen. Das System besteht aus adenoviralen Hochkapazit{\"a}ts- (HC-Ad) Vektoren auf Adenovirus 5 Basis, die eine selbst-inaktivierende PFV Vektor Kassette unter Kontrolle eines humanen Cytomegalovirus- (hCMV) Promotors oder des reversen Tet Transaktivator Systems (Tet) enthalten. In alle Vektoren ist eine Verst{\"a}rktes Gr{\"u}n Fluoreszierendes Protein (EGFP) Expressionskassette als Markergen integriert. Es wurden sowohl FV Vektoren, die nach der Prim{\"a}rinfektion {\"u}ber einen intrazellul{\"a}ren Transduktionsmechanismus stabil integrieren, als auch solche, die {\"u}ber einen Se-kund{\"a}rzyklus mit Hilfe extrazellul{\"a}rer Partikel stabil transduzieren k{\"o}nnen, hergestellt. Die Ad-FV Vektoren konnten mit zu herk{\"o}mmlichen HC-Ad Vektoren vergleich-baren Titern bis zu 1010 iU/ml produziert werden. In Ad-FV infizierten Zellen war die erwartete FV Proteinexpression und ihre Induzierbarkeit bei Ad-FVTet Vektoren nachweisbar. Mit diesen Vektorsystemen infizierte Zellen zeigten eine signifikant h{\"o}here persistierende Transgenexpression im Vergleich zu mit HC-Ad oder Kontroll- Ad-FV Vektoren ohne ein funktionales FV pol ORF infizierten Zellen. Eine Southern Blot Analyse von Ad-FVTet infizierten Einzelzellklonen mit persistierender EGFP Expression belegte eine stabile Integration der FV Vektor Kassette. In dieser Arbeit konnten Ad-FV Vektoren mit hohem Titer hergestellt werden, die eine, auch im Vergleich mit bisher publizierten Ad-Retrovirus Systemen, stark erh{\"o}hte Effizienz des persistenten Transgentransfers durch stabile Integration zeigten.}, subject = {Spumaviren}, language = {de} }