@phdthesis{Kwon2005,
  author    = {Kwon, Soon Hwan},
  title     = {Untersuchung zur Rolle von Notch1 in T-Zellentwicklung und Lymphomgenese},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-16909},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Notch Proteine geh{\"o}ren zu einer Familie hochkonservierter Transmembranrezeptoren, die bei Entwicklungsprozessen, beispielsweise im h{\"a}matopoetischen System, eine bedeutende Rolle spielen. So konnte eine Beteiligung von Notch und seinen Liganden bei der Differenzierung lymphatischer Zellen im Knochenmark, Thymus sowie in peripheren Organen gezeigt werden. Insbesondere unterdr{\"u}ckt Notch1 nach Ligandenbindung die Bildung von B-Zellen im Thymus und f{\"o}rdert stattdessen die Entwicklung von T-Zellen. Durch Aktivierung der \&\#947;-Sekretase wird die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne von Notch1 freigesetzt und transloziert in den Kern. Dort wirkt Notch1 zusammen mit Proteinen der CSL Familie als Transkriptionsfaktor und reguliert so die Expression von Zielgenen wie beispielsweise HES1. Weiterhin kann die Signaltransduktion von Notch1 im Zytosol durch Wechselwirkung mit Proteinen wie Numb oder Deltex1 moduliert werden. Angesichts der F{\"a}higkeit, die Proliferation unreifer Zellen aufrecht zu erhalten, kann eine aberrante Expression von Notch1 zur Entstehung von Neoplasien beitragen. Numb wird eine wichtige Rolle in der Regulation von Notch1 zugeschrieben, doch seine genaue Funktion in der T-Zellentwicklung ist unklar. Die Klonierung aller vier in der Ratte exprimierten Isoformen erlaubte erstmals deren detaillierte Charakterisierung. Die differentielle Expression und die preferentielle Interaktion von Numb i/o mit Notch1 deuten darauf hin, dass den verschiedenen Splice-Varianten nicht nur in der T-Zellentwicklung sondern auch in der Kontrolle von Notch1 unterschiedliche Funktionen zukommen. Diese Schlussfolgerung wird durch eine spezifische Expression der Numb Isoformen in humanen T-ALL Zelllinien weiter unterst{\"u}tzt. Transgene Ratten welche die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne von Notch1 (N1IC) unter der Kontrolle des proximalen lck-Promoters {\"u}berexprimieren (NICA), sind ein geeignetes Werkzeug, um die Rolle von Notch1 f{\"u}r die Genexpression und die Lymphomgenese zu untersuchen. Junge NICA-Ratten exprimieren N1IC spezifisch in Thymozyten, nicht jedoch in peripheren T-Zellen. In Folge dessen kommt es zu einer starken Expression bekannter Notch1 Zielgene, unter anderem dem pr{\"a}T\&\#945; Rezeptor. Dies wiederum f{\"u}hrt zur Substitution klassischer T-Zellrezeptor-Komplexe durch den pr{\"a}T-Zellrezeptor, was in adulten Tieren zur Entwicklung von thymischen Lymphomen beitr{\"a}gt. Die Lymphomzellen in NICA-Ratten exprimieren das N1IC-Transgen sowohl im prim{\"a}ren Tumor als auch nach Infiltration peripherer Organe. Dabei k{\"o}nnte die beobachtete Hochregulation von Notch3 ein m{\"o}glicher Mechanismus der Tumorgenese in NICA-Ratten darstellen. Um die Ursache der Lymphomgenese besser zu verstehen, wurde eine genomweite Expressionsanalyse der Tumore mittels SAGE und Affymetrix DNA-Chips durchgef{\"u}hrt. Dabei wurden zahlreiche potentiell bedeutende Gene identifiziert, welche bei der Notch1-vermittelten Lymphomgenese eine Rolle spielen k{\"o}nnten. Die Beobachtung, dass ein Teil dieser Gene auch in humanen T-ALL-Zelllinien ver{\"a}ndert ist, unterstreicht deren Bedeutung auch f{\"u}r die Pathogenese des Menschen. Eines der in NICA-Lymphomen am st{\"a}rksten ver{\"a}nderten Gene wurde bislang weder in der Literatur noch in Sequenzdatenbanken beschrieben. Dieses von uns als Nip1 bezeichnete Protein {\"a}hnelt einem Enzym aus dem Isoprenoid-Stoffwechsel und ist vor allem im Thymus exprimiert. Ein anderes interessantes Kandidatengen ist CD30, ein Transmembran-Rezeptor welcher bei Hodgkin Lymphomen beschrieben wurde. Neben T-ALL wurde auch bei Hodgkin Lymphomen eine wichtige Rolle von Notch1 berichtet. Dabei k{\"o}nnte dessen hohe Expression im Zusammenhang mit der Transformation und dem Verlust der B-Zell-Identit{\"a}t dieser Tumore stehen. Um dies n{\"a}her zu untersuchen, wurde Notch1 mittels RNAi bzw. durch {\"U}berexpression des negativen Regulators Deltex1 in Hodgkin-Zelllinien inaktiviert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterst{\"u}tzen die These, dass nach Repression der Notch1 Aktivit{\"a}t die Expression B-Zellspezifischer Marker wieder gewonnen werden kann. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine bedeutende Funktion von Notch1 bei der T-Zellentwicklung und der Entstehung von Lymphomen hin. Dabei scheint insbesondere die Interaktion mit Proteinen wie Numb und Deltex1 sowie die Regulation der Genexpression wichtig zu sein. Die gewonnenen Daten k{\"o}nnten in Zukunft einen neuen Ansatzpunkt zur Entwicklung verbesserter Strategien zur Therapie von Krebserkrankungen des h{\"a}matopoetischen System bilden.},
  subject      = {Gen notch},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Klein2005,
  author    = {Klein, J{\"o}rg},
  title     = {Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2005},
  abstract  = {Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberfl{\"a}chenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialins{\"a}ure bindende Ig{\"a}hnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazellul{\"a}re Immunoglobulin-{\"a}hnliche Dom{\"a}nen und kann {\"u}ber die {\"a}ußerste V-set Dom{\"a}ne seine Liganden: \&\#945;2,6 verkn{\"u}pfte Sialins{\"a}uren binden. CD22 hat eine Transmembrandom{\"a}ne und eine cytoplasmatische Dom{\"a}ne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente M{\"a}use zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdom{\"a}ne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdom{\"a}ne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Ph{\"a}notyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adh{\"a}sions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenh{\"a}ngen. Der „Targeting" Vektor f{\"u}r die „Gene Targeting" Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Urspr{\"u}nglich wurde ein „Targeting" Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir f{\"u}r ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchim{\"a}re M{\"a}use erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie f{\"u}r neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verl{\"a}ngerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5'-Richtung verl{\"a}ngert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erh{\"o}hen, durchgef{\"u}hrt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot best{\"a}tigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten f{\"u}nf chim{\"a}re Tiere gewonnen werden. Ein 80 \%ig chim{\"a}res M{\"a}nnchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie f{\"u}r die Gene Targeting Experimente f{\"u}r einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c M{\"a}usen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilit{\"a}t ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Dom{\"a}ne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor f{\"u}hrte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der urspr{\"u}nglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universit{\"a}t W{\"u}rzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-\&\#946; Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene n{\"a}her zu untersuchen. Von Erwin B{\"o}ttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-\&\#946; Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-\&\#946; Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Ver{\"a}nderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erh{\"o}hung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der f{\"u}r TGF-\&\#946; beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- M{\"a}use hingegen nicht beeintr{\"a}chtigt.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Gerlach2003,
  author    = {Gerlach, Judith},
  title     = {Der inhibitorische Einfluss von CD22 auf das B-Zellrezeptorsignal nach Stimulation der B-Zelle},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-7207},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2003},
  abstract  = {CD22 ist ein B-zellspezifisches Transmembranprotein der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie. Es {\"u}bernimmt zwei unterschiedliche Aufgaben. Zum einen hat CD22 eine inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal. Nach BZR-Ligation lagert sich die Tyrosin-Phosphatase SHP-1 an die cytoplasmatische Dom{\"a}ne von CD22 an, wodurch SHP-1 aktiviert wird. Durch die dephosphorylierende Aktivit{\"a}t der Phosphatase moduliert sie das BZR-Signal. Zum anderen ist CD22 ein Adh{\"a}sionsmolek{\"u}l, das in die Gruppe der Siglecs (Sialic acid-binding Ig-like lectin) geh{\"o}rt. Die N-terminale Ig-Dom{\"a}ne von CD22 weist die Bindungseigenschaften eines Lectins auf und bindet spezifisch \&\#61537;2,6-gekoppelte Sialins{\"a}ure. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die inhibitorische Wirkung von CD22 auf das BZR-Signal molekular zu definieren. Daher wurde das Substrat der an CD22 rekrutierten und aktivierten Phosphatase SHP-1 in vergleichenden Analysen von CD22-defizienten und Kontroll-B-Zellen nach BZR-Stimulation gesucht. Wir konnten zeigen, dass in CD22-defizienten B-Zellen nach BZR-Stimulation das Adaptermolek{\"u}l SLP-65, auch BLNK oder BASH genannt, fr{\"u}her und st{\"a}rker Tyrosin-phosphoryliert vorliegt, als in Kontroll-B-Zellen. Transfektionsexperimente mit der CD22-defizienten Plasmazytom-Zelllinie J558L\&\#61549;m3 wurden begonnen, um den molekularen Zusammenhang zwischen CD22, SHP-1 und SLP-65/BLNK zu best{\"a}tigen. Das in J558L\&\#61549;m3 Zellen ektopisch exprimierte CD22 wurde Tyrosin-phosphoryliert, und SHP-1 konnte mit CD22 co-pr{\"a}zipitiert werden. Jedoch war in den CD22-Transfektanten keine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK nach BZR-Stimulation im Vergleich zu untransfizierten Zellen nachweisbar. Da in unabh{\"a}ngigen Experimenten die Liganden-Bindung von CD22 als Voraussetzung f{\"u}r die inhibitorische Wirkung von CD22 deutlich wurde, etablierten wir \&\#61537;2,6 Sialins{\"a}ure- und CD22-positive J558L\&\#61549;m3 Doppeltransfektanten. Auf diesen konnte die cis-Maskierung von CD22 nachgewiesen werden. In Stimulationsexperimenten der Doppeltransfektanten wurde die reduzierte Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK in Abh{\"a}ngigkeit von CD22 in der Mehrzahl der Klone best{\"a}tigt. Allerdings mussten die Resultate in Frage gestellt werden, als in den meisten Klonen einer Kontrolltransfektion ebenfalls eine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK festgestellt wurde. Um den Einfluss von CD22 und SLP-65 auf das BZR-Signal zu kl{\"a}ren, wurden CD22- und SLP-65-defiziente M{\"a}use gekreuzt. Durch die zus{\"a}tzliche Deletion von CD22 in SLP-65-/- M{\"a}usen konnte das Ca2+-Signal nach BZR-Stimulation wieder hergestellt werden. Jedoch zeigte die weitere Analyse der doppel-defizienten M{\"a}use, dass in der Regel der Ph{\"a}notyp der SLP-65-defizienten M{\"a}use dominiert. Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass das Adaptermolek{\"u}l SLP-65/BLNK zwar ein Substrat des CD22/SHP-1 Signalweges ist, aber keine essentielle Rolle in der inhibitorischen Wirkung von CD22 {\"u}bernimmt. Weiterhin wurde der Einfluss der Ligandenbindung von CD22 auf dessen intrazellul{\"a}re, inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal untersucht. Ein synthetisches Sialoside stand zur Verf{\"u}gung, das hochspezifisch die Interaktion von CD22 mit dessen Liganden st{\"o}rt. Wurden die Zellen einer humanen B-Zelllinie in Gegenwart des Sialosids {\"u}ber den BZR stimuliert, konnte ein erh{\"o}htes Ca2+-Signal gemessen werden. Dieses Resultat erinnerte an die st{\"a}rkere Ca2+-Mobilisierung in CD22-defizienten B-Zellen. Entsprechend war die Tyrosin-Phosphorylierung von CD22 nach Vorbehandlung mit dem Sialosid in den humanen B-Zellen verringert, und weniger SHP-1 konnte mit CD22 co-pr{\"a}zipitiert werden. Mit diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass die Adh{\"a}sionsdom{\"a}ne von CD22 einen direkten, positiven Einfluss auf die intrazellul{\"a}re, inhibitorische Dom{\"a}ne von CD22 hat. Als Nebenprojekt wurde die Rolle von CD22 in knock-out M{\"a}usen des transkriptionellen Co-Aktivators BOB.1/OBF.1 untersucht. Ein Entwicklungsblock im transitionalen B-Zellstadium im Knochenmark der BOB.1/OBF.1-defizienten M{\"a}use verursacht eine deutliche Reduktion reifer B-Zellen in der Milz. Die Analyse des Knochenmarks der BOB.1/OBF.1-defizienten M{\"a}use zeigte, dass ausschließlich die Expression von CD22 auf den B-Vorl{\"a}ufer Zellen erh{\"o}ht war. Nach zus{\"a}tzlicher Deletion von CD22 in BOB.1/OBF.1-/- M{\"a}usen war nach BZR-Stimulation ein deutliches Ca2+-Signal in den doppel-defizienten B-Zellen messbar. Dieses k{\"o}nnte die normalisierte Anzahl transitionaler B-Zellen im Knochenmark und die gestiegene Anzahl reifer B-Zellen in der Milz der doppel-defizienten M{\"a}use bewirken. Allerdings waren die doppel-defizienten M{\"a}use, entsprechend den BOB.1/OBF.1-/- M{\"a}usen, nicht in der Lage, eine humorale Immunantwort einzuleiten oder Keimzentren zu bilden. Die Proliferation von CD22-defizienten B-Zellen nach LPS-Stimulation verlief unabh{\"a}ngig von der An- oder Abwesenheit von BOB.1/OBF.1. Mit den Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Differenzierungsschwierigkeiten der BOB.1/OBF.1-defizienten B-Zellen vom BZR-Signal abh{\"a}ngen. Allerdings muss das Ausbleiben der Keimzentrenbildung auf einen anderen Mechanismus zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Danzer2002,
  author    = {Danzer, Claus-Peter},
  title     = {Generierung von chim{\"a}ren M{\"a}usen mit Mutationen in der Signalleitungs-Dom{\"a}ne von CD22 und Untersuchungen zur Funktion von CD22 in Knockout-M{\"a}usen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-4966},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2002},
  abstract  = {Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialins{\"a}ure-bindende Immunglobulin-{\"a}hnliche Lectine). Mit der {\"a}ußersten der 7 extrazellul{\"a}ren Ig-{\"a}hnlichen Dom{\"a}nen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialins{\"a}ure interagieren. In der cytoplasmatischen Dom{\"a}ne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungekl{\"a}rt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerst{\"o}rte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Dom{\"a}ne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren f{\"u}r CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. F{\"u}r beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingef{\"u}hrten Mutationen vollst{\"a}ndig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chim{\"a}re Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank erm{\"o}glichte die Verl{\"a}ngerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch {\"o}ffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Ver{\"a}nderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerst{\"o}rten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalit{\"a}t des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig f{\"u}r die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialins{\"a}ure auf der selben Zelloberfl{\"a}che (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellul{\"a}ren Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialins{\"a}ure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5\% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-M{\"a}usen, aber nur ca. 4,5\% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- M{\"a}usen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialins{\"a}ure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In {\"U}bereinstimmung damit f{\"u}hrte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abh{\"a}ngiger Demaskierung. 4. FACS-F{\"a}rbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- M{\"a}usen um ca. 70-80\% gegen{\"u}ber wt-M{\"a}usen verkleinert ist. In Best{\"a}tigung fr{\"u}herer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabh{\"a}ngige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- M{\"a}usen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant st{\"a}rker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- M{\"a}usen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist.},
  subject      = {B-Lymphozyt},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Clemen2010,
  author    = {Clemen, Holger},
  title     = {Analyse der Expression und m{\"o}glicher signalinduzierender Eigenschaften des CD1d-Molek{\"u}ls der Ratte},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-65242},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2010},
  abstract  = {Wie MHC Klasse I und II-Molek{\"u}le pr{\"a}sentieren CD1d-Molek{\"u}le dem TCR Antigene, allerdings Lipide und Glykolipide und nicht Proteinfragmente. Die Entdeckung der massiven TH1- und TH2-Zytokinproduktion von Typ I-NKT-Zellen nach CD1d-vermittelter Erkennung von α-Galactosylceramid, einem aus dem Meeresschwamm gewonnenen Glykosphingolipid, weckte großes Interesse an ihrem immunregulatorischen Potential und ihrem m{\"o}glichen Nutzen f{\"u}r neue Immun- und Tumortherapien. Um die Funktion und die Bedeutung von CD1d besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die Expressionslevel der lymphatischen Gewebe der Ratte und der Maus untersucht. Hierf{\"u}r wurden die neu generierten monoklonalen Antik{\"o}rper 232 und 58/4 verwendet, die die CD1d-Molek{\"u}le von Ratte und Maus binden und so den direkten Vergleich beider Spezies erm{\"o}glichen. Sowohl die isolierten Zellen des Thymus und der Milz als auch des Lymphknotens waren in der LEW- und F344-Ratte sowie in der BALB/c-Maus schwach bis stark CD1d positiv. In der LEW-Ratte und in der F344-Ratte wiesen jeweils ca. 18\% der Milzzellen eine vergleichsweise erh{\"o}hte CD1d-Expression auf. Dabei handelte es sich in erster Linie um Marginalzonen-B-Zellen. Bestimmte Subpopulationen der Dendritischen Zellen und vermutlich Makrophagen stellten die restlichen CD1d stark positiven Populationen dar. Nur ca. 2\% der isolierten Zellen der Lymphknoten der LEW-Ratte waren stark CD1d positiv, wohingegen der LEW-Thymus gem{\"a}ß dem noch geringeren Anteil an APC kaum Zellen mit erh{\"o}hter CD1d-Expression enthielt. In der BALB/c-Maus war der Anteil CD1d stark positiver Milzzellen mit 4\% deutlich geringer als in der LEW- oder F344-Milz. Abgesehen von MZ-B-Zellen konnten in der Maus kaum Populationen mit starker CD1d-Expression in den verschiedenen F{\"a}rbungen festgestellt werden. Demnach stellt CD1d sowohl in der Ratte als auch in der Maus einen guten Marker f{\"u}r MZ-B-Zellen dar. Demgegen{\"u}ber zeigten vereinzelt kleine Populationen der Milz, des Lymphknotens und des Thymus beider Spezies eine verminderte oder gar keine CD1d-Expression. Zur Analyse m{\"o}glicher signalinduzierender Eigenschaften der verschiedenen Anti- CD1d-Antik{\"o}rper wurden ihre Effekte auf rCD1d+ Transduktanten und prim{\"a}re Zellen untersucht. 58/4 konnte im Gegensatz zu 232 spezifisch {\"u}ber Bindung an Ratten- CD1d Zelltod und Aggregatbildung in Tumor-B-Zellen des Menschen und der Maus, aber nicht in Tumor-T-Zellen, induzieren. Der zytoplasmatische Schwanz der CD1d-Molek{\"u}le scheint an der Aggregatbildung beteiligt zu sein. Die Bindung von 58/4 oder 232 f{\"u}hrte in {\"u}berlebenden rCD1d+ Raji-Zellen zu einer {\"a}hnlich starken Internalisierung der CD1d-Molek{\"u}le. W{\"a}hrend nach 5-st{\"u}ndiger Inkubation mit 232 und erneuter CD1d-F{\"a}rbung wieder die vorherige CD1d- Expression festgestellt wurde, konnte nach Inkubation mit 58/4 eine bleibende Herunterregulierung beobachtet werden. Folglich bewirkte 58/4 ein anderes bzw. st{\"a}rkeres Signal in den Zellen als 232. Diese Beobachtungen st{\"u}tzen die Signaltransduktion als m{\"o}gliche weitere Funktion der CD1d-Molek{\"u}le neben der Antigenpr{\"a}sentation und definieren die monoklonalen Antik{\"o}rper 232 und 58/4 als n{\"u}tzliche Werkzeuge f{\"u}r weitere Studien zur Analyse der molekularen Mechanismen der CD1d-vermittelten Signaltransduktion. Das Verst{\"a}ndnis solcher Mechanismen bildet wiederum die Grundlage f{\"u}r die Entwicklung neuer Therapien z. B. zur Eliminierung CD1d exprimierender Tumore.},
  subject      = {Zelltod},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Bischof2000,
  author    = {Bischof, Astrid},
  title     = {Mechanismen der TZR-abh{\"a}ngigen und -unabh{\"a}ngigen Aktivierung prim{\"a}rer T-Zellen der Ratte durch CD 28},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-875},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2000},
  abstract  = {Zur Aktivierung ruhender T-Zellen sind zwei Signale erforderlich: Eines wird antigen-abh{\"a}ngig {\"u}ber den T-Zellrezeptor (TZR) gegeben, ein zweites erfolgt {\"u}ber kostimulatorische Rezeptoren. Unter den bekannten kostimulatorischen Molek{\"u}len ist CD28 das potenteste. Die mitogene Aktivit{\"a}t einiger monoklonaler Antik{\"o}rper (mAb) spezifisch f{\"u}r CD28 der Ratte, die alle ruhenden prim{\"a}ren Ratten-T-Zellen ohne TZR-Ligation zu Proliferation und IL-2-Produktion anregen k{\"o}nnen, erlaubte, die Signalwege nach dieser direkten CD28-Stimulation und nach Kostimulation zu analysieren und zu vergleichen. Die erzielten Ergebnisse deuten auf unterschiedliche Signalwege nach Kostimulation mit TZR-Beteiligung und direkter CD28-Stimulation hin und zeigen, daß direkte CD28-Stimulation nicht die Signaltransduktion durch den TZR imitiert. Daher unterst{\"u}tzt CD28 als kostimulatorisches Molek{\"u}l nicht nur TZR-vermittelte Signaltransduktion, sondern fungiert auch als eigenst{\"a}ndiges Signalmolek{\"u}l, das spezifische mitogene Signale generiert. Diese Eigenschaft von CD28 k{\"o}nnte f{\"u}r die Art der induzierten Immunreaktion von Bedeutung sein, da das Verh{\"a}ltnis der St{\"a}rke von TZR- und CD28-Signal die funktionelle Differenzierung von T-Zellen in Th1- oder Th2-Zellen bestimmt.},
  subject      = {Antigen CD28},
  language  = {de}
}