@phdthesis{Guhling2006,
  author    = {Guhling, Ortwin},
  title     = {Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpenoide : Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21796},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekund{\"a}rmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikul{\"a}re Wachsbestandteile im prim{\"a}ren Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzfl{\"a}cheneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenph{\"a}notypen in Erscheinung: Der Glossy-Ph{\"a}notyp ist frei von epikutikul{\"a}ren Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps von fadenf{\"o}rmigen epikutikul{\"a}ren Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Ph{\"a}notyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikul{\"a}rem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikul{\"a}ren Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Ph{\"a}notyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit h{\"o}here Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56\% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der fr{\"u}hen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Ph{\"a}notyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgef{\"u}hrt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer t{\"a}glichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenf{\"o}rmigen Wachskristalle in der fr{\"u}hen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die f{\"u}r die Biosynthese des kutikul{\"a}ren Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Ph{\"a}notyp beschr{\"a}nkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps {\"u}berein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die f{\"u}r die Bildung kutikul{\"a}rer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikul{\"a}ren Triterpenen {\"u}ber die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenz{\"a}hnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach \&\#946;-Amyrin und best{\"a}tigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans f{\"u}r die katalytische Funktionalit{\"a}t dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt f{\"u}r ein tieferes Verst{\"a}ndnis der Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als \&\#946;-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Ph{\"a}notyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit \&\#945;-, \&\#946;- und \&\#948;-Amyrin gleich drei Triterpene in gr{\"o}ßeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tats{\"a}chlichen Relevanz der klonierten OSCs f{\"u}r die Biosynthese dieser kutikul{\"a}ren Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.},
  subject      = {Rizinus},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Riedel2004,
  author    = {Riedel, Michael},
  title     = {Rutschige Oberfl{\"a}chen von karnivoren Kannenpflanzen (Nepenthaceae) : Physikalisch-chemische Eigenschaften und mikroskopische Struktur epikutikul{\"a}rer Wachskristalle von Nepenthes alata, N. albomarginata und N. intermedia},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-9467},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2004},
  abstract  = {Pflanzen der Gattung Nepenthes decken einen erheblichen Anteil ihres N{\"a}hrstoffbedarfs durch den Fang und die Verdauung tierischer Beute, insbesondere von Insekten. Als Fangorgane dienen kannenf{\"o}rmig umgewandelte Blattspreiten. Die Kanneninnenseiten sind in einer breiten Zone dicht mit epikutikul{\"a}ren Wachskristallen besetzt. Die Oberfl{\"a}chen dieser so genannten Gleitzone sind extrem rutschig f{\"u}r die meisten Insekten und spielen eine zentrale Rolle beim Fang und der Zur{\"u}ckhaltung der Beute in der Kanne. Fr{\"u}here Untersuchungen beschrieben die Kristalle dabei als extrem fragil, wodurch diese unter der mechanischen Belastung eines Insekts leicht abrechen und somit der Kontakt zur Pflanzenoberfl{\"a}che verloren geht. Um diese Hypothese zu {\"u}berpr{\"u}fen und den Mechanismus der Rutschigkeit verstehen zu k{\"o}nnen, hatte die vorliegende Arbeit zum Ziel, sowohl die strukturellen als auch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Wachskristalle in den Kannen von drei Nepenthes-Arten vergleichend zu charakterisieren. Diese Eigenschaften k{\"o}nnen jedoch nur dann bewertet werden, wenn die chemische Zusammensetzung der Wachskristalle verl{\"a}sslich bestimmt werden kann. Um die gaschromatographische Trennung und massenspektrometrische Analyse der Komponenten zu erleichtern, werden hydroxyl-haltige Verbindungen h{\"a}ufig durch eine Derivatisierung mit N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) in die entsprechenden Trimethylsilyl-Ether bzw. -Ester {\"u}berf{\"u}hrt. Dabei k{\"o}nnen jedoch auch unerw{\"u}nschten Nebenreaktionen carbonyl-haltiger Verbindungen auftreten, die eine quantitative Analyse der urspr{\"u}nglichen Komponenten erschweren. Im ersten Teil dieser Arbeit ergab die {\"U}berpr{\"u}fung der Derivatisierungsreaktion, dass aliphatische Aldehyde mit BSTFA zu cis-trans isomeren Alkenyl-Trimethylsilyl-Ethern und Alkenyl-Acetamid-Addukten reagierten. Weiterhin bildeten sich aus Aldehyden und prim{\"a}ren Alkoholen unter den gegebenen Bedingungen, cis-trans isomere Alkenyl-Alkyl-Ether. Es konnte gezeigt werden, dass eine verl{\"a}ssliche und quantitative Bestimmung der urspr{\"u}nglich vorhandenen Aldehyd- und Alkoholmengen nur unter einer Quantifizierung der in den resultierenden Nebenprodukten gebundenen Mengen m{\"o}glich war. Im zweiten Teil dieser Arbeit zeigten rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen an den Gleitzonenoberfl{\"a}chen von drei Nepenthes-Arten, dass die epikutikul{\"a}ren Wachskristalle ein Netzwerk aus glattrandigen Pl{\"a}ttchen bilden und senkrecht aus den Oberfl{\"a}chen herausstehen. Es wurden Methoden etabliert, die eine mechanische Pr{\"a}paration der Wachs-kristalle von den Gleitzonenoberfl{\"a}chen erlaubten. Dabei zeigten die Kristalle eine hohe strukturelle Integrit{\"a}t. Die Beprobungsstrategien erwiesen sich als selektiv f{\"u}r die epikutiku-l{\"a}ren Wachse und somit f{\"u}r die Schnittstelle der Pflanze-Insekten-Wechselwirkung. Die anschließenden chemischen Analysen zeigten deutliche Gradienten zwischen den Zusammen-setzungen der epikutikul{\"a}ren und intrakutikul{\"a}ren Wachskompartimente. Die epikutikul{\"a}ren Kristalle bestanden aus Mischungen aliphatischer Komponenten und waren von sehr lang-kettigen Aldehyden dominiert. Triacontanal war in allen F{\"a}llen die Hauptkomponente und weitgehend f{\"u}r die Kristallbildung verantwortlich. Diese Ergebnisse quantifizierten erstmalig direkt die Zusammensetzung epikutikul{\"a}rer Wachskristalle und best{\"a}tigten die f{\"u}r deren Bildung urspr{\"u}ngliche Hypothese einer spontanen Phasentrennung eines hochkonzentrierten Bestandteils. Die schlechte L{\"o}slichkeit der Kristalle von verschiedenen Nepenthes-Arten in Chloroform wies zudem darauf hin, dass sie polymere Formen der Aldehyde beinhalteten. Diese Vermutung konnte im dritten Teil dieser Arbeit durch ATR-FTIR-spektroskopische Untersuchungen best{\"a}tigt werden. Die Kombination dieser Analysetechnik mit einer der mechanischen Beprobungsstrategien zeigte, dass weder isolierte Kristalle, noch Kristalle auf nativen Oberfl{\"a}chen, monomere Aldehyde beinhalteten. Diese konnten jedoch durch Tempe-raturerh{\"o}hung oder L{\"o}sen in Chloroform unter erh{\"o}hter Temperatur freigesetzt werden. Auf Grund charakteristischer Absorptionseigenschaften, der molekularen Anordnung sowie dem Phasenverhalten der beteiligten Komponenten konnte geschlossen werden, dass die Aldehyde in nativen Kristallen in Form von Polyacetalen vorliegen. Dies l{\"a}sst vermuten, dass die epikutikul{\"a}ren Wachskristalle dadurch nicht nur thermisch und chemisch, sondern auch mechanisch verst{\"a}rkt werden. Werden alle Daten zusammengefasst, k{\"o}nnen die strukturellen sowie physikalisch-chemischen Eigenschaften der epikutikul{\"a}ren Wachskristalle auf den Gleitzonenoberfl{\"a}chen verschiedener Nepenthes-Arten im Kontext ihrer {\"o}kologischen Funktion neu beurteilt werden. Auf diesen Ergebnissen basierend kann die Hypothese aufgestellt werden, dass die Kristalle im Kr{\"a}ftebereich, den ein Haftorgan eines Insektes auf sie aus{\"u}bt, mechanisch stabil sind und somit andere Mechanismen die Rutschigkeit verursachen.},
  subject      = {Kannenpflanze},
  language  = {de}
}