@phdthesis{Polzin2001, author = {Polzin, Silke}, title = {Lebensaltersch{\"a}tzung aus biologischem Material anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-2999}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2001}, abstract = {Neben der Frage nach dem Lebensalter als Kriterium zur Identifizierung unbekannter Leichen und menschlicher {\"U}berreste, wird der Bedarf einer Alterssch{\"a}tzung an lebenden Personen derzeit immer gr{\"o}ßer. Hinzu kommt die Hoffnung, aus Spuren R{\"u}ckschl{\"u}sse auf das Alter des Spurenlegers ziehen zu k{\"o}nnen. Ziel dieser Arbeit war es, aus verschiedenen biologischen Materialien das Alter anhand der 4.977 bp-Deletion in menschlicher mitochondrialer DNA absch{\"a}tzen zu k{\"o}nnen, wobei der Schwerpunkt auf Material von lebenden Personen lag. Hierzu wurde mit Hilfe geeigneter DNA-Extraktionsmethoden aus verschiedenen Gewebearten, ven{\"o}sem Vollblut, Mundschleimhautabstrichen und Haarwurzeln ausreichend DNA guter Qualit{\"a}t gewonnen. Die Schwierigkeit dieser Untersuchung lag in der Erm{\"o}glichung einer Quantifizierungsmethode zur Erfassung der 4.977 bp-Deletion. Dieses Problem wurde, nach der Wahl optimaler Primer und Amplifizierung spezifischer DNA-Fragmente, f{\"u}r die deletierte und die normale mtDNA unter optimierten PCR-Bedingungen im Multi-plex-Ansatz, mit Hilfe der Kapillarelektrophorese gel{\"o}st. Mit ihr konnte der Anteil der 4.977 bp-deletierten und der normalen mtDNA durch die computeranalysierten Peakfl{\"a}chen der beiden Fragmente bestimmt und miteinander in Verh{\"a}ltnis gesetzt werden. Dieses Verh{\"a}ltnis wurde durch den Quotienten IDel/INorm ausgedr{\"u}ckt. Die gewonnenen Ergebnisse wurden anschließend ausgedehnten statistischen Erhebungen unterzogen. Die 4.977 bp-Deletion zeigte in allen untersuchten Materialien eine eindeutige Altersabh{\"a}ngigkeit. Dies wurde an der Zunahme des Quotienten IDel/INorm mit steigendem Alter ersichtlich. F{\"u}r die verschiedenen Gewebearten war die Abh{\"a}ngigkeit dieser Deletion vom Alter bereits aus der Literatur bekannt. Im Blut wurde diese jedoch erstmalig gezeigt, ebenso wie in den Mundschleimhautabstrichen, die bisher noch nie f{\"u}r Untersuchungen der 4.977 bp-Deletion herangezogen wurden. In den Haarwurzeln konnte die Deletion nicht nachgewiesen werden. Auff{\"a}llig war hierbei, dass die Altersabh{\"a}ngigkeit von Material zu Material unterschiedlich ausgepr{\"a}gt war. Der gr{\"o}ßte Anteil deletierter mtDNA fand sich im Gehirngewebe, gefolgt von Skelettmuskulatur, Herz, Lunge, Milz, Niere Leber und Haut. F{\"u}r diese unterschiedliche Akkumulierung der 4.977 bp-Deletion finden sich zwei m{\"o}gliche Erkl{\"a}rungsans{\"a}tze, die Theorie einer unterschiedlichen Mitoserate und die einer unterschiedlichen Stoffwechselaktivit{\"a}t, die beide die gewonnene Rangfolge best{\"a}tigen. Des Weiteren wurde eine Abh{\"a}ngigkeit der 4.977 bp-Deletion von der in die PCR eingesetzten DNA-Menge festgestellt. Dieser Effekt muss im Zusammenhang mit der unterschiedlichen Amplifizierungseffizienz der beiden relevanten DNA-Fragmente gesehen werden, wodurch jedoch die Einschr{\"a}nkungen der angewandten unkontrollierten Multiplex-PCR mit anschließender semi-quantitativer Detektion der Amplifikations- produkte deutlich werden. Unter Ber{\"u}cksichtigung der Einschr{\"a}nkungen gelang anhand von Perzentilentabellen eine Alterssch{\"a}tzung mit der Angabe einer Altersspanne von ungef{\"a}hr 30 Jahren. Um eine genauere Alterssch{\"a}tzung zu erreichen, w{\"a}re eine Optimierung der Methode, z. B. durch Anwendung einer real-time quantitativen PCR, und eine Einbeziehung einer noch gr{\"o}ßeren Probenzahl n{\"o}tig.}, language = {de} } @phdthesis{Schneider2002, author = {Schneider, Matthias}, title = {Computerunterst{\"u}tzte Auswertung in der automatisierten zweidimensionalen D{\"u}nnschichtchromatographie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-5654}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2002}, abstract = {Die vorliegende Arbeit besch{\"a}ftigt sich mit der zweidimensionalen D{\"u}nnschichtchromatographie (DC) und deren quantitativer Auswertung. Es wird auf die Grundlagen der DC eingegangen. Dar{\"u}berhinaus werden die Vorgehensweisen der quantitativen Auswertung gegen{\"u}bergestellt und bewertet. Besonders behandelt werden die nichtlinearen Regressionsmethoden. Die in dieser Arbeit verwendete Entwicklungstechnik wird erkl{\"a}rt und die Vorteile beschrieben. Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Scanner und die dazugeh{\"o}rige Software werden vorgestellt. Als Lichtquelle dient eine 30 W Deuteriumlampe, die ohne Sperrfilter betrieben wird. Dies erm{\"o}glicht die Verwendung von Licht auch im Bereich von 198-210 nm. Auf einen Betrieb der Lichtquelle im Vakuum wurde verzichtet. Die Einblendtechnik der Lichtstrahlen in den Lichtwellenleiter wurde nicht ver{\"a}ndert. Der bewegliche Teil des Scanners besteht aus einem Kreuztisch, dessen Vorschubeinheiten um 90° versetzt angebracht wurden, um die Platte in x- und in y-Richtung bewegen zu k{\"o}nnen. Die Wahl der Spindelsteigung erm{\"o}glicht eine Schrittweite von 0.1 mm im Bedarfsfall. Jede Vorschubeinheit wird durch eine eigene Steuerkarte angesprochen. Damit kann in beide Richtungen unabh{\"a}ngig voneinander verfahren werden. Die Vorschubgeschwindigkeit ist in zwei Stufen w{\"a}hlbar. Um den Intensit{\"a}tsverlust bei der Licht{\"u}bertragung gering zu halten und einen modularen Aufbau realisieren zu k{\"o}nnen, wurde als {\"U}bertragungsmedium zwischen Lampe und Platte ein Lichtleiter gew{\"a}hlt. Dieser ist in der Lage, sowohl eine als auch mehrere Wellenl{\"a}ngen zu {\"u}bertragen. Durch den Einsatz eines optimierten Faserb{\"u}ndels, das mit Wasserstoff begast wurde, um die Bildung von Farbzentren zu verhindern, kann die Alterung stark verlangsamt werden. Die D{\"a}mpfung der Lichtintensit{\"a}t innerhalb der Faser spielt durch die Verwendung kurzer Fasern nur eine untergeordnete Rolle. Als Detektionseinheit werden Photodiodenarrays verwendet, die 256 bzw. 512 Dioden besitzen. Eingebaut wird jeweils nur das vorjustierte Array, das auf eine Platine aufgebracht ist, die die Elektronik zum Auslesen sowie die M{\"o}glichkeit zur Ansteuerung des Auslesevorganges bereits enth{\"a}lt. Die Minimalkonfiguration erlaubt das Verwenden eigener, f{\"u}r den Einsatzzweck optimierter Bauteile. Die erstellte Software verarbeitet die registrierten Daten und ordnet die Signale den entsprechenden Wellenl{\"a}ngen zu. Die Rohdaten werden nach der bekannten Gleichung von Kubelka und Munk in Remissionswerte umgerechnet. Ein neues Verfahren zur Gl{\"a}ttung von zweidimensional verrauschten Daten wird eingef{\"u}hrt, mit Hilfe dessen die Signale in eine verwertbare Form {\"u}bergef{\"u}hrt werden. Hierzu wird eine Regressionsrechnung in zwei Dimensionen mittels eines Polynoms durchgef{\"u}hrt. Die Gl{\"a}ttungsbreite kann variabel f{\"u}r beide Dimensionen bestimmt werden. Die Faltungsoperation kann im Gegensatz zu bisher bekannten Verfahren auch w{\"a}hrend der Auswertung durchgef{\"u}hrt werden. Statische Faltungsoperatoren werden nicht mehr ben{\"o}tigt. Peaks werden gesucht und ihre Lage mit Hilfe einer Basisfl{\"a}che korrigiert. Diese Fl{\"a}che ber{\"u}cksichtigt Matrixeinfl{\"u}sse der Platte, Schwankungen im Lichtstrom der Lampe und {\"A}nderungen der mobilen Phase w{\"a}hrend der Entwicklung. Die transformierten und gegl{\"a}tteten Daten werden in zwei Dateien geschrieben, die sich nur in der Art der Speicherung unterscheiden, um sie mit Fremdprogrammen weiterverarbeiten zu k{\"o}nnen. Es wird die M{\"o}glichkeit untersucht, Remissionsspektren unterschiedlicher Herkunft und UV-Spektren miteinander zu vergleichen. Um auf umfangreiche existierende UV- Spektrenkataloge zur{\"u}ckgreifen zu k{\"o}nnen, wird eine M{\"o}glichkeit gesucht, mit deren Hilfe die Remissionsspektren UV-Spektren zugeordnet werden k{\"o}nnen. Ein automatisiertes Vorgehen alleine reicht nicht aus, der Eingriff des Benutzers ist unerl{\"a}ßlich. Bei Remissionsdaten findet eine nicht reproduzierbare Verschiebung der Wellenl{\"a}ngen statt, die ein direktes Inbezugsetzen verhindert. Es wird ein Auftrageschema vorgestellt, das auch f{\"u}r quantitative Analysen 2D- entwickelter Platten anwendbar ist. Zus{\"a}tzlich zu dem zu untersuchenden Gemisch werden 3 Standardgemische bekannter Konzentration und Zusammensetzung aufgetragen. Die erste Entwicklung erfolgt von gegen{\"u}berliegenden Seiten bis zur Mitte der Platte, nach Trocknen und Drehen um 90° wird die zweite Entwicklung ebenfalls beidseitig durchgef{\"u}hrt. So wird die Plattenoberfl{\"a}che optimal ausgenutzt und die Kriterien zur quantitativen Auswertung werden erf{\"u}llt. Die Leistungsf{\"a}higkeit des neu eingef{\"u}hrten Gl{\"a}ttungsalgorithmus wird gezeigt. Auf die Besonderheiten einer Auswertung anhand des Peakvolumen und nicht wie bisher anhand der Peakfl{\"a}che wird eingegangen. Ein Datensatz von aufgenommenen Spektren wird nach der Verarbeitung gezeigt. Das entwickelte System aus Hard- und Software ist in der Lage, jeden Punkt auf der Platte anzusteuern und Daten zur weiteren Auswertung in gen{\"u}gend hoher Genauigkeit zu liefern.}, subject = {D{\"u}nnschichtchromatographie}, language = {de} } @phdthesis{Brackertz2008, author = {Brackertz, Anita}, title = {Absolutquantifizierung der myokardialen Perfusion in Ruhe und unter Adenosin-induziertem Stress mittels First-Pass MR-Bildgebung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-34921}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In der Diagnostik und Therapie der KHK sind das fr{\"u}hzeitige Erkennen und die Beurteilung funktioneller Folgen atherosklerotischer Ver{\"a}nderungen von großer Bedeutung. Die First-Pass MR-Bildgebung erm{\"o}glicht Aussagen {\"u}ber die myokardiale Perfusion und damit die h{\"a}modynamische Relevanz einer Koronarstenose. In der vorliegenden Arbeit wurden quantitative Werte f{\"u}r die myokardiale Durchblutung gesunder Probanden unter Adenosin-induziertem Stress und in Ruhe unter Einsatz der Pr{\"a}bolustechnik bestimmt. Eine exakte Darstellung der arteriellen Inputfunktion wurde durch einen Kontrastmittelbolus in niedriger Dosierung erreicht, die Verwendung h{\"o}herer Kontrastmitteldosen f{\"u}hrte dagegen zu einem verbesserten Signal-zu-Rausch-Verh{\"a}ltnis im Myokard. Die Absolutwerte der myokardialen Perfusion unter Stressbedingungen und in Ruhe wie auch die myokardiale Perfusionsreserve zeigten vergleichbare Mittelwerte, wiesen aber eine geringere Streubreite im Vergleich zu fr{\"u}heren MR Studien auf und waren vergleichbar mit in PET-Studien erzielten Ergebnissen. Weiterhin wurden unter Verwendung dieser Methode Werte f{\"u}r das myokardiale Verteilungsvolumen des Kontrastmittels als wichtiger Parameter in der Differenzierung von gesundem und infarziertem Herzmuskelgewebe ermittelt und die Laufzeit der Boluspassage nach Injektion in Ruhe und unter Stress bestimmt, die zur Unterscheidung von antegrad perfundiertem und von {\"u}ber Kollateralen versorgtem Myokard dienen kann. Mit Hilfe der MRT war es auch m{\"o}glich, Unterschiede zwischen subendo- und subepimyokardialer Perfusion zu quantifizieren. Die erzielten Ergebnisse entsprechen bisher publizierten Werten, die mit anderen Modalit{\"a}ten gewonnen wurden. Der Vergleich der absoluten Perfusion bei verminderter zeitlicher Aufl{\"o}sung mit den bei hoher zeitlicher Aufl{\"o}sung gemessenen Werten ergab nur geringf{\"u}gige Abweichungen der Ergebnisse voneinander. Dadurch er{\"o}ffnet sich die M{\"o}glichkeit, durch die Zeitersparnis mehrere Schichten abwechselnd bei verschiedenen Herzschl{\"a}gen zu messen und damit eine erweiterte Abdeckung des linksventrikul{\"a}ren Myokards zu erreichen. Durch die quantitative Auswertung der First-Pass MR-Perfusionsmessung stellt die beschriebene Methode eine vielversprechende Option im Bereich der nichtinvasiven Diagnostik verschiedener myokardialer Erkrankungen dar.}, subject = {NMR-Tomographie}, language = {de} } @phdthesis{Walter2008, author = {Walter, Christina}, title = {Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-28570}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit Der postmortale Nukleins{\"a}ureabbau verl{\"a}uft unterschiedlich: w{\"a}hrend DNA im Allgemeinen als stabil angesehen wird und erst mit Einsetzen von F{\"a}ulniserscheinungen st{\"a}rkerer Degradation unterliegt, wird RNA mit dem Sistieren der Kreislauft{\"a}tigkeit relativ rasch abgebaut. Eine Reihe von Studien hat aber gezeigt, dass RNA in bestimmten Geweben eine h{\"o}here Stabilit{\"a}t besitzt als urspr{\"u}nglich angenommen. Dies k{\"o}nnte Bedeutung f{\"u}r die molekulare Medizinforschung besitzen, die auf Genexpressionsstudien in postmortalem Gewebe angewiesen ist. Außerdem k{\"o}nnte eine Quantifizierung der RNA-Degradation z.B. durch Real-time-PCR zur Eingrenzung der Leichenliegezeit genutzt werden. In dieser Studie wurde ein quantitativer Vergleich verschiedener sog. Haushaltsgene (u.a. GAPDH, ß-Actin, FASN) in Gehirngewebe mit einer Leichenliegezeit zwischen 0 und 96 Stunden und unter alternativen Ans{\"a}tzen zur reversen Transkription (oligo-(dT)-Primer mit und ohne sog. Anker, Random Hexamer Primer) durchgef{\"u}hrt. Zun{\"a}chst erfolgten systematische Untersuchungen zur Effektivit{\"a}t der RNA-Isolierung, reversen Transkription und der PCR im Hinblick auf eine m{\"o}glichst pr{\"a}zise Quantifizierung. Es zeigte sich, dass die Resultate der Real-time-PCR ein Maß f{\"u}r die urspr{\"u}nglich in der Probe vorhandene mRNA-Menge darstellen. Weiterhin stellte sich heraus, dass eine deutliche und evtl. auch zur Liegezeitbestimmung nutzbare RNA-Degradation erst nach 24h einsetzt. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Random- und oligo-(dT)-priming der reversen Transkription war dabei nicht festzustellen. Diese Ergebnisse belegen zum einen, dass RNA im fr{\"u}hen postmortalen Intervall relativ stabil ist und als Substrat f{\"u}r quantitative Untersuchungen dienen kann, zum anderen, dass ein zeitabh{\"a}ngiger Abbau besteht, der eine Eingrenzung der Leichenliegezeit z.B. mittels Grenzwerten in ein fr{\"u}hes und mittleres Postmortalintervall zul{\"a}sst.}, subject = {Quantifizierung}, language = {de} } @phdthesis{Herrmann2009, author = {Herrmann, Petra}, title = {Entwicklung und Evaluierung neuer Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37500}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen k{\"o}nnen im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, n{\"a}mlich die {\"U}berlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im {\"U}berschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit {\"u}berwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellul{\"a}r gewachsene Bakterien {\"u}ber Bindung an paramagnetische Partikel („Beads") und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gew{\"a}hlt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel \&\#61483; Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy - CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur f{\"u}r die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate f{\"u}r die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien w{\"a}hrend der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. F{\"u}r einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen" Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begr{\"u}ndet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen F{\"a}llen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellul{\"a}ren Ver{\"a}nderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten {\"u}bereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazellul{\"a}re posttranskriptionelle Mechanismen begr{\"u}ndet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.}, subject = {Listeria monocytogenes}, language = {de} } @phdthesis{Toepell2009, author = {Toepell, Andreas Daniel}, title = {Quantifizierung von kardialen Metaboliten mittels akquisitionsgewichteter 31P-MR-Spektroskopie: Optimierung der SLOOP-Auswertung}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-43644}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die 31P-MRS wird zur Diagnostik des Energiemetabolismus bei verschiedenen kardialen Erkrankungen eingesetzt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit einer Verbesserung und Vereinfachung der Quantifzierung kardialer Energiemetaboliten mittels der 31P-MRS. Durch Akquisitonsgewichtung kann eine genauere Beurteilung der Konzentrationen von PCr und ATP im gesunden Myokard durch Verbesserung der Effizienz und Sensitivit{\"a}t der 31P-MRS erreicht werden. Die Kontamination des MR-Signals durch die Brustwand wird mittels des CORRECT-SLIM-Algorithmus verringert. Eine Fallstudie am rechten Ventrikel zeigt die starke metabolische Aussagekraft der 31P-MRS vor, w{\"a}hrend und nach medikament{\"o}ser Therapie. Die 31P-MRS unter Verwendung r{\"a}umlicher S{\"a}ttigungspulse liefert einen unmittelbaren Einblick in den Energiemetabolismus des menschlichen Herzens mit einer deutlich k{\"u}rzen Nachbearbeitungszeit. Durch diese Optimierungen erm{\"o}glicht die 31P-MRS des menschlichen Herzens eine exakte Beurteilung des Energiemetabolismus im gesunden wie erkrankten Myokard.}, subject = {NMR-Tomographie}, language = {de} } @phdthesis{Fuchs2010, author = {Fuchs, Jan Christopher}, title = {Quantitative MR-Spektroskopie des menschlichen Herzens mittels CORRECT-SLIM}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49005}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die 31P-MRS erm{\"o}glicht die nicht-invasive Untersuchung des kardialen Energiestoffwechsels sowie die Absolutquantifizierung der Metaboliten des kardialen Energiestoffwechsels. Mit dem schnellen Siegeszug der MR-Bildgebung in der klinischen Routine im Bereich kardiologischer Fragestellungen konnte die MRS bis in die heutige Zeit hinein jedoch nicht Schritt halten. Bedingt durch technische Limitationen konnte der Einsatz der MR-Spektroskopie des menschlichen Herzens hier bisher noch nicht Fuß fassen. Eine Weiterentwicklung mit dem Ziel der Etablierung der MRS in der klinischen Routine w{\"u}rde der Medizin neue Wege in Diagnostik und Patientenmonitoring erm{\"o}glichen. So w{\"a}re die Entwicklung eines kombinierten MRI/MRS-Protokolles f{\"u}r ein kardiales Langzeitmonitoring bei Kindern/Jugendlichen sowie bei erwachsenen Patienten mit unterschiedlichen Herzerkrankungen eine lohnende Aufgabe. Nur sehr wenige Arbeiten konnten bisher Ergebnisse zum Energiestoffwechsel und den Verh{\"a}ltnissen und Konzentration im rechten Ventrikel liefern. Durch die Entwicklung eines verbesserten Auswertealgorithmus (CORRECT-SLIM) am Institut f{\"u}r R{\"o}ntgendiagnostik der Universit{\"a}t W{\"u}rzburg k{\"o}nnten nun erstmals neue Aussagen hierzu m{\"o}glich werden. Mit CORRECT-SLIM stellen wir erstmals ein Verfahren zur Absolutquantifizierung vor, das die Kontamination des Myokards des linken und rechten Ventrikel aus Brustwandarealen reduziert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das neue Auswerteverfahren CORRECT-SLIM (Contamination Reduction in the Reconstruction with Spectral Localization by Imaging) systematisch sowohl am linken als auch am rechten Ventrikel des Herzens anzuwenden um hierdurch neue Aussagen zum Energiestoffwechsel des gesamten Herzens zu erhalten bzw. die Entwicklung und Verbesserung der bisherigen Auswerteverfahren (SLOOP) im Bereich der 31P-MRS Untersuchungen voranzutreiben. Hierzu wurden spektroskopische Untersuchungen am Myokard gesunder und kardial erkrankter Probanden durchgef{\"u}hrt. Die kardial erkrankten Patienten wiesen alle eine Hypertrophie des linken und/oder rechten Ventrikels auf, womit ein f{\"u}r die spektroskopische Auswertung erh{\"o}htes Volumen zur Verf{\"u}gung stand, was gerade im Hinblick auf die geringe physiologische Wandst{\"a}rke des rechten Ventrikels erw{\"u}nscht war und die Festlegung der Segmentationsgrenzen erleichterte.}, subject = {Phosphor-31-NMR-Spektroskopie}, language = {de} } @phdthesis{Beer2011, author = {Beer, Meike Vanessa}, title = {Correlation of ligand density with cell behavior on bioactive hydrogel layers}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-74454}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Diese Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Quantifizierung von Zelladh{\"a}sion vermittelnden Liganden in und auf d{\"u}nnen Hydrogelschichten, die zur Oberfl{\"a}chenmodifizierung auf Biomaterialien aufgebracht wurden. Das bereits etablierte und gut charakterisierte inerte NCO-sP(EO-stat-PO) Hydrogelsystem, das eine einfache und reproduzierbare Bioaktivierung mit Peptiden erlaubt, wurde als Basis f{\"u}r diese Arbeit verwendet. Diese Hydrogele k{\"o}nnen auf zwei Weisen funktionalisiert werden. Liganden k{\"o}nnen entweder mit der Prepolymerl{\"o}sung vor der Beschichtung gemischt (Einmischmethode) oder frische Hydrogelschichten mit einer Ligandenl{\"o}sung inkubiert werden (Inkubationsmethode). Der erste Teil dieser in drei Hauptteile unterteilten Arbeit, besch{\"a}ftigte sich mit der Konzentrationsbestimmung der Liganden in der gesamten Tiefe der Hydrogelschicht, w{\"a}hrend sich der zweite Teil auf die oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung von Zelladh{\"a}sion vermittelnden Molek{\"u}len an der biologischen Grenzfl{\"a}che konzentrierte. Die Ergebnisse wurden mit Zelladh{\"a}sionskinetiken verglichen. Der dritte Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der biochemischen als auch strukturellen Nachahmung der komplexen Extrazellul{\"a}rmatrix (ECM). Das ECM Protein Fibronektin (FN) wurde {\"u}ber Zucker-Lektin Anbindung pr{\"a}sentiert und Zellverhalten auf diesen biomimetischen Oberfl{\"a}chen untersucht. Ebenfalls wurde Zellverhalten in einer dreidimensionalen Faserumgebung mit identischer Oberfl{\"a}chenchemie wie in den beiden ersten Teilen dieser Arbeit untersucht und mit der Peptidkonzentration korreliert. Insgesamt, war die Hauptfragestellung in dieser Arbeit 'Wie viel?', d.h. einerseits die Ermittlung der maximalen, als auch der f{\"u}r Zelladh{\"a}sion optimalen Ligandendichte. Im ersten praktischen Teil der vorliegenden Arbeit (Klassische Quantifizierung) wurden Liganden in der gesamten Hydrogelschicht, als auch speziell in oberen Bereichen der Schichten quantifiziert. Die Untersuchung der Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas funktionalisiert mit GRGDS und 125I-YRGDS erfolgte in Kapitel 3 mittels Radioaktivmessung. Wurden Hydrogelschichten mittels Inkubationsmethode funktionalisiert, konnte eine S{\"a}ttigung mit Liganden bei etwa 600 µg/mL ermittelt werden. Mittels Einmischmethode funktionalisierte Hydrogele erreichten keine maximale Ligandenkonzentration in den Schichten, mit dem Verh{\"a}ltnis 2/1 als maximales verwendetes Verh{\"a}ltnis. H{\"o}here Liganden zu Prepolymer Verh{\"a}ltnisse als 2/1 wurden jedoch nicht verwendet, um eine ausreichende Vernetzung der Hydrogele nicht zu gef{\"a}hrden. Zur Detektion mittels R{\"o}ntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) und Flugzeit-Sekund{\"a}rionen-Massen-spektrometrie (TOF-SIMS) (Kapitel 4) wurden eine fluorierte Aminos{\"a}ure und ein iodiertes Peptid mit den Prepolymeren in molaren Verh{\"a}ltnissen von 1/2, 1/1 und 2/1 gemischt. Beide Methoden ermittelten eine maximale Ligandenkonzentration bei Verh{\"a}ltnissen von 1/1. Zus{\"a}tzliche Liganden (2/1) f{\"u}hrten zu keiner vermehrten Anbindung. Wesentlich im Zusammenhang mit der Ligandenquantifizierung auf Biomaterialien ist, diese an der Oberfl{\"a}che, die f{\"u}r Zellen zug{\"a}nglich ist, durchzuf{\"u}hren. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung) kamen daher Methoden zum Einsatz, die Liganden ausschließlich auf der Oberfl{\"a}che quantifizierten. Zur Detektion mit Oberfl{\"a}chenplasmon-resonanz (SPR) und akustischer Oberfl{\"a}chenwellentechnologie (SAW) in Kapitel 5 musste die Standardbeschichtung der Hydrogele von Glas und Silikon auf Cystamin funktionalisierte Goldoberfl{\"a}chen {\"u}bertragen werden. Mittels Ellipsometrie und Rasterkraftmikroskopie (AFM) konnte nur eine d{\"u}nne und inhomogene Hydrogelbeschichtung nachgewiesen werden. Dennoch zeigten SPR und SAW die Unterbindung von Serum und Streptavidin (SA) Adsorption auf nicht funktionalisierten Schichten, jedoch eine spezifische und konzentrationsabh{\"a}ngige SA Bindung auf Hydrogelschichten, die mit Biocytin und GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden. Die Ligandenquantifizierung mittels Enzymgekoppeltem Immunadsorptionstest (ELISA) und Enzymgekoppelten Lektinadsorptionstest (ELLA) (Kapitel 6) wurde auf Hydrogelschichten in Wellplatten und auf Glas angewendet, die mit verschiedenen Liganden mittels Inkubation und Einmischung funktionalisiert wurden. Das Modellmolek{\"u}l Biocytin, das biotinylierte Peptid GRGDSK-biotin, das ECM Protein Fibronektin (FN), als auch die Modellzucker N-Acetyl-glukosamin (GlcNAc) und N-Acetyllaktosamin (LacNAc) konnten spezifisch in verschiedenen Konzentrationen nachgewiesen werden. Beispielhaft seien hier Schichten auf Glas genannt, die mittels Einmischmethode mit GRGDSK-biotin funktionalisiert wurden, da diese zum Vergleich in Kapitel 8 herangezogen wurden. Auf diesen Oberfl{\"a}chen wurde eine maximale Peptidkonzentration auf der Oberfl{\"a}che bei einem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5 ermittelt. Neben diesen verschiedenen Quantifzierungsmethoden ist die in vitro Analyse mit Zellen nicht zu vernachl{\"a}ssigen (Kapitel 7). Hierzu wurden Hydrogele auf Glas aufgebracht und mit GRGDS mittels Einmischmethode funktionalisiert. Durch Z{\"a}hlen adh{\"a}renter prim{\"a}rer humaner dermaler Fibroblasten (HDF) auf Mikroskopbildern wurde eine maximale Zelladh{\"a}sion bei dem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5 festgestellt. Hingegen wurde ein Verh{\"a}ltnis von 1/2 f{\"u}r optimale Zelladh{\"a}sion ermittelt, wenn Zellen zur Quantifizierung von den Hydrogelen abgel{\"o}st und im CASY® Zellz{\"a}hler quantifiziert wurden. Zus{\"a}tzlich wurde die Zellvitalit{\"a}t durch Messung intrazellul{\"a}rer Enzymaktivit{\"a}ten gemessen, jedoch konnte kein Zusammenhang zwischen Zellvitalit{\"a}t und GRGDS Konzentration hergestellt werden. Adh{\"a}rente HDFs waren in allen F{\"a}llen vital, unabh{\"a}ngig von der Ligandenkonzentration auf der Oberfl{\"a}che. Auch die Mausfibroblasten Zelllinie NIH L929 wurde auf Hydrogelen mit verschiedenen GRGDS zu Prepolymer Verh{\"a}ltnissen durch Z{\"a}hlen adh{\"a}renter Zellen auf Mikroskopbildern untersucht. Diese im Verh{\"a}ltnis zu HDFs wesentlich kleineren Mauszellen ben{\"o}tigten h{\"o}here GRGDS Konzentrationen (2/1) f{\"u}r maximale Zelladh{\"a}sion. Nach der Ligandenquantifizierung in Kapitel 3 bis 7, wurden diese Ergebnisse in Kapitel 8 miteinander verglichen. Hierzu wurden Messungen auf Hydrogelschichten verwendet, die mittels Einmischmethode funktionalisiert wurden. W{\"a}hrend die Quantifizierung mittels Radioaktivmessung in der gesamten Tiefe der Hydrogelschichten keine maximale Ligandenkonzentration ermitteln konnte, war in den oberen Bereichen der Schicht ein Maximum an Liganden bei 1/1 festzustellen (XPS, TOF-SIMS). SPR und SAW wurden zum Vergleich nicht herangezogen, da die Beschichtung auf Gold erst optimiert werden muss. Oberfl{\"a}chensensitive Quantifizierung mittels ELISA und Zelladh{\"a}sion, die lediglich die sterisch zug{\"a}nglichen Liganden auf einer Oberfl{\"a}che nachweisen, ergaben {\"u}bereinstimmend eine optimale Ligandenkonzentration f{\"u}r SA Bindung und Zelladh{\"a}sion bei einem Peptid zu Prepolymer Verh{\"a}ltnis von 1/5. Dies unterstreicht, wie wichtig der Vergleich der Methoden, als auch die Verwendung von oberfl{\"a}chensensitiven Methoden ist. Der dritten Teil dieser Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der biochemischen und strukturellen Nachahmung der komplexen extrazellul{\"a}ren Umgebung (Advanced ECM engineering), ein wichtiger Aspekt in der Biomaterialforschung, da zum gr{\"o}ßten Teil zwei-dimensionale Biomaterialien zum Einsatz kommen, die direkt mit Liganden kovalent funktionalisiert werden. Die ECM ist jedoch um ein Vielfaches komplexer und die bestm{\"o}gliche Nachahmung ist Voraussetzung f{\"u}r eine bessere Akzeptanz durch Zellen und Gewebe. In Kapitel 9 wurde eine M{\"o}glichkeit aufgezeigt, das ECM Protein FN nicht-kovalent {\"u}ber Zucker-Lektinbindungen zu immobilisieren. Ein Schichtaufbau von Hydrogel, dem darauf durch Mikrokontakt-druckverfahren (MCP) kovalent gebundenen Zucker Poly-N-Acetyllaktosamin (polyLacNAc) und den darauf nicht-kovalent gebundenen Galektin His6CGL2 und FN, konnte mit Fluoreszenzf{\"a}rbung elegant nachgewiesen werden. Optimale Konzentrationen f{\"u}r den Schichtaufbau wurden mittels ELLA/ELISA auf Hydrogelschichten ermittelt, die durch Inkubation mit dem Zucker funktionalisiert wurden. Nur der komplette Schichtaufbau konnte zufriedenstellende HDF Adh{\"a}sion vermitteln und im Vergleich zu Zellkulturpolystyrol (TCPS) Oberfl{\"a}chen konnten HDFs auf dem biomimetischen Schichtaufbau schneller adh{\"a}rieren und spreiten. Zudem wurde die Umorganisierung von auf Glas adsorbiertem FN, auf NCO-sP(EO-stat-PO) kovalent gebundenem FN und biomimetisch {\"u}ber polyLAcNAc-His6CGL2 gebundenem FN durch HDFs verglichen. Nur auf den biomimetischen Oberfl{\"a}chen schien eine Umorganisation durch die Zellen m{\"o}glich, wie sie auch in der ECM zu finden ist. Diese biomimetische und flexible Pr{\"a}sentation eines Proteins erwies sich als vielversprechende M{\"o}glichkeit eine biomimetischere Oberfl{\"a}che f{\"u}r Zellen zu schaffen, die eine optimale Biokompatibilit{\"a}t erm{\"o}glichen k{\"o}nnte. Auch die strukturelle Nachahmung der ECM ist eine vielversprechende Strategie zum Nachbau der ECM. In Kapitel 10 wurde ein Einschrittverfahren zur Herstellung synthetischer, bioaktiver und degradierbarer Faserkonstrukte durch Elektrospinnen zur Nachahmung der ECM pr{\"a}sentiert. In diesem System wurden durch Zugabe von NCO-sP(EO-stat-PO) als reaktives Additiv zu Poly(D,L-laktid-co-Glycolid) (PLGA) Fasern hergestellt, die mit einer ultrad{\"u}nnen, inerten Hydrogelschicht versehen waren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Verwendung von NCO-sP(EO-stat-PO) als Additiv die Adsorption von Rinderserumalbumin (BSA) im Vergleich zu PLGA um 99,2\% reduziert, die Adh{\"a}sion von HDFs verhindert und die Adh{\"a}sion von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) minimiert werden konnten. Spezifische Bioaktivierung wurde durch Zugabe von Peptidsequenzen zur Spinl{\"o}sung erreicht, welche kovalent in die Hydrogelschicht eingebunden werden konnten und kontrollierte Zell-Faser Interaktionen erm{\"o}glichten, Um die spezifische Zelladh{\"a}sion an solchen inerten Fasern zu erzielen, wurde GRGDS kovalent auf der Faseroberfl{\"a}che gebunden. Dies erfolgte durch Zugabe des Peptids zur Polymerl{\"o}sung vor dem Elektrospinnen. Als Negativkontrolle wurde die Peptidsequenz GRGES an die Faseroberfl{\"a}che gebunden, welche durch Zellen nicht erkannt wird. W{\"a}hrend die Verhinderung unspezifischer Proteinadsorption f{\"u}r die Peptidmodifizierten Fasern erhalten blieb, konnten HDFs lediglich auf den mit GRGDS Peptid modifizierten Fasern adh{\"a}rieren, proliferieren und nach zwei Wochen eine konfluente Zellschicht aus vitalen Zellen bilden. Zus{\"a}tzlich konnten MSCs auf GRGDS funktionalisierten Fasern adh{\"a}rieren. Liganden konnten auf Fasern quantifiziert werden, indem die ELISA Technik aus Kapitel 6 auf Faseroberfl{\"a}chen transferiert wurde. Um das Potential der biochemischen und strukturellen Nachbildung der ECM aufzuzeigen, wurden beide Ans{\"a}tze miteinander kombiniert. Die Immobilisierung von polyLacNAc auf die Hydrogelfasern durch Inkubation und der Schichtaufbau mit His6CGL2 und FN resultierte in HDF Adh{\"a}sion.}, subject = {Hydrogel}, language = {en} } @phdthesis{Blaettner2011, author = {Bl{\"a}ttner, Katrin Ayara}, title = {Quantifizierung myokardialer Fibrose in der Late Enhancement- MRT- manuell (Viewing) versus semiautomatisch (VPT3.0)}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72465}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {Die kontrastmittel- gest{\"u}tzte Late Enhancement- MRT erm{\"o}glicht die Darstellung myokardialer Ver{\"a}nderungen wie z.B. {\"O}dem, Nekrose oder Fibrose. Ziel dieser Arbeit war es die semiautomatische Late Enhancement- Quantifizierung im Programm VPT 3.0 mit der manuellen Late Enhancement- Quantifizierung im Viewing- Programm zu vergleichen. Es wurden Late Enhancement- MRT- Datens{\"a}tze von Patienten mit isch{\"a}mischen (Myokardinfarkt) bzw. nicht- isch{\"a}mischen Kardiomyopathien (Morbus Fabry, Morbus Hodgkin, Aortenklappenstenose) analysiert. Die Quantifizierung des Late Enhancement- Signals erfolgte manuell im Viewing- Programm und semiautomatisch unter Anwendung von VPT 3.0. Der Vergleich der Ergebnisse aus der manuellen Analyse und der semiautomatischen Analyse der Daten von Patienten nach Myokardinfarkt, mit kardialer Beteiligung bei Morbus Fabry und bei Z.n. anteriorer Mantelfeldbestrahlung bei Morbus Hodgkin, zeigte eine hohe {\"U}bereinstimmung sowie eine gute Korrelation der Werte beider Methoden. Eine valide Late Enhancement- Quantifizierung bei Patienten mit Aortenklappenstenose war sowohl in der manuellen, wie auch in der semiautomatischen Methode nicht m{\"o}glich. Dies ist unter anderem auf das kleinfleckige, diffus fl{\"a}chige Verteilungsmuster im Rahmen der hier auftretenden konzentrischen Hypertrophie zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Des Weiteren konnte eine geringe Intraobservervariabilit{\"a}t aufgezeigt werden. Das semiautomatische Programm VPT3.0 erm{\"o}glicht eine genaue, mit der manuellen Methode gut korrelierende, Quantifizierung von Late Enhancement bei isch{\"a}mischen und nicht- isch{\"a}mischen Kardiomyopathien. Davon ausgenommen ist die Aortenstenose.}, subject = {NMR-Tomographie}, language = {de} } @phdthesis{Fuchs2014, author = {Fuchs, Kilian}, title = {Absolutquantifizierung der myokardialen Perfusion mit hochaufl{\"o}sender MRT bei 3 Tesla}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107015}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {In den letzten Jahren hat die myokardiale MR-Perfusionsbildgebung als nichtinvasives Verfahren zur Darstellung von funktionellen Ver{\"a}nderungen des Myokards f{\"u}r die Diagnostik der KHK zunehmend an Bedeutung gewonnen. W{\"a}hrend in den letzten 20 Jahren die kardiale MRT {\"u}berwiegend bei einer Magnetfeldst{\"a}rke von 1,5 T durchge-f{\"u}hrt wurde und dies auch immer noch wird, findet aktuell eine rasante Verbreitung von MR-Systemen h{\"o}herer Feldst{\"a}rken statt. Von der neuen Hochfeldtechnik erhofft man sich vor allem, je nach Anwendung, eine deutliche Verbesserung der Bildqualit{\"a}t mit h{\"o}herer r{\"a}umlicher und zeitlicher Aufl{\"o}sung, wodurch der diagnostische Nutzen noch weiter gesteigert werden k{\"o}nnte. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels First-Pass-MR-Bildgebung bei einer Magnet-feldst{\"a}rke von 3 T quantitative Werte f{\"u}r die myokardiale Perfusion von 20 gesunden Probanden unter Ruhebedingungen bestimmt. Sowohl die erhobenen absoluten Perfusionswerte (0,859 ml/g/min im Mittel) als auch die Standardabweichung des mittleren MBF (0,298 ml/g/min) entsprechen den Messungen aus den fr{\"u}heren Publikationen dieser Arbeitsgruppe. In der Gesamtzusammenschau bisher ver{\"o}ffentlichter Perfusionsstudien zeigt sich eine relativ große Variabilit{\"a}t der publizierten Ruhefl{\"u}sse. Dabei liegt der absolute MBF dieser Arbeit im mittleren Wertebereich dieser Streubreite. Er l{\"a}sst sich auch mit den in PET-Studien ermittelten Ergebnissen in Einklang bringen, welche als Goldstandard zur Bestimmung der absoluten myokardialen Perfusion beim Menschen gelten. Die vorliegende Arbeit best{\"a}tigt die bereits in anderen 3 T-Studien untersuchten Vorteile der Hochfeld-MRT. Die h{\"o}here Magnetfeldst{\"a}rke erm{\"o}glicht durch das gr{\"o}ßere SNR eine signifikant bessere r{\"a}umliche Aufl{\"o}sung und besticht vor allem durch die hohe Bildqualit{\"a}t. Dies k{\"o}nnte bei der Erkennung kleiner, subendokardial gelegener Perfusionsdefekte sowie der Erstellung von transmuralen Perfusionsgradienten von Bedeutung sein und verspricht neben einer Reduktion von Partialvolumeneffekten auch eine Verminderung von „dark rim"-Artefakten. Um diese Vorteile entsprechend nutzen zu k{\"o}nnen, wird die Entwicklung von Methoden zur pixelweisen Bestimmung der absoluten Fl{\"u}sse und farblich kodierten Darstellung derselben in Form von Perfusionskarten ein weiterer Schritt in Richtung klinisch einsetzbare Diagnostik sein. Eine Voraussetzung hierf{\"u}r ist die Entwicklung einer exakten und sehr stabilen Bewegungskorrektur in weiterf{\"u}hrenden Studien. Durch den Wechsel zu einer h{\"o}heren Magnetfeldst{\"a}rke von 3 T und den sich daraus ergebenden Vorteilen kann das Potential der MR-Perfusionsbildgebung, insbesondere der Bestimmung quantitativer Perfusionswerte, im Bereich der nichtinvasiven KHK-Diagnostik zuk{\"u}nftig weiter gesteigert werden.}, subject = {Kernspintomographie}, language = {de} } @phdthesis{ElBashir2017, author = {ElBashir, Rasha}, title = {Development of New Mass Spectrometry-based Methods for the Analysis of Posttranslational Modifications}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-153731}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Posttranslational modifications (PTMs) play a crucial role in many cellular processes. They are reversible, dynamic, and highly regulated events that alter the properties of proteins and increase their functional diversity. The identification and quantification of PTMs are critical for deciphering the molecular mechanisms of PTMs-related biological processes and disease treatment and prevention. Two of the most common and important PTMs that regulate many protein functions are acetylation and phosphorylation. An important role of acetylation is the regulation of DNA/RNA-protein interactions. A prominent example for this are histones, whose tail regions are lysine-rich and can be highly acetylated at their N-terminal domain. In spite of the utmost importance of this PTM, methods that allow the accurate measuring the site-specific acetylation degree are missing. One of the challenges in quantifying the acetylation degree at an individual lysine residue of the histones N-termini is the occurrence of multiple lysines in close proximity. Herein, we describe the development of the "Fragment Ion Patchwork Quantification," a new mass spectrometry-based approach for the highly accurate quantification of sites-pecific acetylation degrees. This method combines 13C1-acetyl derivatization on the protein level, proteolysis by low-specificity proteases and quantification on the fragment ion level. Acetylation degrees are determined from the isotope patterns of acetylated b and y ions. We have shown that this approach allows determining the site-specific acetylation degrees of all lysine residues for all core histones of Trypanosoma brucei. In addition, we demonstrate the use of this approach to identify the substrate sites of histone acetyltransferases and to monitor the changes in acetylation of the histones of canonical nucleosome and transcription start site nucleosomes. Phosphorylation is one of the most common and most important PTMs. The analysis of the human genome showed that there are about 518 kinases and more than 500,000 phosphorylation sites are believed to exist in the cellular proteome. Protein phosphorylation plays a crucial role in signaling many different cell processes, such as intercellular communication, cell growth, differentiation of proliferation and apoptosis. Whereas MS-based identification and relative quantification of singly phosphorylated peptides have been greatly improved during the last decade, and large-scale analysis of thousands of phosphopeptides can now be performed on a routine-base, the analysis of multi-phosphorylated peptides is still lagging vastly behind. The low pKa value of phosphate group and the associated negative charge are considered the major source of the problems with the analysis of multi-phosphorylated peptides. These problems include the formation of phosphopeptide-metal complexes during liquid chromatography (e.g. Fe 3+), which leads to a drastic deterioration of the chromatographic properties of these peptides (peak tailing), the decreased ionization efficiencies of phosphorylated peptides compared to their unphosphorylated counterparts, the labile nature of phosphate during CID/HCD fragmentation, and the unsuitability of low-charged phosphopeptides for ETD fragmentation are the most important factors that hinder phosphorylation analysis by LC-MS/MS. Here we aimed to develop a method for improving the identification of multi-phosphorylated peptides as well as the localization of phosphorylation sites by charge-reversal derivatization of the phosphate groups. This method employs a carbodiimide-mediated phosphoramidation to converted the phosphates to stable aromatic phosphoramidates. This chemical modification of phosphosite(s) reversed the negative charge of the phosphate group(s) and increased the number of the positive charges within the phosphopeptide. This modification prevented the formation of phosphopeptide-metal ion complexes that dramatically decreases or completely diminishes the signal intensity of protonated phosphopeptides, specifically multi-phosphorylated peptides. Furthermore, the increased net charge the (phospho-)peptides made them suitable for ETD fragmentation, which generated a high number of fragment ions with high intensities that led to a better phosphopeptide identification and localization of phosphosite(s) with high confidence.}, subject = {LC-MS}, language = {en} } @phdthesis{Letschert2019, author = {Letschert, Sebastian}, title = {Quantitative Analysis of Membrane Components using Super-Resolution Microscopy}, doi = {10.25972/OPUS-16213}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-162139}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {The plasma membrane is one of the most thoroughly studied and at the same time most complex, diverse, and least understood cellular structures. Its function is determined by the molecular composition as well as the spatial arrangement of its components. Even after decades of extensive membrane research and the proposal of dozens of models and theories, the structural organization of plasma membranes remains largely unknown. Modern imaging tools such as super-resolution fluorescence microscopy are one of the most efficient techniques in life sciences and are widely used to study the spatial arrangement and quantitative behavior of biomolecules in fixed and living cells. In this work, direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) was used to investigate the structural distribution of mem-brane components with virtually molecular resolution. Key issues are different preparation and staining strategies for membrane imaging as well as localization-based quantitative analyses of membrane molecules. An essential precondition for the spatial and quantitative analysis of membrane components is the prevention of photoswitching artifacts in reconstructed localization microscopy images. Therefore, the impact of irradiation intensity, label density and photoswitching behavior on the distribution of plasma membrane and mitochondrial membrane proteins in dSTORM images was investigated. It is demonstrated that the combination of densely labeled plasma membranes and inappropriate photoswitching rates induces artificial membrane clusters. Moreover, inhomogeneous localization distributions induced by projections of three-dimensional membrane structures such as microvilli and vesicles are prone to generate artifacts in images of biological membranes. Alternative imaging techniques and ways to prevent artifacts in single-molecule localization microscopy are presented and extensively discussed. Another central topic addresses the spatial organization of glycosylated components covering the cell membrane. It is shown that a bioorthogonal chemical reporter system consisting of modified monosaccharide precursors and organic fluorophores can be used for specific labeling of membrane-associated glycoproteins and -lipids. The distribution of glycans was visualized by dSTORM showing a homogeneous molecule distribution on different mammalian cell lines without the presence of clusters. An absolute number of around five million glycans per cell was estimated and the results show that the combination of metabolic labeling, click chemistry, and single-molecule localization microscopy can be efficiently used to study cell surface glycoconjugates. In a third project, dSTORM was performed to investigate low-expressing receptors on cancer cells which can act as targets in personalized immunotherapy. Primary multiple myeloma cells derived from the bone marrow of several patients were analyzed for CD19 expression as potential target for chimeric antigen receptor (CAR)-modified T cells. Depending on the patient, 60-1,600 CD19 molecules per cell were quantified and functional in vitro tests demonstrate that the threshold for CD19 CAR T recognition is below 100 CD19 molecules per target cell. Results are compared with flow cytometry data, and the important roles of efficient labeling and appropriate control experiments are discussed.}, subject = {Fluoreszenzmikroskopie}, language = {en} } @phdthesis{Gubik2019, author = {Gubik, Sebastian}, title = {Quantifizierung der Myokardperfusion mittels Dual Saturation Time Perfusion Imaging}, doi = {10.25972/OPUS-17830}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-178304}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2019}, abstract = {The Dual-Echo-Sequence to quantify myocardial perfusion was presented as an alternative to the prebolus-technique. The Arterial Input Function was determined using two different methods (‚KonFactor'- and ‚IndivFactor'-Method) in order to compare the calculated myocardial perfusion values with those of the prebolus-technique. In this study, there was no concordance between the data from the prebolus-technique and the other two techniques, called ,KonFactor'- and ‚IndivFactor'-method. Consequently, the Dual-Echo-Sequence has to be investigated in further studies, especially the image aquisition problems have to be looked into thoroughly.}, subject = {Myokardperfusion}, language = {de} }