@phdthesis{Blank2009,
  author    = {Blank, Marc},
  title     = {Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 {\"U}berexpression resultiert in einer Resistenz gegen{\"u}ber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide k{\"o}nnen die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage {\"u}ber die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu sch{\"a}digen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu f{\"u}hren. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, f{\"u}hren so {\"u}ber eine Erh{\"o}hung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden M{\"o}glichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegen{\"u}ber GC-induzierter Apoptose f{\"u}hrt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. W{\"a}hrend die {\"U}berexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, f{\"u}hrte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegen{\"u}ber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Dar{\"u}ber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout M{\"a}usen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in h{\"a}matopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter M{\"a}use genutzt wurden, best{\"a}tigt werden. W{\"a}hrend der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im h{\"a}matopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.},
  subject      = {Glucocorticosteroidrezeptor},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Heck2009,
  author    = {Heck, Tobias Johannes},
  title     = {Die Rolle des 1A-Promotors in der glukokortikoidinduzierten T-Zell-Apoptose},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-40417},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Glukokortikoide (GCs) geh{\"o}ren zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorg{\"a}nge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zus{\"a}tzlich antientz{\"u}ndliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) tr{\"a}gt zu einem besseren Verst{\"a}ndnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivit{\"a}t des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. S{\"a}mtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgef{\"u}hrt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, w{\"a}hrend andere vollst{\"a}ndig resistent gegen{\"u}ber GCs erschienen. In weiterf{\"u}hrenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. F{\"u}r diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erw{\"u}nschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde {\"u}ber RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens f{\"u}hrt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erh{\"o}hte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines gr{\"u}n fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine {\"A}nderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgef{\"u}hrt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten {\"U}berlebensvorteile f{\"u}r Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgef{\"u}hrten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungekl{\"a}rt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tats{\"a}chlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tats{\"a}chlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher n{\"o}tig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Langer2009,
  author    = {Langer, Manuel},
  title     = {Analyse der Instabilit{\"a}t und Funktionalit{\"a}t des Anti-Apoptose-Proteins A1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erf{\"u}llt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilit{\"a}t und anti-apoptotische Funktion von A1 wird {\"u}ber den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt f{\"u}r diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminos{\"a}uren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilit{\"a}t und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gew{\"a}hlt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, w{\"a}hrend eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht m{\"o}glich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in St{\"a}rke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es m{\"u}ssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein f{\"u}r den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterst{\"u}tzen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilit{\"a}t als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anh{\"a}ngt und das Protein damit f{\"u}r den proteasomalen Abbau markiert.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Zeitz2009,
  author    = {Zeitz, Jonas},
  title     = {Analyse der Funktion und Lokalisation des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-37071},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2009},
  abstract  = {In multizellul{\"a}ren Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, nat{\"u}rlicher Prozess um unerw{\"u}nschte, {\"u}bersch{\"u}ssige oder besch{\"a}digte Zellen auf einem geordneten, nicht entz{\"u}ndlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen K{\"o}rper werden t{\"a}glich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegr{\"o}ße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. W{\"a}hrend es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunit{\"a}t und Tumoren kommen kann, f{\"u}hrt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschw{\"a}che oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schl{\"u}sselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. W{\"a}hrend des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Molek{\"u}le sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder geh{\"o}ren, kontrollieren die Integrit{\"a}t der Mitochondrien haupts{\"a}chlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandom{\"a}ne in der Lage an die {\"a}ußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandom{\"a}ne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazellul{\"a}re Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein" haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chim{\"a}re Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus f{\"u}hrte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chim{\"a}ren Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazellul{\"a}re Organellen vermitteln kann, jedoch f{\"u}r die Instabilit{\"a}t und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 f{\"u}r sich keine spezifische intrazellul{\"a}re Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle f{\"u}r die Stabilit{\"a}t des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.},
  subject      = {Apoptosis},
  language  = {de}
}