@article{AttiaHerdeisBraeunerOsborne2013, author = {Attia, Mohamed I. and Herdeis, Claus and Br{\"a}uner-Osborne, Hans}, title = {GABA(B)-Agonistic Activity of Certain Baclofen Homologues}, series = {Molecules}, volume = {18}, journal = {Molecules}, number = {9}, doi = {10.3390/molecules180910266}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-129690}, pages = {10266-10284}, year = {2013}, abstract = {Baclofen (1) is a potent and selective agonist for bicuculline-insensitive GABAB receptors and is used clinically as an antispastic and muscle relaxant agent. In the search for new bioactive chemical entities that bind specifically to GABAB receptors, we report here the synthesis of certain baclofen homologues, namely (R,S)-5-amino-3-arylpentanoic acid hydrochlorides (R,S)-1a-h as well as (R,S)-5-amino-3-methylpentanoic acid [(RS)-1i] to be evaluated as GABABR agonists. Compound 1a is an agonist to GABAB receptors with an EC50 value of 46 μM on tsA201 cells transfected with GABAB1b/GABAB2/Gqz5, being the most active congener among all the synthesized compounds.}, language = {en} } @article{BajdaWieckowskaHebdaetal.2013, author = {Bajda, Marek and Wieckowska, Anna and Hebda, Michalina and Guzior, Natalia and Sotriffer, Christoph A. and Malawska, Barbara}, title = {Structure-Based Search for New Inhibitors of Cholinesterases}, series = {International Journal of Molecular Sciences}, volume = {14}, journal = {International Journal of Molecular Sciences}, number = {3}, doi = {10.3390/ijms14035608}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-129423}, pages = {5608-5632}, year = {2013}, abstract = {Cholinesterases are important biological targets responsible for regulation of cholinergic transmission, and their inhibitors are used for the treatment of Alzheimer's disease. To design new cholinesterase inhibitors, of different structure-based design strategies was followed, including the modification of compounds from a previously developed library and a fragment-based design approach. This led to the selection of heterodimeric structures as potential inhibitors. Synthesis and biological evaluation of selected candidates confirmed that the designed compounds were acetylcholinesterase inhibitors with \(IC_{50}\) values in the mid-nanomolar to low micromolar range, and some of them were also butyrylcholinesterase inhibitors.}, language = {en} } @article{MontoyaPelaezSierraAlzateetal.2013, author = {Montoya Pel{\´a}ez, Guillermo L. and Sierra, Jelver A. and Alzate, Fernando and Holzgrabe, Ulrike and Ramirez-Pineda, Jos{\´e} R.}, title = {Pentacyclic triterpenes from Cecropia telenitida with immunomodulatory activity on dendritic cells}, series = {Revista Brasileira de Farmacognosia - Brazilian Journal of Pharmacognosy}, volume = {23}, journal = {Revista Brasileira de Farmacognosia - Brazilian Journal of Pharmacognosy}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-131851}, pages = {754-761}, year = {2013}, abstract = {Pentacyclic triterpenes are a large family of plant metabolites that exhibit a wide array of biological activities. The genus Cecropia, which encompasses many plant species, has been used as traditional medicine for the treatment of inflammatory diseases and is known to produce many active pentacyclic triterpenes. In this study we investigated the chemical composition of a pentacyclic triterpene fraction from the roots of Cecropia telenitida Cuatrec., Urticaceae. A novel compound, which we termed yarumic acid, and four known molecules (serjanic acid, spergulagenic acid A, 20-hydroxy-ursolic acid and goreishic acid I) were isolated and characterised. In a dendritic cell (DC)-based assay, we demonstrated that non-toxic doses of these pentacyclic triterpenes inhibited the secretion of at least one of the proinflammatory cytokines tested (IL-1 beta, IL-12p40, IL-12p70, TNF-alpha). Spergulagenic acid A also inhibited nitric oxide production in lipopolysaccharide-stimulated dendritic cell. Serjanic acid and spergulagenic acid A, which were the most potent abundant compounds in the pentacyclic triterpene fraction, showed the most activity in the dendritic cell-based assay. These results show that all pentacyclic triterpenes might contribute to the anti-inflammatory activities of C. telenitida. Moreover, yarumic acid as well as the four known pentacyclic triterpenes, can be exploited as potential immunomodulatory/anti-inflammatory agents.}, language = {en} } @article{KochCappelNockeretal.2013, author = {Koch, Oliver and Cappel, Daniel and Nocker, Monika and J{\"a}ger, Timo and Floh{\´e}, Leopold and Sotriffer, Christoph A. and Selzer, Paul M.}, title = {Molecular Dynamics Reveal Binding Mode of Glutathionylspermidine by Trypanothione Synthetase}, series = {PLoS ONE}, volume = {8}, journal = {PLoS ONE}, number = {2}, doi = {10.1371/journal.pone.0056788}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-131070}, pages = {e56788}, year = {2013}, abstract = {The trypanothione synthetase (TryS) catalyses the two-step biosynthesis of trypanothione from spermidine and glutathione and is an attractive new drug target for the development of trypanocidal and antileishmanial drugs, especially since the structural information of TryS from Leishmania major has become available. Unfortunately, the TryS structure was solved without any of the substrates and lacks loop regions that are mechanistically important. This contribution describes docking and molecular dynamics simulations that led to further insights into trypanothione biosynthesis and, in particular, explains the binding modes of substrates for the second catalytic step. The structural model essentially confirm previously proposed binding sites for glutathione, ATP and two \(Mg^{2+}\) ions, which appear identical for both catalytic steps. The analysis of an unsolved loop region near the proposed spermidine binding site revealed a new pocket that was demonstrated to bind glutathionylspermidine in an inverted orientation. For the second step of trypanothione synthesis glutathionylspermidine is bound in a way that preferentially allows \(N^1\)-glutathionylation of \(N^8\)-glutathionylspermidine, classifying \(N^8\)-glutathionylspermidine as the favoured substrate. By inhibitor docking, the binding site for \(N^8\)-glutathionylspermidine was characterised as druggable.}, language = {en} } @phdthesis{Schiebel2013, author = {Schiebel, Johannes}, title = {Structure-Based Drug Design on Enzymes of the Fatty Acid Biosynthesis Pathway}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69239}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {W{\"a}hrend die Wirkung der meisten gebr{\"a}uchlichen Antibiotika auf einer Beeintr{\"a}chtigung wichtiger bakterieller Prozesse beruht, wirken manche Substanzen durch die St{\"o}rung der Zellmembran-Struktur. Da Fetts{\"a}uren ein essentieller Bestandteil von Membran-Phospholipiden sind, stellt die bakterielle Fetts{\"a}urebiosynthese II (FAS-II) einen relativ wenig erforschten, aber dennoch vielversprechenden Angriffspunkt f{\"u}r die Entwicklung neuer Antibiotika dar. Das wichtige Antituberkulotikum Isoniazid blockiert die mykobakterielle Fetts{\"a}urebiosynthese und ruft dadurch morphologische {\"A}nderungen sowie letztlich die Lyse des Bakteriums hervor. Eine wichtige Erkenntnis war, dass Isoniazid den letzten Schritt des FAS-II Elongationszyklus inhibiert, der durch die Enoyl-ACP Reduktase katalysiert wird. Darauf aufbauend wurden mehrere Programme ins Leben gerufen, die sich zum Ziel gesetzt hatten, neue Molek{\"u}le zu entwickeln, welche dieses Protein verschiedener Pathogene hemmen. Die S. aureus Enoyl-ACP Reduktase (saFabI) ist von besonders großem Interesse, da drei vielversprechende Inhibitoren dieses Proteins entwickelt werden konnten, die momentan in klinischen Studien eingehend untersucht werden. Trotz dieser Erfolgsaussichten waren zum Zeitpunkt, als die vorliegenden Arbeiten aufgenommen wurden, keine Kristallstrukturen von saFabI {\"o}ffentlich verf{\"u}gbar. Daher war es eines der Hauptziele dieser Doktorarbeit, auf der Basis von kristallographischen Experimenten atomar aufgel{\"o}ste Modelle f{\"u}r dieses wichtige Protein zu erzeugen. Durch die Entwicklung einer verl{\"a}sslichen Methode zur Kristallisation von saFabI im Komplex mit NADP+ und Diphenylether-Inhibitoren konnten Kristallstrukturen von 17 verschiedenen tern{\"a}ren Komplexen gel{\"o}st werden. Weitere kristallographische Experimente ergaben zwei apo-Strukturen sowie zwei Strukturen von saFabI im Komplex mit NADPH und 2-Pyridon-Inhibitoren. Basierend auf der nun bekannten saFabI-Struktur konnten Molekulardynamik-Simulationen durchgef{\"u}hrt werden, um zus{\"a}tzliche Erkenntnisse {\"u}ber die Flexibilit{\"a}t dieses Proteins zu erhalten. Die so gewonnenen Informationen {\"u}ber die Struktur und Beweglichkeit des Enzyms dienten in Folge als ideale Grundlage daf{\"u}r, den Erkennungsprozess von Substrat und Inhibitor zu verstehen. Besonders bemerkenswert dabei ist, dass die verschiedenen saFabI Kristallstrukturen Momentaufnahmen entlang der Reaktionskoordinate der Ligandenbindung und des Hydrid-Transfers repr{\"a}sentieren. Dabei verschließt der so genannte Substratbindungsloop das aktive Zentrum des Enzyms allm{\"a}hlich. Die außergew{\"o}hnlich hohe Mobilit{\"a}t von saFabI konnte durch molekulardynamische Simulationen best{\"a}tigt werden. Dies legt nahe, dass die beobachteten {\"A}nderungen der Konformation tats{\"a}chlich an der Aufnahme und Umsetzung des Substrates beteiligt sind. Eine Kette von Wassermolek{\"u}len zwischen dem aktiven Zentrum und einer wassergef{\"u}llten Kavit{\"a}t im Inneren des Tetramers scheint f{\"u}r die Beweglichkeit des Substratbindungsloops und somit f{\"u}r die katalysierte Reaktion von entscheidender Bedeutung zu sein. Außerdem wurde die erstaunliche Beobachtung gemacht, dass der adaptive Substratbindungsprozess mit einem Dimer-Tetramer {\"U}bergang gekoppelt ist, welcher die beobachtete positive Kooperativit{\"a}t der Ligandenbindung erkl{\"a}ren kann. Alles in allem weist saFabI im Vergleich zu FabI Proteinen aus anderen Organismen mehrere außergew{\"o}hnliche Eigenschaften auf, die f{\"u}r die Synthese von verzweigten Fetts{\"a}uren n{\"o}tig sein k{\"o}nnten, welche wiederum f{\"u}r die {\"U}berlebensf{\"a}higkeit von S. aureus im Wirt von Bedeutung sind. Diese Erkenntnis k{\"o}nnte erkl{\"a}ren, warum S. aureus selbst bei Anwesenheit von exogenen Fetts{\"a}uren von FAS-II Inhibitoren abget{\"o}tet werden kann. Somit k{\"o}nnen die gewonnenen atomaren saFabI Modelle einen entscheidenden Beitrag zur Entwicklung neuer Hemmstoffe dieses validierten Angriffszieles leisten. Tats{\"a}chlich konnten die neuen Strukturen genutzt werden, um die Bindungsst{\"a}rken sowie die Verweilzeiten verschiedener saFabI Inhibitoren molekular zu erkl{\"a}ren. Die Struktur von saFabI im Komplex mit dem 2-Pyridon Inhibitor CG400549 hingegen enth{\"u}llte spezifische Wechselwirkungen in der geweiteten Bindetasche des S. aureus Enzyms, welche das geringe Aktivit{\"a}tsspektrum dieses derzeit klinisch erprobten Inhibitors erkl{\"a}ren. Diese Studien schaffen somit eine ideale Voraussetzung f{\"u}r die Entwicklung neuer wirksamer saFabI Inhibitoren, was am Beispiel des 4-Pyridons PT166 belegt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten außerdem die Strukturen des Enzyms KasA im Komplex mit mehreren Derivaten des Naturstoffs Thiolactomycin gel{\"o}st werden.}, subject = {Staphylococcus aureus}, language = {en} } @phdthesis{Lies2013, author = {Lies, Barbara Christiane}, title = {Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten M{\"a}usen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85499}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung f{\"u}r das vaskul{\"a}re System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht haupts{\"a}chlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in M{\"a}usen resultiert in einem vollst{\"a}ndigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-{\"a}hnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges f{\"u}r die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskul{\"a}ren Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) f{\"u}hrt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. {\"U}berraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterf{\"u}hrende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie n{\"a}hergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit besch{\"a}ftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, w{\"a}hrend sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungekl{\"a}rt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivit{\"a}t der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgef{\"u}hrt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollst{\"a}ndigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivit{\"a}t: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die St{\"a}rke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren k{\"o}nnen. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis f{\"u}r cGMP unabh{\"a}ngige Effekte nutzen sollte.}, subject = {Glatte Muskulatur}, language = {de} } @phdthesis{Grotz2013, author = {Grotz, Michael}, title = {Synthese und Charakterisierung abiotischer Foldamere und ihrer Bausteine f{\"u}r die Nutzung in biologischen Systemen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96486}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese, Charakterisierung und Untersuchung von Foldameren und ihren Untereinheiten im Rahmen des FOLDAPPI-Projekts (Foldamers against Protein-Protein Interaction). Des Weiteren wurden neuartig substituierte Chinoline dargestellt, um sie im Rahmen des SFB 630 auf ihre Hemmwirkung gegen Leishmanien und Trypanosomen zu untersuchen. Im ersten Projekt wurde ein neuartiges Monomer entwickelt, welches die Wasserl{\"o}slichkeit der Foldamere verbessern sollte. Zu diesem Zweck wurde eine zus{\"a}tzliche, hoch polare Seitenkette in den Chinolingrundk{\"o}rper eingef{\"u}hrt. Dieses modifizierte Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Um die Verbesserung der Wasserl{\"o}slichkeit gegen{\"u}ber dem zuvor verwendeten Monomer zu testen, wurde erfolgreich ein Tetramer daraus aufgebaut. Das entsch{\"u}tzte Tetramer konnte jedoch aufgrund seiner hohen Polarit{\"a}t nicht ausreichend gereinigt werden, um die abschließenden L{\"o}slichkeitsuntersuchungen durchzuf{\"u}hren. Um dieses Problem zu umgehen, wurde von der Umsetzung in L{\"o}sung auf Reaktionen an der Festphase gewechselt, was die Reinigung der Produkte wesentlich erleichtern sollte. Dabei wurde eine vom Arbeitskreis von I. Huc neu entwickelte mikrowellengest{\"u}tzte Methode verwendet. Das Referenzmolek{\"u}l mit den bisher verwendeten Seitenketten konnte so ohne Probleme synthetisiert und seine L{\"o}slichkeit in Wasser bestimmt werden. Beim neu entwickelten Monomer kam es allerdings beim Aufbau des Tetrameres zu einer Zersetzungsreaktion, weshalb das abschließende Ziel nicht erreicht werden konnte. Im zweiten Projekt wurden zwei Ziele angestrebt: Zun{\"a}chst sollte ein Weg gefunden werden, die Einf{\"u}hrung der Seitenketten an den Chinolinen erst an der festen Phase vorzunehmen, wodurch viele Syntheseschritte bei der Vorbereitung der Monomere gespart werden k{\"o}nnten. Zus{\"a}tzlich sollte eine neue Kupplungsreaktion entwickelt werden, wodurch der Entsch{\"u}tzungsschritt des zu kuppelnden Amins an der Festphase eingespart werden kann. Dadurch w{\"u}rde vor allem bei großen Foldameren das Harz geschont und die Gefahr einer Degenerierung wesentlich verringert. F{\"u}r die Kupplungsreaktion vorgesehen war ein azidfunktionalisiertes Monomer, das mittels Staudinger-Reaktion verkn{\"u}pft werden sollte. Das entsprechende Monomer konnte erfolgreich synthetisiert werden. Auch das erste Ziel, die Einf{\"u}hrung der Seitenkette an der Festphase, konnte erfolgreich durchgef{\"u}hrt werden. Leider war die Verwirklichung beider Ziele {\"u}ber die gleiche Syntheseroute nicht ohne weiteres m{\"o}glich. Da das Monomer ohne die Seitenkette deutlich hydrophiler wurde, w{\"a}re eine Trocknungsmethode bei erh{\"o}hter Temperatur von Vorteil gewesen, um gebundenes Wasser vollst{\"a}ndig zu entfernen. Da das Monomer allerdings auch eine Azidfunktion tr{\"a}gt und sich bei 130 °C explosionsartig zersetzt, war dies nicht m{\"o}glich. Allerdings gen{\"u}gen bereits geringe Spuren von Feuchtigkeit, um die Staudinger-Reaktion zu beeintr{\"a}chtigten. Deshalb konnte das zweite Projektziel nicht verwirklicht werden. Im dritten Projekt wurde die Herstellung einer großen Foldamer-Bibliothek f{\"u}r die Untersuchung der Bindungsaffinit{\"a}t gegen{\"u}ber IL-4 angestrebt. Sie sollte aus 48 Hexameren bestehen, wobei an drei Monomeren die Seitenketten variiert werden sollten, um ein breites Spektum an verschiedenen Kombinationen von Wechselwirkungen abzudecken. Dazu wurden zun{\"a}chst vier verschiedene Monomere synthetisiert, welche eine aromatisch, eine unpolare, eine anionische bzw. eine kationische Seitenkette enthielten. F{\"u}r die Kupplung der Foldamere wurde eine an die Synthese von Aminos{\"a}uresequenzen angelehnte Methode entwickelt und erfolgreich angewandt. So konnten alle 48 Foldamere erfolgreich synthetisiert und 46 von ihnen in ausreichenden Mengen f{\"u}r die Untersuchung an IL-4 gereinigt werden. Leider liegen f{\"u}r diese Bibliothek bisher keine abschließenden Ergebnisse {\"u}ber die Inhibitionseigenschaften gegen{\"u}ber IL-4 vor. Strukturell sehr {\"a}hnliche Foldamere zeigten jedoch in ersten Experimenten eine Inhibition von IL-4 was eine Wirksamkeit der neu erstellten Bibliothek vermuten l{\"a}sst. Das vierte Projekt wurde im Rahmen des SFB 630 durchgef{\"u}hrt. Hierzu wurden einige der urspr{\"u}nglich f{\"u}r andere Projekte hergestellten Foldamere ausgew{\"a}hlt, teilweise entsch{\"u}tzt bzw. an der Nitrogruppe reduziert und anschließend auf Ihre Aktivit{\"a}t gegen Leishmanien und Trypanosomen getestet. Es zeigte sich, dass das verwendete Substitutionsmuster, in den gestesteten Konzentrationen nicht gegen Leishmanien und Trypanosomen wirksam ist. Es eignet sich also nicht f{\"u}r die Erstellung einer neuen Leitstruktur gegen diese beiden Erreger. Allerdings trat im untersuchten Konzentrationsbereich auch keine Zytotoxizit{\"a}t auf, was eine interessante Information f{\"u}r die Verwendung der Foldamere und ihrer Bausteine in biologischen Systemen darstellt.}, subject = {Foldamere}, language = {de} } @phdthesis{Matz2013, author = {Matz, Ferdinand}, title = {Entwicklung von vif-Elongin-C-Interaktionsinhibitoren als neuartige HIV-Therapeutika}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-97869}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Weltweit sind {\"u}ber 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert, t{\"a}glich steigt die Zahl weiter an. Es liegt auf der Hand, dass die Forschung zur Bek{\"a}mpfung der Replikation des Virus stetig weiter gef{\"u}hrt werden muss. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen f{\"u}r einen neuartigen HIV-Therapieansatz geschaffen. Dabei steht nicht die Hemmung von Replikations-essentiellen Enzymen wie Protease, Reverse Transkriptase oder Integrase im Vordergrund, sondern die Aufrechterhaltung des humanen retroviralen Schutzes. Durch Hemmung der vif-Elongin-C-Interaktion mit Elongin-C-Inhibitoren bleibt der Organismus in der Lage, sich mithilfe von APOBEC3G auf nat{\"u}rlichem Wege vor dem HI-Virus zu sch{\"u}tzen, unabh{\"a}ngig von viralen Mutationen. Aufgrund der Tatsachen, dass die Kristallstruktur von Elongin-C und der Bindemodus von vif in der essentiellen Bindetasche des Proteins aufgekl{\"a}rt sind, konnten durch Docking-Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christoph Sotriffer in-silico Substanzen bestimmt werden, die theoretisch mit hoher Affinit{\"a}t in die Bindetasche binden und so vif aus dieser verdr{\"a}ngen. Basierend auf diesen Docking-Studien wurden im Rahmen dieser Arbeit ca. 50 potentielle Inhibitoren synthetisiert und weitere 27 Substanzen kommerziell erworben. Diese wurden anschließend zum gr{\"o}ßten Teil in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Axel Rethwilm in einer zellul{\"a}ren Testvariante auf Hemmung des APOBEC3G-Abbaus getestet. Dabei erwies sich die Substanz A19 (FM329, Abb. 7.1) als sehr effektiv. Zur Best{\"a}tigung dieses Testergebnisses wurde A19 weiterhin in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jochen Bodem auf Hemmung der Replikation der Viren untersucht. Auch hier hemmt A19 die Replikation des Virus bei einer Konzentration von 30 µM zu 100\%. Da allerdings die Hemmung des Abbaus von APOBEC3G bzw. der Replikation des Virus kein Nachweis auf die tats{\"a}chliche postulierte Interaktion zwischen dem Inhibitor und der Bindetasche des Proteins ist, wurde im weiteren Verlauf versucht diese Interaktion nachzuweisen. Dazu wurde zun{\"a}chst unter Anleitung von Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Dr. Caroline Kisker das Targetprotein exprimiert und isoliert. Damit konnten erste Versuche zur Bindungsaufkl{\"a}rung durchgef{\"u}hrt werden. Diese beliefen sich auf Mikrokalorimetrie-Experimente und Surface-Plasmon-Resonance Untersuchungen. Erste Indizien f{\"u}r eine Wechselwirkung zwischen dem Inhibitor und dem Protein konnten damit bereits ermittelt werden, ein eindeutig positives Ergebnis wurde allerdings noch nicht erzielt.}, subject = {HIV}, language = {de} } @phdthesis{Hartung2013, author = {Hartung, Andreas Walter}, title = {Entwicklung neuartiger pharmakologischer Wirkstoffe als Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems zur Behandlung des Multiplen Myeloms}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-91390}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Das Multiple Myelom (MM) zeichnet sich durch eine krankhafte Entartung der Plasmazellen im Knochenmark aus und gilt heute trotz zahlreicher Behandlungsfortschritte immer noch als unheilbar. Als attraktive Zielstrukturen f{\"u}r neue Therapiem{\"o}glichkeiten haben sich in den vergangenen Jahren „Heat-Shock"-Proteine etabliert. Diese liegen h{\"a}ufig {\"u}berexprimiert vor und sind bei der Stabilisierung mehrerer onkogener Signalwege des MM von zentraler Bedeutung. Zun{\"a}chst wurden von Pharmaunternehmen verschiedene Inhibitoren von HSP90 entwickelt, die sich in pr{\"a}klinischen MM-Studien als erfolgreich herausstellten, in klinischen Studien jedoch nur eine begrenzte Wirksamkeit zeigten, da eine Inhibition von HSP90 zu einer schnellen HSF-1-vermittelten Hochregulation der HSP70- Expression f{\"u}hrt. Dies kompensiert die Inhibition von HSP90 und f{\"u}hrt damit zu einer Abschw{\"a}chung der Anti-Tumoraktivit{\"a}t. Eine duale Hemmung von HSP90 und des HSF-1/HSP70-Systems wird daher als vielversprechende Strategie f{\"u}r eine wirksame Behandlung des MM betrachtet. Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen der klinischen Forschergruppe 216 erstellt wurde, befasst sich daher mit der Entwicklung von Inhibitoren des HSF-1/HSP70-Systems. Hierzu wurden zwei unabh{\"a}ngige Strategien verfolgt. Neben einem indirekten Ansatz, der auf einer blockierten HSP70-Expression via Inhibition des HSF-1-Signalwegs beruht, stand die direkte Inhibition von HSP70 im Fokus. Die erzielten Ergebnisse im Einzelnen: 1) In Anlehnung an den HSF-1-Inhibitor NZ28 (12) sollte untersucht werden, ob das dort enthaltene Tetrahydroisochinolin-Ger{\"u}st eine Leitstruktur f{\"u}r die Entwicklung von Hemmstoffen des HSF-1-Signalwegs darstellt. Hierzu wurde eine Reihe unterschiedlich substituierter Tetrahydroisochinolinon-Derivate hergestellt. Die Synthese erfolgte {\"u}ber eine sequenzielle Ugi-Heck-Reaktion, da hierbei drei Substituenten des Tetrahydro- isochinolin-Ger{\"u}sts hochflexibel und unabh{\"a}ngig voneinander variiert werden k{\"o}nnen und sich so leicht ein breites Spektrum verschiedener Tetrahydroisochinolinon-Derivate aufbauen l{\"a}sst. Eine Bioaktivit{\"a}tsanalyse zeigte jedoch, dass keine der so erhaltenen Verbindungen (26) die HSF-1-vermittelte HSP70-Expression zu inhibieren vermochte. Um den Einfluss des spezifischen Substitutionsmusters der via Ugi-Heck-Reaktion erhaltenen Produkte zu untersuchen, wurde außerdem eine Auswahl der als HSP70- Inhibitoren synthetisierten Tetrahydroisochinolinone (24 und 36) im HSF-1-Assay getestet. Da auch f{\"u}r diese Verbindungen keine Inhibition des Signalwegs beobachtet werden konnte, besteht Grund zur Annahme, dass substituierte Tetrahydroisochinolin-Derivate nicht als Leitstruktur f{\"u}r die Entwicklung von HSF-1-Inhibitoren geeignet sind. 2) Im Gegensatz zu den synthetisierten Tetrahydroisochinolinonen zeigten einige der als Zwischenprodukte der Ugi-Heck-Reaktion isolierten α-Acylaminocarboxamide, die durch ein Michael-System charakterisiert sind, eine Inhibition der HSF-1-vermittelten HSP70- Expression. Zwar konnten keine eindeutigen Struktur-Wirkungsbeziehungen bez{\"u}glich einzelner Substituenten abgeleitet werden, aber es zeigte sich, dass die beobachtete Bioaktivit{\"a}t nicht vom enthaltenen Michael-System abh{\"a}ngig ist. Dem Wirkprinzip der α-Acylaminocarboxamide scheint somit keine kovalente Bindung mit nukleophilen Seitenketten von Proteinen zugrunde zu liegen, was das Potenzial unspezifischer Interaktionen reduziert. 3) Bei der Ugi-Multikomponentenreaktion wurden als Carbons{\"a}urederivate auch β-Acyl-substituierte Acryls{\"a}uren eingesetzt. Dabei wurde beobachtet, dass dieser Austausch zur Bildung von pharmakologisch interessanten 2,5-Diketopiperazinderivaten (35) f{\"u}hrt. Die in nur einem Reaktionsschritt erhaltenen 2,5-DKPs zeigten eine spezifische und dosisabh{\"a}ngige antiproliferative Wirkung auf aktivierte T-Zellen, was sie als potenzielle Wirkstoffkandidaten f{\"u}r die Behandlung von unbeabsichtigten T-Zell-vermittelten Autoimmunantworten interessant macht (AG Topp). Eine Analyse der Struktur-Wirkungsbeziehungen zeigte unter anderem eine Pr{\"a}ferenz f{\"u}r trans-konfigurierte 2,5-DKPs. Die Aktivit{\"a}t der potentesten Verbindungen der syntheti- sierten Serie lag in derselben Gr{\"o}ßenordnung wie die der Positiv-Kontrolle 17-Dimethoxyaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG, 4b). 4) Ausgangspunkt f{\"u}r die Entwicklung neuartiger HSP70-Inhibitoren war das Ergebnis eines virtuellen Screenings (AG Sotriffer), das darauf abzielte die Proteinfunktion durch eine Interaktion mit dem Interdom{\"a}nen-Interface von HSP70 zu blockieren. Im ersten Schritt wurde eine diastereoselektive und hochflexible Reaktionssequenz zum virtuelle Screening-Hits (trans-24a) etabliert, mit der im zweiten Schritt eine Bibliothek verwandter Substanzen aufgebaut wurde. Gezielte strukturelle Modifikationen erlaubten dabei wesentliche Strukturelemente zu identifizieren sowie Informationen f{\"u}r die Generierung von Derivaten mit h{\"o}herer Aktivit{\"a}t zu gewinnen. Die wichtigsten Erkenntnisse dabei waren: - Ausschließlich trans-konfigurierte Tetrahydroisochinolinon-Derivate sind wirksam. - Carboxamide (Pos. 4) sind aktiver als analoge Carbons{\"a}uren. - Die Methoxyfunktion am Phenylsubstituenten in Pos.3 ist f{\"u}r die Aktivit{\"a}t wichtig, dagegen f{\"u}hrt das Entfernen der OCH3- Gruppe am Phenylring in Pos. 2 zu einer Aktivit{\"a}tssteigerung. - Eine aliphatische MeNH-Einheit am exozyklischen Amid reduziert die Aktivit{\"a}t gegen{\"u}ber Arylamidsubstituenten um eine Zehnerpotenz. Dar{\"u}ber hinaus f{\"u}hrt ein terti{\"a}rer Dimethylcarboxamid-Rest zum vollst{\"a}ndigen Aktivit{\"a}tsverlust. Zur Falsifizierung der postulierten Bindetasche wurden zus{\"a}tzlich gezielt Derivate mit sterisch anspruchsvollen Substituenten (Tetrahydronaphthyl, Phenoxyphenyl) hergestellt, die nicht in der Lage sein sollten im berechneten Bindemodus am Interdom{\"a}nen-Interface zu binden. Dabei stand das so ermittelte verf{\"u}gbare Platzangebot in Einklang mit den aufgrund der Docking-Analysen getroffenen Annahmen. Um die Enantioselektivit{\"a}t der Aktivit{\"a}t der trans-Verbindungen zu pr{\"u}fen, wurde f{\"u}r zwei repr{\"a}sentative Carboxamide (24a und 24i) eine Enantiomerentrennung mittels chiraler HPLC durchgef{\"u}hrt und die Enantiomere einzeln getestet. Dabei erwiesen sich die R,R-Derivate als Tr{\"a}ger der Anti-MM-Wirksamkeit. Zur Absch{\"a}tzung der Permeabilit{\"a}t wurden die PSA-Werte der Carboxamide (24) berechnet. Mit Ausnahme der hydroxylsubstituierten Verbindung 24r lagen die Werte aller Derivate (24a-q) in einem Bereich von 65-88{\AA}2, was einen akzeptablen Resorptionsanteil von 55-90\% erwarten l{\"a}sst. Die Bestimmung der Lipophilie der hergestellten Carboxamide mittels HPLC ergab einen logD-Bereich von 1-3, in dem Wirkstoffe einen ausgewogenen lipophilen Charakter besitzen. Die Effizienz der hergestellten Inhibitoren wurde dar{\"u}ber hinaus anhand der ermittelten LE- (engl. ligand efficiency) und LLE-Werte (engl. ligand lipophilic efficiency) beurteilt. Die g{\"u}nstigste Kombination aus LE und LLE wurde f{\"u}r Verbindung 24j (EC50 = 0.20 μM) ermittelt. Dieses Derivat zeichnet sich durch einen Phenylsubstituenten in Position2 des Tetrahydroisochinolin-Ger{\"u}sts, einen Methoxyphenylrest in Position3 und einen Pyrimidinsubstituenten am exozyklischen Amid aus. Zur Beurteilung unspezifisch toxischer Effekte wurde neben der Wirksamkeit an MM-Zellen auch der Einfluss der Tetrahydroisochinolin-Derivate auf die Viabilit{\"a}t von mononukle{\"a}ren Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) untersucht (AG Chatterjee). W{\"a}hrend die aktivsten Carboxamide an MM-Zellen im submikromolaren Bereich wirksam waren, zeigte mit Ausnahme des phenolsubstituierten Derivats trans-24r keine der getesteten Verbindungen toxische Effekte an PBMCs (EC50 > 100 μM). Dar{\"u}ber hinaus legen detaillierte Westernblot-Analysen einen HSP70-spezifischen Wirkmechanismus nahe. Außerdem f{\"u}hrte eine duale Hemmung von HSP70 und HSP90 durch gleichzeitige Inkubation mit trans-24i und NVP-AUY922 (5) zu einem additiven pro-apoptotischen Effekt bei MM-Zellen. Aufgrund der vielversprechenden In-vitro-Ergebnisse und seiner guten L{\"o}slichkeit wurde trans-39c in vivo untersucht. Zu diesem Zweck wurden zun{\"a}chst die physikochemischen Parameter pKa, logP und L{\"o}slichkeit sowie die Plasma-Proteinbindung ermittelt (in Kooperation mit AG Meinel). Auf Basis einer im Anschluss durchgef{\"u}hrten Pharmakokinetik-Simulation wurden zwei unterschiedliche Dosierungen gew{\"a}hlt. Toxizit{\"a}tsuntersuchungen von trans-39c zeigten keine H{\"a}molyseaktivit{\"a}t und keinen Effekt auf die Viabilit{\"a}t von Leber- und Nierenzellen (H. Bruhn). F{\"u}r die In-vivo-Studie wurde ein murines MM-Modell verwendet, das auf MOPC-315.BM-Luciferase+-Zellen basiert und eine nicht-invasive In-vivo-Bestimmung der Tumorentwicklung via Biolumineszenz erm{\"o}glicht (AG Beilhack). {\"U}ber einen Zeitraum von zehn Tagen wurde zwei Gruppen mit jeweils f{\"u}nf Tieren behandelt. Dazu wurde trans-39c (4 bzw. 40 μg) im Abstand von 12 h intraperitoneal appliziert. Alle Versuchstiere tolerierten die Behandlung und die mit einer Dosis von 40 μg therapierte Gruppe zeigte eine signifikante Reduktion des Tumorwachstums gegen{\"u}ber einer unbehandelten Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis konnte zus{\"a}tzlich durch eine im Anschluss durchgef{\"u}hrte Ex-vivo-Untersuchung best{\"a}tigt werden, bei der die Tumorlast in verschiedenen Knochen und Geweben ermittelt wurde. Die Tetrahydroisochinolinon-Derivate haben sich damit als ausgezeichnete Leitstruktur f{\"u}r die Weiterentwicklung als HSP70-Inhibitoren erwiesen und k{\"o}nnten in Zukunft zu einem deutlichen Fortschritt bei der Behandlung des Multiplen Myeloms beitragen.}, subject = {Plasmozytom}, language = {de} } @phdthesis{Welker2013, author = {Welker, Armin}, title = {Theoretische und experimentelle Wirkstoffsuche an den Zielproteinen SARS-Coronavirus-Papain-like-Protease und Elongin-C}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72500}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Um Wirkstoffe gegen das SARS-Coronavirus zu erhalten, wurden in dieser Arbeit Proteaseinhibitoren gegen die SARS-CoV-PLpro entwickelt. Ein Ansatz um neue Wirkstoffe gegen HIV zu finden, wurde {\"u}ber eine versuchte Blockade von Elongin-C beschritten. Bei der computergest{\"u}tzten Suche nach neuen SARS-CoV-PLpro-Inihibitoren wurde zun{\"a}chst die strukturell bekannte Ligand-Bindetasche analysiert, und nach Evaluation des Dockingprozesses wurden mehrere Screeningprojekte an den R{\"o}ntgenkristallstrukturen 3E9S und 3MJ5 durchgef{\"u}hrt. Von 24 kommerziell erworbenen Screening-Verbindungen riefen 7 eine St{\"o}rung des beim Enzymassay gemessenen Fluoreszenzsignals hervor (Quenching bzw. Eigenfluoreszenz). Letztlich konnte den beiden inhibitorisch aktiven Imidazolderivaten B6 und B9 je ein IC50-Wert von etwa 50 µM zugewiesen werden. Das Imidazolscaffold er{\"o}ffnet damit eine neue Substanzklasse zur Inhibition der SARS-CoV-PLpro. Im pr{\"a}parativ-chemischen Teil des SARS-Projekts wurden weitere Substanzklassen dargestellt, von denen die Inhibitoren vom Benzamid-Typ und Isoindolin-Typ eine Hemmung im einstelligen Mikromolaren Bereich (IC50) zeigten. Die Isoindolin-Derivate sind damit eine weitere, in dieser Arbeit entwickelte Leitstruktur zur Hemmung der SARS-CoV-PLpro. Bei der Suche nach einem Wirkstoff gegen HIV-1 wurde die neue Zielstruktur Elongin-C zur Inhibition durch niedermolekulare Liganden ausgew{\"a}hlt. Vier virtuelle Screeningprojekte f{\"u}hrten zur Bestellung von 27 Verbindungen. Die durchgef{\"u}hrten Untersuchungen lassen noch keine abschließende Beurteilung der Ergebnisse zu, und der bisherige Zellassay wird noch durch spezifischere Methoden zur Bestimmung einer Ligandbindung an Elongin-C erg{\"a}nzt werden. Falls es gelingt, einer der Verbindungen Elongin-C-blockierende Aktivit{\"a}t nachzuweisen, sind aufgrund des Eingriffs in einen zellul{\"a}ren Mechanismus neben der anti-HIV-Wirkung noch weitere pharmakologische Effekte denkbar, und das therapeutische Potenzial eines solchen Stoffs k{\"o}nnte in zuk{\"u}nftigen Experimenten erforscht werden.}, subject = {Proteaseinhibitor}, language = {de} } @phdthesis{Voelker2013, author = {V{\"o}lker, Michael}, title = {Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung neuer In-vitro-Methoden zur Untersuchung des Fremdstoffmetabolismus und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-99434}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Arzneistoffe werden nach ihrer Applikation durch verschiedene fremdstoff-metabolisierende Enzyme des Organismus biochemisch ver{\"a}ndert. Durch eine Hemmung dieser Enzyme, z. B. durch Grapefruitsaft oder einen gleichzeitig eingenommenen Arzneistoff, kann es insbesondere bei Arzneistoffen mit geringer therapeutischer Breite, wie z. B. Theophyllin oder Phenprocoumon, zu gef{\"a}hrlichen Nebenwirkungen kommen. Besonders gef{\"a}hrdet sind multimorbide Patienten, die eine Therapie mit einer Vielzahl von Arzneimitteln erhalten. Um den Metabolismus von neuen Wirkstoffen und deren Interaktionspotential zu untersuchen, werden u. a. In-vitro-Experimente mit Zellfraktionen oder einzelnen Enzymen durchgef{\"u}hrt. Bei Inhibitionsassays wird der Einfluss von Arzneistoffen auf die Umsetzung eines Testsubstrates untersucht. Ein Großteil dieser Arbeit besch{\"a}ftigt sich daher mit der Entwicklung von Methoden, mit denen die Inhibition wichtiger fremd-stoffmetabolisierender Enzyme, wie Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme), Glutathion-S-Transferasen (GSTs) und Carboxylesterasen (CES), untersucht werden kann. Dabei wurde auch eine Charakterisierung der Testsubstrate vorgenommen. Dar{\"u}ber hinaus wurden die Bioaktivierung von Clopidogrel und die Bildung von reaktiven Metaboliten untersucht. Aufgrund aktueller Diskussionen {\"u}ber die Interaktion zwischen Clopidogrel und Omeprazol wurde in dieser Arbeit die Bioaktivierung von Clopidogrel mit Hilfe von LC/MS/MS-Analysen und rekombinanten CYP-Enzymen sowie humanen Lebermikrosomen untersucht. Aufgrund der Instabilit{\"a}t des aktiven Metaboliten wurde in den inkubierten Proben eine Derivatisierung mit Dimedon durchgef{\"u}hrt. Die Untersuchungen zeigten, dass die Umwandlung zum 2-Oxo-Clopidogrel durch mehrere CYP-Enzyme erfolgt. Neben CYP2C19 sind CYP1A2, CYP2B6, CYP2C9 und CYP3A4 beteiligt. Anhand von selektiven Inhibitoren konnte CYP3A4 f{\"u}r die Bildung des aktiven Metaboliten aus 2-Oxo-Clopidogrel identifiziert werden. Neben der Biotransformation durch CYP-Enzyme wird haupts{\"a}chlich der Carbons{\"a}ureester des Clopidogrels hydrolysiert. Untersuchungen mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterasen zeigen, dass die Esterhydrolyse durch CES1 katalysiert wird. Des Weiteren wurde der Metabolismus von Omeprazol untersucht. Es stellte sich heraus, dass die 5-Hydroxylierung und die 5-O-Demethylierung haupts{\"a}chlich durch CYP2C19 und CYP2D6 erfolgen. Dabei besitzt Omeprazol die h{\"o}chste Affinit{\"a}t zu CYP2C19. Die Bildung von Omeprazolsulfon wird hingegen nur durch CYP3A4 katalysiert. Mit Hilfe etablierter CYP-Inhibitionsassays wurde der Einfluss von Clopidogrel und Omeprazol auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Durch Clopidogrel wurden CYP2B6 (IC50 = 6 nM), CYP2C19 (IC50 = 0.4 µM) und CYP1A2 (IC50 = 2.8 µM) gehemmt. Omeprazol inhibiert v. a. CYP2C19 (IC50 = 2 µM) und CYP3A4 (IC50 = 17 µM). Im Folgenden wurde auch der Einfluss von Omeprazol auf die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel untersucht. Die Bioaktivierung wurde allerdings erst bei einer Omeprazol-Konzentration von mehr als 10 µM beeinflusst. Am st{\"a}rksten wurde dabei CYP2C19 (IC50 ca. 100 µM) gehemmt. Aufgrund der recht schwachen Inhibition von CYP2C19 durch Omeprazol und der Tatsache, dass mehrere CYP-Enzyme die Bildung von 2-Oxo-Clopidogrel katalysieren, l{\"a}sst sich der Wirkungsverlust von Clopidogrel bei einer gleichzeitigen Einnahme von Omeprazol anhand der Ergebnisse der In-vitro-Versuche nicht durch eine Hemmung von CYP2C19 erkl{\"a}ren. Eine bisher nur wenig bei In-vitro-Interaktionsstudien untersuchte Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Carboxylesterasen (CES), die v. a. bei der Bioaktivierung von Esterprodrugs eine wichtige Rolle spielen. F{\"u}r die Entwicklung von Inhibitionsassays wurden zun{\"a}chst verschiedene Modellsubstrate ausgew{\"a}hlt. Nach Inkubation dieser Substrate mit humanen Subzellfraktionen und rekombinanten Carboxylesterase-Enzymen wurden die Metaboliten mit Hilfe einer HPLC/UV-Analyse quantifiziert. Es zeigte sich, dass Methyl-4-nitrobenzoat und Mycophenolatmofetil selektiv durch CES1 hydrolysiert werden. Die Hydrolyse von Phenylacetat, p-Nitrophenylacetat und 4-Methylumbelliferylacetat wurde durch alle verwendeten Enzyme katalysiert. Dar{\"u}ber hinaus konnte eine Hydrolyse der aus Boswellia-Arten (Weihrauch) stammenden 3-O-Acetyl-11-keto--boswellias{\"a}ure durch CES2 beobachtet werden. Aufgrund der bei den meisten Modellsubstraten auftretenden Instabilit{\"a}t im Inkubationspuffer war eine Korrektur mit Hilfe von Blindproben erforderlich. Die Hydrolyse konnte durch Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und durch die Zugabe von Essigs{\"a}ure zur Stoppl{\"o}sung verlangsamt werden. Anschließend wurde die Beeinflussung der Hydrolyse von p-Nitrophenylacetat durch Pflanzenextrakte untersucht. Es zeigte sich, dass zahlreiche Extrakte die Esterasen aus der humanen Leber hemmten und die Aktivit{\"a}t bei einer Extraktkonzentration von 25-50 µg/ml weit unterhalb von 50 \% lag. Die Inhibition von CES durch Pflanzenextrakte stellt daher ein bisher unbekanntes Risiko f{\"u}r Arzneimittelinteraktionen dar. Cytochrom-P450-Enzyme (CYP-Enzyme) sind die wichtigste Gruppe fremdstoff-metabolisierender Enzyme. Zur Untersuchung der Beeinflussung dieser Enzyme durch neue Wirkstoffe werden daher standardm{\"a}ßig In-vitro-Interaktionsstudien durchgef{\"u}hrt. Von der Food and Drug Administration (FDA) wurden daher f{\"u}r jedes CYP-Enzym verschiedene Arzneistoffe als Testsubstrate vorgeschlagen. Zus{\"a}tzlich kommen bei solchen Untersuchungen Modellsubstrate zum Einsatz, deren Metaboliten fluoreszieren und die somit f{\"u}r ein Hochdurchsatz-Screening mit Hilfe von Mikrotiterplatten verwendet werden k{\"o}nnen. In dieser Arbeit wurde eine Reihe von Modellsubstanzen (Cumarin- und Harman-Derivate) auf ihre Eignung als Substrate f{\"u}r CYP-Inhibitionsassays untersucht. Nach der Entwicklung von Methoden zur Detektion der Metaboliten, die durch LC/MS/MS-Analysen oder durch HPLC/Fluoreszenzanalysen erfolgte, wurden die CYP-Enzyme identifiziert, die an der Umsetzung der Substrate beteiligt sind und mit Hilfe von CYP-Enzymen und humanen Lebermikrosomen wurden die Km-Werte der Substrate bestimmt. Die Untersuchungen zur Stabilit{\"a}t der CYP-Enzyme {\"u}ber 60 min zeigten, dass diese bei 37 °C stark an Aktivit{\"a}t verlieren, insbesondere CYP1A2. F{\"u}r eine maximale Umsetzungsgeschwindigkeit war eine NADPH-Konzentration von 1 mM ausreichend. Die Untersuchung von 14 Standardsubstraten ergab, dass die Mehrheit selektiv durch das entsprechende CYP-Enzym umgesetzt wird. Die Amodiaquin-N-deethylierung, die Tolbutamidhydroxylierung, die Chlorzoxazon-6-hydroxylierung und die 4-Nitrophenol-2-hydroxylierung wurden durch mehrere CYP-Enzyme katalysiert. Als Positivkontrollen f{\"u}r die Inhibitionsassays und zur Identifizierung der am Metabolismus beteiligten CYP-Enzyme werden von der FDA verschiedene Inhibitoren vorgeschlagen. Da nicht zu allen Inhibitoren Daten {\"u}ber deren Isoenzymselektivit{\"a}t vorliegen, wurde mit Hilfe der Assays die inhibitorische Aktivit{\"a}t von zw{\"o}lf Inhibitoren auf neun verschiedene CYP-Enzyme untersucht. Alle Inhibitoren hemmten das jeweilige angegebene CYP-Enzym. Bei Furafyllin (CYP1A2), Tranylcypromin (CYP2A6), Clopidogrel (CYP2B6), Montelukast (CYP2C8), Sulfaphenazol (CYP2C9), Chinidin (CYP2D6) und Ketoconazol (CYP3A4) konnte eine Konzentration ermittelt werden, bei der nur ein CYP-Enzym gehemmt wird. F{\"u}r Quercetin, Nootkaton, Diethyldithiocarbamat, Sertralin und Ticlopidin wurde eine Inhibition mehrerer CYP-Enzyme festgestellt. Mit Hilfe der CYP-Inhibitionsassays wurden Extrakte lebertoxischer Arzneipflanzen, wie z. B. Tussilago farfara (Huflattich) oder Chelidonium majus (Sch{\"o}llkraut), untersucht. Alle Extrakte hemmten konzentrationsabh{\"a}ngig die CYP-Enzyme, am st{\"a}rksten die Enzyme der Subfamilie CYP2C. Als In-vitro-Substrate f{\"u}r CYP-Inhibitionsassays werden aufgrund ihrer starken Fluoreszenz h{\"a}ufig Cumarin-Derivate eingesetzt. In dieser Arbeit wurden daher 18 O-alkylierte bzw. O-benzylierte Derivate von 7-Hydroxycumarin, 7-Hydroxy-4-methylcumarin und 7-Hydroxy-4-trifluormethylcumarin synthetisiert und die Umsetzung durch verschiedene CYP-Enzyme mit Hilfe der zuvor optimierten LC/LC/Fluoreszenz-basierten Assays untersucht. An der O-Desalkylierung der Cumarin-Derivate waren haupts{\"a}chlich CYP1A2, CYP2B6 und im geringeren Ausmaß CYP2C19, CYP2D6 und CYP2E1 beteiligt. Die h{\"o}chste Affinit{\"a}t besaßen die Substrate zu CYP1A2. Debenzylierungen wurden neben CYP1A2 haupts{\"a}chlich durch CYP3A4 katalysiert. Die h{\"o}chsten Umsetzungsgeschwindigkeiten wurden f{\"u}r die Debenzylierung von 7-Benzyloxy-4-methylcumarin (BMC, 14 pmol/pmol P450/min) und 7-Benzyloxy-4-trifluormethylcumarin (BFC, 9 pmol/pmol P450/min) beobachtet. F{\"u}r 7-Methoxy-4-trifluormethylcumarin (MFC) war die Umsetzungs¬geschwindigkeit f{\"u}r die O-Demethylierung mit CYP1A2 und CYP2B6 im Vergleich zu CYP2C9 deutlich h{\"o}her. MFC und 7-Ethoxy-4-trifluormethylcumarin (EFC) eignen sich daher v. a. f{\"u}r Inhibitionsuntersuchungen von CYP2B6. Bei den untersuchten 7 Alkyloxycumarinen handelt es sich in allen F{\"a}llen nicht um selektive CYP-Substrate. Sie k{\"o}nnen demnach nicht f{\"u}r Inhibitionsuntersuchungen mit humanen Lebermikrosomen verwendet werden. Ein Einsatz f{\"u}r Simultanbestimmungen der Hemmung mehrerer CYP-Enzyme in einem Versuch (Cocktail-Assay) ist aus diesem Grund ebenfalls nicht m{\"o}glich. Durch LC/MS-Analysen nach Inkubation der Cumarin-Derivate mit humanen Lebermikrosomen zeigte sich, dass neben den entsprechenden O Desalkylmetaboliten mehrere Hydroxymetaboliten entstehen und der O Desalkylmetabolit insbesondere bei Derivaten mit l{\"a}ngeren Alkylsubstituenten nicht der Hauptmetabolit ist. Ein Ziel der Arbeitsgruppe ist es zudem, neue In-vitro-Substrate zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen mit besseren enzymkinetischen und analytischen Eigenschaften zu entwickeln. Grundstruktur hierf{\"u}r ist das -Carbolin, da -Carbolin-Derivate eine starke Fluoreszenz aufweisen. Von dem Naturstoff Harmin ist bekannt, dass dieser durch CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 und CYP2D6 O-demethyliert wird. Durch Modifizierung der Harman-Struktur sollte die CYP-Isoenzymselektivit{\"a}t f{\"u}r die O-Dealkylierung gesteigert werden und Substrate f{\"u}r weitere CYP-Enzyme erhalten werden. Hierf{\"u}r wurden in der Arbeitsgruppe u. a. 2-Benzyl-7-benzyloxyharman (BBH), 2-Benzyl-7-methoxyharman (BMH), 7-Methoxy-9-(4-carboxybenzyl)harman (MCBH) und 2-Methyl-7-methoxyharman (MMH) hergestellt. In dieser Arbeit wurden LC/LC/Fluoreszenz- und LC/MS/MS-Methoden zur Quantifizierung der aus diesen Derivaten entstehenden O-Desalkylmetaboliten entwickelt und die Substrate charakterisiert. Die Einf{\"u}hrung von Benzylsubstituenten an der phenolischen Hydroxylgruppe von Harmol (BBH) f{\"u}hrte zum Metabolismus durch CYP3A4 und die Substitution mit einem Carboxybenzylrest am Indolstickstoff (MCBH) verst{\"a}rkte die Selektivit{\"a}t zu den Enzymen der Subfamilie 2C. Durch die Methylierung des Pyridin-Stickstoffs des Harmins (MMH) wurde ein selektives Substrat f{\"u}r CYP2D6 erhalten, weshalb bei dieser Substanz auch humane Lebermikrosomen verwendet werden k{\"o}nnen. Durch die im Vergleich zu anderen CYP2D6-Substraten erhaltene hohe Umsetzungsgeschwindigkeit l{\"a}sst sich die Proteinkonzentration minimieren. F{\"u}r die {\"u}berwiegend an der O-Dealkylierung der Substrate beteiligten CYP-Enzyme wurden die Km-Werte ermittelt. Bei der Untersuchung von verschiedenen CYP-Inhibitoren zeigte sich, dass mit diesen Substraten vergleichbare IC50-Werte, wie mit den Standardsubstraten, erhalten werden. Die Harman-Derivate k{\"o}nnen daher zur Untersuchung der Inhibition wichtiger CYP-Enzyme eingesetzt werden und bieten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Fluoreszenz-Substraten. Durch die Einstellung des pH-Wertes im Anschluss an die Inkubation lassen sich die Metaboliten ebenfalls fluorimetrisch in der Mikrotiterplatte detektieren und k{\"o}nnen f{\"u}r ein Hochdurchsatz-Screening eingesetzt werden. Allerdings m{\"u}ssen die Fluoreszenzeigenschaften weiter verbessert werden, um eine kontinuierliche Bestimmung w{\"a}hrend der Inkubation zu erm{\"o}glichen. In der pharmazeutischen Industrie besteht ein großes Interesse an der Detektion von reaktiven Metaboliten, um eine potentielle Lebertoxizit{\"a}t von neuen Wirkstoffen vorhersagen zu k{\"o}nnen. Hierf{\"u}r werden die Testsubstanzen mit humanen Lebermikrosomen inkubiert und die reaktiven Metaboliten mit Glutathion abgefangen. Zur Optimierung der LC/MS/MS-Analysen wurde in dieser Arbeit die Fragmentierung solcher Addukte anhand von Standardsubstanzen untersucht. Bei allen untersuchten Glutathion-Addukten trat eine Abspaltung der Pyroglutamins{\"a}ure bei positiver Polarit{\"a}t mit einer vergleichbaren Signalintensit{\"a}t auf, weshalb eine Detektion dieses Fragmentes durch einen Neutral-Loss-Scan am besten geeignet erschien. Mit Hilfe der Screening-Methode wurden zuerst Arzneistoffe untersucht, von denen reaktive Metaboliten bekannt sind. F{\"u}r die Bioaktivierung von Clozapin konnten CYP1A2, CYP2D6 und CYP3A4 identifiziert werden, w{\"a}hrend die Toxifizierung von Paracetamol haupts{\"a}chlich durch CYP1A2 und CYP3A4 erfolgte. Auff{\"a}llig war, dass mit steigender Paracetamolkonzentration keine S{\"a}ttigung der Umsetzung auftrat. Durchgef{\"u}hrte Molek{\"u}lver{\"a}nderungen am Glutathion, wie die Einf{\"u}hrung eines Dansylrestes oder eines Biotins, f{\"u}hrten zu keiner deutlichen Verbesserung der Detektion der reaktiven Metaboliten. Dar{\"u}ber hinaus zeigte sich, dass bei den markierten GSH-Derivaten die Umsetzung durch GSTs erheblich reduziert ist. Mit der Screening-Methode wurden allerdings viele falsch positive Signale erhalten, so dass diese nicht f{\"u}r eine Untersuchung von Extrakten lebertoxischer Pflanzen eingesetzt werden konnte. F{\"u}r eine eindeutige und schnelle Identifizierung der Signale als Glutathion-Addukte ist daher die hochaufl{\"o}sende Massenspektrometrie erforderlich. Eine weitere Klasse fremdstoffmetabolisierender Enzyme sind die Glutathion-S-Transferasen (GSTs), {\"u}ber deren Inhibition durch Arzneistoffe und Pflanzenextrakte in der Literatur nur wenige Daten vorliegen. Zur Entwicklung von Inhibitionsassays wurden die in der Literatur beschriebenen Substrate 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, 4 Nitrochinolin-N-oxid, 1,2-Dichlor-4-nitrobenzol und 4-Nitrobenzylchlorid verwendet. Die Detektion der Metaboliten erfolgte im Gegensatz zu der h{\"a}ufig eingesetzten Photometrie mit Hilfe der HPLC/UV- bzw. einer LC/MS/MS-Analyse. F{\"u}r die Kalibrierung wurden zun{\"a}chst die entsprechenden Glutathionkonjugate aus den Substraten synthetisiert. Bei den durchgef{\"u}hrten diskontinuierlichen Assays stellte die h{\"a}ufig auftretende nichtenzymatische Reaktion der Substrate mit Glutathion ein Problem dar. Durch die Erniedrigung des pH-Wertes des Inkubationspuffers von 7.4 auf 6.5 und der Senkung der Inkubationstemperatur von 37 °C auf 25 °C konnte die nichtenzymatische Reaktion w{\"a}hrend der Inkubation erheblich verlangsamt werden. Die nichtenzymatische Reaktion nach der Inkubation konnte durch Zugabe von Oxidationsmitteln gestoppt werden. Von den getesteten humanen Lebersubzell¬fraktionen besaß die cytosolische Fraktion bei allen Substraten die h{\"o}chste Aktivit{\"a}t. Im Rahmen der Assayentwicklung wurde die Glutathion-, die Proteinkonzentration und die Inkubationszeit optimiert. Es wurden die Km- und Vmax-Werte f{\"u}r die Umsetzung der Substrate ermittelt. Als Positivkontrolle diente das ebenfalls synthetisierte Glutathionkonjugat der Etacryns{\"a}ure, f{\"u}r das die IC50-Werte mit jedem Substrat bestimmt wurden. Dabei konnte ein Einfluss des pH-Wertes des Inkubationspuffers und der Inkubationstemperatur auf die gemessene inhibitorische Aktivit{\"a}t beobachtet werden. Anschließend wurde ein Screening von Arzneistoffen, ausgew{\"a}hlten Naturstoffen und etwa 50 Pflanzenextrakten auf eine Inhibition der GSTs in humanem Lebercytosol mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol, das am schnellsten von allen Substraten umgesetzt wurde, durchgef{\"u}hrt. Von den getesteten Naturstoffen fiel eine ausgepr{\"a}gte Hemmung durch Biflavonoide auf. Nahezu alle untersuchten Pflanzenextrakte hemmten die GSTs. Eine starke Inhibition der GSTs zeigten Extrakte aus Cinnamomum cassia (Zimt), die sich als nicht-kompetitiv herausstellte. Weiterhin wurde eine starke Hemmung der Extrakte gerbstoffhaltiger Pflanzen, wie z. B. Hamamelis virginiana (virginische Zaubernuss) oder Krameria triandra (Ratanhia), beobachtet. Hier resultierten IC50-Werte zwischen 5 und 30 µg/ml. Ein Vergleich verschiedener Methoden zur Detektion des Metaboliten 2,4 Dinitrophenyl-S-glutathion zeigte, dass die Photometrie f{\"u}r die Untersuchung der Inhibition von Pflanzenextrakten aufgrund der St{\"o}rung durch die Pflanzenmatrix ungeeignet ist. Mit Hilfe der verwendeten HPLC/UV- sowie der LC/MS/MS-Analyse konnte der Metabolit selektiv erfasst werden und reproduzierbare Ergebnisse f{\"u}r die Inhibition der GSTs durch Pflanzenextrakte erzielt werden. Neben den GSTs wurde auch die Beeinflussung der Glutathionreduktase (GR) in dieser Arbeit untersucht. Hierf{\"u}r wurde ein HPLC-basierter Assay entwickelt, bei dem das reduzierte Glutathion mit 5,5´-Dithiobis(2-nitrobenzoes{\"a}ure) derivatisiert und das entstandene gemischte Disulfid aus Glutathion und 5-Thio-2-nitrobenzoes{\"a}ure quantifiziert wurde. Zur Untersuchung der Inhibition durch Pflanzenextrakte wurde humanes Lebercytosol verwendet, das von allen humanen Lebersubzellfraktionen die h{\"o}chste Aktivit{\"a}t besaß. Im Vergleich zu den GSTs wurde die GR durch die {\"u}berwiegende Zahl der ausgew{\"a}hlten Pflanzenextrakte kaum gehemmt. Eine nennenswerte Inhibition der GR konnte nur bei Extrakten von Juglans regia (Walnuss) beobachtet werden. Fazit In dieser Arbeit wurden eine Reihe von In-vitro-Methoden zur Untersuchung der Inhibition von CYP-Enzymen und weiteren fremdstoffmetabolisierenden Enzymen, wie CES oder GSTs, entwickelt. Aufgrund der dabei angewendeten selektiven HPLC-basierten Quantifizierung der Metaboliten durch UV-, Fluoreszenz- oder MS-Detektion k{\"o}nnen mit diesen Methoden auch Proben mit komplexer Matrix untersucht werden. F{\"u}r alle Assays wurden die Inkubationsbedingungen optimiert und die enzymkinetischen Parameter vieler Substrate ermittelt. Dar{\"u}ber hinaus wurden wichtige Erkenntnisse {\"u}ber die Isoenzymselektivit{\"a}t dieser Substrate gewonnen. Die Eignung der Assays wurde anhand von Standardinhibitoren bewiesen. Schließlich wurde die inhibitorische Aktivit{\"a}t von zahlreichen Pflanzenextrakten bestimmt, deren Auswirkung auf fremdstoffmetabolisierende Enzyme bisher unbekannt war. Die in dieser Arbeit beschriebenen Methoden k{\"o}nnen f{\"u}r die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und der Inhibition fremdstoffmetabolisierender Enzyme, die f{\"u}r eine Zulassung neuer Wirkstoffe erforderlich ist, routinem{\"a}ßig eingesetzt werden.}, subject = {Xenobiotikum}, language = {de} } @article{HoeggerKurlbaumMuelek2013, author = {H{\"o}gger, Petra and Kurlbaum, Max and M{\"u}lek, Melanie}, title = {Facilitated Uptake of a Bioactive Metabolite of Maritime Pine Bark Extract (Pycnogenol) into Human Erythrocytes}, series = {PLoS ONE}, journal = {PLoS ONE}, doi = {10.1371/journal.pone.0063197}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-96656}, year = {2013}, abstract = {Many plant secondary metabolites exhibit some degree of biological activity in humans. It is a common observation that individual plant-derived compounds in vivo are present in the nanomolar concentration range at which they usually fail to display measurable activity in vitro. While it is debatable that compounds detected in plasma are not the key effectors of bioactivity, an alternative hypothesis may take into consideration that measurable concentrations also reside in compartments other than plasma. We analysed the binding of constituents and the metabolite δ-(3,4-dihydroxy-phenyl)-γ-valerolactone (M1), that had been previously detected in plasma samples of human consumers of pine bark extract Pycnogenol, to human erythrocytes. We found that caffeic acid, taxifolin, and ferulic acid passively bind to red blood cells, but only the bioactive metabolite M1 revealed pronounced accumulation. The partitioning of M1 into erythrocytes was significantly diminished at higher concentrations of M1 and in the presence of glucose, suggesting a facilitated transport of M1 via GLUT-1 transporter. This concept was further supported by structural similarities between the natural substrate α-D-glucose and the S-isomer of M1. After cellular uptake, M1 underwent further metabolism by conjugation with glutathione. We present strong indication for a transporter-mediated accumulation of a flavonoid metabolite in human erythrocytes and subsequent formation of a novel glutathione adduct. The physiologic role of the adduct remains to be elucidated.}, language = {en} } @phdthesis{Skiera2013, author = {Skiera, Christina}, title = {1H NMR spectroscopic determination of deterioration marker compounds in fats and oils}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-95756}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {In food and pharmaceutical analysis, the classical indices peroxide value (PV), acid value (AV) and p-anisidine value (ANV) still play an important role as quality and authenticity control parameters of fats and oils. These indices are sum parameters for certain deterioration products (PV for hydroperoxides, AV for free fatty acids, ANV for aldehydes) and are obtained using volumetric or UV/VIS spectroscopic analytical approaches. 1H NMR spectroscopy provides a fast and simple alternative to these classical approaches. In the present work, novel 1H NMR methods to determine hydroperoxides, free fatty acids and aldehydes in fats and oils were developed. Hydroperoxides: The influence of solvent, water, free fatty acids and sample weight on the hydroperoxide group proton (OOH) signal was investigated. On the basis of the obtained results, the sample preparation procedure of the new 1H NMR method was established. A rough assignment of the hydroperoxide group signals in edible fats and oils to methyl oleate, methyl linoleate and methyl linolenate was conducted. Furthermore, to gain information on how many different hydroperoxide species originate from trioleate autoxidation, a kinetic study on trioleate monohydroperoxides was performed. The evaluation of the data strongly indicates that all of the conceivable 18 trioleate monohydroperoxides were formed during trioleate autoxidation. The analytical performance of the NMR method was compared to that of the classical PV approach by means of the so-called "relative sensitivity" according to Mandel. It was shown that both methods exhibit a similar analytical performance. A total of 444 edible oil samples were analysed using both methods. For some oil varieties considerable discrepancies were found between the results. In the case of black seed oil and olive oil two substances were identified that influence the classical PV determination and thus cause positive (black seed oil) and negative (olive oil) deviations from the theoretical PV expected from the NMR values. Free fatty acids: In order to find the optimal solvent mixture to measure the carboxyl group protons (COOH) of free fatty acids in fats and oils, the effect of solvent on the COOH signal was investigated for different mixtures of CDCl3 and DMSO-d6. The comparison of the NMR method with the classical AV method by means of the relative sensitivity revealed that both methods exhibit a similar analytical performance. 420 edible oil samples were analysed by both approaches. Except for pumpkin seed oil, where slight deviations were observed, there was a good compliance between the results obtained from the two methods. Furthermore, the applicability of the 1H NMR assay to further lipids with relevance in pharmacy was tested. For hard fat, castor oil, waxes and oleyl oleate modifications of the original sample preparation procedure of the NMR method were necessary to achieve comparable results for both methods. Aldehydes: The new 1H NMR method enables the determination of the molar amounts of n-alkanals, (E)-2-alkenals and (E,E)-2,4-alkadienals. It was illustrated that the ANV can be modelled as a linear combination of the NMR integrals of these aldehyde species. A functional relationship was derived on the basis In conclusion, the new 1H NMR methods provide an excellent alternative to of calibration experiments. The suitability of the model was shown by comparing the NMR-determined ANVs with the measured classical ANVs of 79 commercially available edible oils of different oil types. In conclusion, the new 1H NMR methods provide an excellent alternative to the determination of the classical indices PV, AV and ANV. They have several advantages over the classical methods including the consumption of small solvent amounts, the ability to automatize measurement and to acquire several different parameters out of the same NMR spectrum. Especially concerning their selectivity, the 1H NMR methods are highly superior to the classical methods.}, subject = {Fett}, language = {en} } @phdthesis{MartinezJaramillo2013, author = {Mart{\´i}nez Jaramillo, Daniela}, title = {Einfluss einer definierten Enzymausstattung auf die Mutagenit{\"a}t von 17β-Estradiol und dessen Metaboliten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-91903}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Der brustgewebsspezifische Metabolismus des weiblichen Sexualhormons 17β-Estradiol (E2) spielt eine wichtige Rolle bei der Brustkrebsentstehung. In der Brust wird E2 durch die humanen Cytochrom P450-abh{\"a}ngigen Monooxygenasen (CYP) Isoenzyme 1A1 (hCYP1A1) und 1B1 (hCYP1B1) zu 2-Hydroxy (2-OH) und 4-HO-E2 oxidiert und vorrangig durch die Catechol-O-Methyltransferase (COMT) entgiftet. Bei unzureichender O-Methylierung k{\"o}nnen diese Catecholestrogene zu elektrophilen Chinonen oxidiert werden, welche mit der DNA reagieren und somit Mutationen induzieren k{\"o}nnen. Eine niedrige COMT-Aktivit{\"a}t, durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, k{\"o}nnte daher die Mutagenit{\"a}t von E2 und dessen Catecholestrogenen beeinflussen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss der Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t auf die Mutagenit{\"a}t von E2 und dessen Catecholestrogenen untersucht. Zu diesem Zweck wurden der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT)-Test und der Mikrokern-Test eingesetzt. Die Untersuchungen erfolgten in kultivierten Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters (V79-Zellen) und in V79-Zellen, die mit hCYP1A1 transfiziert wurden. Begleitend zu den Mutagenit{\"a}tsuntersuchungen wurde das Metabolitenprofil der Testsubstanzen anhand von Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie bestimmt. Nach Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 wurde dieses vollst{\"a}ndig zu dessen Methylcatecholen umgesetzt, ab 2,5 µM hingegen war zus{\"a}tzlich 2 HO-E2 im Medium nachweisbar. Demnach war die Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t bei der Inkubation mit 0,08 µM 2 HO-E2 vollst{\"a}ndig und ab 2,5 µM partiell. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t war 2 Methoxyestradiol der Hauptmetabolit. 2-HO-E2 induzierte im Konzentrationsbereich 0,08 µM - 5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, keine Erh{\"o}hung der Mutantenfrequenz im hprt-Lokus von V79-Zellen. Im Gegensatz hierzu induzierte 2 HO-E2 ab 2,5 µM, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, mindestens eine Verdreifachung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation, wobei dieser Effekt ohne Inhibierung der COMT-Aktivit{\"a}t st{\"a}rker ausgepr{\"a}gt war. {\"U}ber den gesamten getesteten Konzentrationsbereich (5 - 40 µM) wurde 4 HO-E2 zu dessen beiden Methylcatecholen umgesetzt, wobei 4-Methoxyestradiol den gr{\"o}ßten Anteil der detektierten Verbindungen (≥ 86\%) ausmachte. Nach der Behandlung mit 3,5-Dinitrocatechol waren keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar, weswegen von einer vollst{\"a}ndigen Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t im gesamten getesteten Konzentrationsbereich auszugehen war. 4-HO-E2 induzierte {\"u}ber den gesamten getesteten Konzentrationsbereich keine Genmutationen im hprt-Lokus. Erst nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t und Behandlung mit 20 µM 4 HO-E2 wurde eine Verdreifachung der Mutantenfrequenz im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. Mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t induzierte 4 HO E2 ab 20 µM eine Verdopplung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation. Im Kulturmedium der V79 hCYP1A1-Zellen, die mit 0,1 und 1 µM E2 f{\"u}r bis zu drei Wochen behandelt wurden, machten {\"u}ber die gesamte Versuchsdauer E2 (> 86\%) und Estron (> 10\%, bezogen auf die Summe aller Peakfl{\"a}chen) den gr{\"o}ßten Anteil der detektierten Verbindungen aus. Wie erwartet, waren nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t keine Methylierungsprodukte mehr nachweisbar. Die durchgehende, zwei- und dreiw{\"o}chige Behandlung mit jeweils 0,1 und 1 µM E2 bewirkte keine Induktion von Genmutationen im hprt-Lokus. Demgegen{\"u}ber erh{\"o}hte sich die Mutantenfrequenz nach Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t und dreiw{\"o}chiger Behandlung mit 0,1 µM E2 um Faktor 4 im Vergleich zur Kontrollpopulation. Was die Mikrokerninduktion betrifft, so wurde nach 24-st{\"u}ndiger Inkubation mit 0,1 und 1 µM E2, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, keine Erh{\"o}hung der Mikrokernrate im Vergleich zur Kontrollpopulation beobachtet. {\"U}ber die gesamte Dauer der Mutagenit{\"a}tstests von E2 und dessen Catecholestrogenen unterschieden sich die Zellzyklusverteilung, die Wachstumskurven und die Koloniebildungsf{\"a}higkeit zum Zeitpunkt der Selektion, mit und ohne Hemmung der COMT-Aktivit{\"a}t, nicht statistisch signifikant von denjenigen der Kontrollpopulationen. Demnach war von einer sicheren Detektion von Mutationen im HPRT-Test und im Mikrokerntest auszugehen. Zusammenfassend best{\"a}tigen die durchgef{\"u}hrten Untersuchungen, dass die zellul{\"a}re COMT-Aktivit{\"a}t eine essentielle Rolle zur Entgiftung mutagener Catecholestrogene spielt. Eine hundertprozentige Inhibierung der Aktivit{\"a}t dieses Enzyms f{\"u}hrt zur Induktion von Genmutationen durch 4 HO-E2 in V79-Zellen ohne CYP-Aktivit{\"a}t und durch E2 in V79-Zellen, die hCYP1A1 exprimieren. Demnach k{\"o}nnte eine Reduktion der COMT-Aktivit{\"a}t durch Polymorphismen und/oder durch Nahrungsbestandteile, die mit dem Enzym selbst oder seiner Genexpression wechselwirken, die Induktion von Genmutationen durch E2 und dessen Catecholestrogenen beg{\"u}nstigen.}, subject = {Mutagenit{\"a}t}, language = {de} } @phdthesis{Schad2013, author = {Schad, Caroline}, title = {Synthese und Testung neuartiger peptidomimetischer, selektiver Inhibitoren parasit{\"a}rer Cystein-Proteasen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-90973}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Parasit{\"a}re Protozoen wie Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien weisen eine Vielzahl von Cystein-Proteasen der Papainfalimilie (CAC1) auf, welche als Pathogenit{\"a}ts- und Virulenzfaktoren identifiziert werden konnten. Die aktuell eingesetzten Medikamente zur Behandlung der von diesen Parasiten hervorgerufenen Infektionskrankheiten (Leishmaniose, Afrikanische Schlafkrankheit, Chagas-Krankheit, Malaria) sind aufgrund von Nebenwirkungen, hohen Kosten und sich entwickelnden Resistenzen suboptimal. Die parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen stellen daher potentielle Targets zur Entwicklung neuer Therapieans{\"a}tze dar. Das angestrebte Ergebnis der Entwicklung ist es, selektive Inhibitoren der parasit{\"a}ren Proteasen zu entwickeln, w{\"a}hrend die Wirt-Proteasen unbeeinflusst bleiben. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Optimierung der literaturbekannten Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren RV122C (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) und RV212C (Boc-(R)-Leu-(S)-Pro-(S,S)-Azi(OBn)2) sowie des Michael-Akzeptor-basierten Inhibitors 16a (Boc-(S)-Phg-(S)-vGln(Trt)-OEt) hinsichtlich ihrer selektiven inhibitorischen Aktivit{\"a}t an parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen. Bei allen synthetisierten Verbindungen handelt es sich um potenziell irreversible, kovalente und kompetitive Inhibitoren. Der Aziridinring und das Michael-System stellen elektrophile Bausteine dar, die von dem nucleophilen Thiolatrest des aktiven Zentrums einer Cystein-Protease angegriffen werden und in der irreversiblen Alkylierung des aktiven Zentrums resultieren. Die Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte mittels fluorimetrischer und photometrischer Enzymassays. Zur Evaluierung der biologischen Aktivit{\"a}ten wurden ggf. weitere biologische Testungen durchgef{\"u}hrt. Die Leitstrukturen RV122C und RV212C der Aziridinylpeptide wurden als Inhibitoren von Proteasen der Cathepsin-L-Subfamilie identifiziert. Eine zweite Serie von Stereo- und Konstitutionsisomeren von RV122C und RV212C brachte ein Derivat hervor, CS09 (Boc-(S)-Leu-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), welches selektive Inhibition von parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen aufwies, ohne humanes Cathepsin L zu hemmen. Neben leishmanizider Aktivit{\"a}t weisen sowohl RV122C und RV212C als auch CS09 keine Toxizit{\"a}t an den eingesetzten Zelllinien auf. Daher erfolgte die Fokussierung auf Untersuchungen in Leishmania major zur detaillierten Aufkl{\"a}rung zellul{\"a}rer Effekte in vitro und in vivo. Der ausgel{\"o}ste Zelltot wurde als Apoptose-{\"a}hnlich charakterisiert, welcher durch unvollst{\"a}ndige Verdaunung in Lysosom-{\"a}hnlichen Vakuolen hervorgerufen wurde. In-vivo-Untersuchungen im Mausmodell zeigten, dass es das Ziel sein muss, Inhibitoren mit Selektivit{\"a}t insbesondere f{\"u}r die Cathepsin-B-{\"a}hnliche LmajcatB zu entwickeln. Ausgehend von CS09 als neue Leitstuktur wurden verschiedene Variationen zur Strukturoptimierung vorgenommen, um im Anschluss Struktur-Wirkungs-Beziehungen ableiten zu k{\"o}nnen. Die Synthese erfolgte mittels Fragmentkupplung der zuvor stereoselektiv dargestellten Aziridin-Bausteine und der durch Standard-Peptidkupplungsreagenzien erhaltenen Aminos{\"a}ure/Peptidbausteine. Die N-Acylierung wurde mittels des Kupplungsreagenzes PPA optimiert. Schließlich wurden die Verbindungen an den Cystein-Proteasen Cathepsin L, Cathepsin B, Cathepsin K, Cathepsin S, LmCPB2.8, LmajcatB, Rhodesain, Cruzain und Falcipain-2 auf ihre inhibitorische Aktivit{\"a}t getestet. Weiterhin wurden die Verbindungen im Rahmen der interdisziplin{\"a}ren Zusammenarbeit innerhalb des Sonderforschungsbereichs 630 auf ihre antiparasit{\"a}re Aktivit{\"a}t an Leishmanien, Trypanosomen und Plasmodien sowie auf ihre Cytotoxizit{\"a}t an der Makrophagenzelllinie J774.1 getestet. Vertreter dieser Serie erwiesen sich, ebenso wie CS09, als selektive Inhibitoren parasit{\"a}rer, Cathepsin-L-{\"a}hnlicher Proteasen (LmCPB2.8, Rhodesain, Cruzain) und der Cathepsin-B-{\"a}hnlichen Protease (LmajcatB). Sehr gute Hemmung der Cathepsin-L-{\"a}hnlichen Protease LmCPB2.8 riefen Stereo- und Konstitutionsisomere von CS09 hervor, als auch Derivate, bei denen der Leucinrest gegen andere lipophile Reste mit {\"a}hnlichem oder gr{\"o}ßerem sterischen Anspruch substituiert ist. Die beste Inhibition des Cathepsin-B-{\"a}hnlichen Enzyms erfolgte durch Konstitutionsisomere von CS09 und durch Aziridinylpeptide, deren Prolinrest gegen einen Ornithin- oder einen Argininrest ersetzt wurde. Besonders hervor sticht CS25 (Boc-(S)-Ile-(R)-Pro-(R,R)-Azi(OBn)2), sich auszeichnend durch selektive Inhibition der LmajcatB (neben Cathepsin S) bei sehr guter leishmanizider Aktivit{\"a}t. Auch zeigen einige Vertreter selektive Hemmung von Rhodesain und/oder Cruzain. Mithilfe eines synthetisierten Aziridinylpeptids, welches bromierte Benzylesterreste tr{\"a}gt und sehr gute Hemmeigenschaften an parasit{\"a}ren Cystein-Proteasen aufweist (CS38), sollte die Kristallisation mit Rhodesain erfolgen, um die erste R{\"o}ntgenstruktur eines Enzym-Aziridin-Inhibitor-Komplexes zu erhalten. Dieses Ziel konnte jedoch nicht realisiert werden. Aufgrund fehlender R{\"o}ntgenstrukturen von Enzym-Inhibitor-Komplexen ist die Bindung der synthetisierten Inhibitoren noch immer spekulativ. Dockingstudien an Cruzain schlagen verschiedene Bindemodi vor, bei denen zwei von drei lipophilen Resten die hydrophoben S2- und S1´-Bindungstaschen adressieren. Die Mehrzahl der Aziridin-basierten Verbindungen konnte als leishmanizide und/oder trypanozide Verbindungen identifiziert werden. Mithilfe eines Biotin-markierten Derivats von RV122C (CS39) konnte durch active-site labeling nachgewiesen werden, dass Cystein-Proteasen von L.-major-Promastigoten die Targets des Inhibitors sind. Active-site-labeling und Untersuchungen durch Fluoreszenzaktivit{\"a}tsassays mit L.-major-Promastigotenlysaten machten deutlich, dass bei Einsatz von RV122C und RV212C Cathepsin-B-{\"a}hnliche Proteasen beeinflusst werden. CS09 wies einen anderen Wirkmechanismus - {\"a}hnlich dem von E-64 - auf, wie Fluoreszenzaktivit{\"a}tsassays zeigten. Hinsichtlich der Aufkl{\"a}rung dieser zellul{\"a}ren Effekte und zur Identifizierung weiterer m{\"o}glicher Targets wurde ein Fluoreszenzfarbstoff-markierter Aziridin-Inhibitor (CS40) dargestellt. CS40 wies hervorragende Hemmeigenschaften an den isolierten Enzymen auf, war jedoch f{\"u}r In-vitro-Untersuchungen ungeeignet, da weder leishmanizide noch trypanozide Aktivit{\"a}t vorlagen. Durch antiplasmodiale Wirkung ist CS40 lediglich zu In-vitro-Studien an Plasmodien einsetzbar. F{\"u}r In-vitro-Studien wurde zur Aufkl{\"a}rung des Wirkmechanismus der Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Inhibitoren der literaturbekannte, f{\"u}r Cathepsin-L-{\"a}hnliche Enzyme selektive, Epoxid-basierte Standardinhibitor CLIK-148 als Vergleichssubstanz dargestellt. Zum Beweis der Inaktivit{\"a}t des Diastereomers von CLIK-148 mit (R,R)-konfiguriertem Epoxidring wurde zudem das Derivat CS41 synthetisiert. Die Synthese hierzu erfolgte zun{\"a}chst {\"u}ber die stereoselektive Darstellung der trans-konfigurierten Diethyloxiran-2,3-dicarboxylate, die nach Verseifung der Ethylesterfunktionen mittels Peptidkupplungsreagezien mit den entsprechenden Aminen gekuppelt wurden. Zur Ableitung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Michael-Akzeptor-basierten Verbindungen wurde die Leitstruktur 16a durch Variation der Konfigurationen sowie durch Substitution der Trityl-Schutzgruppe der Glutaminseitenkette durch sterisch weniger anspruchsvolle Schutzgruppen ver{\"a}ndert. Die Synthese erfolgte ausgehend von der Darstellung des entsprechenden Dipeptids mit Methylesterschutzgruppen. Ausgehend davon wurden die Methylesterreste entweder mit DIBAL zum entsprechenden Aldehyd reduziert oder aus Gr{\"u}nden der Praktikabilit{\"a}t zum entsprechenden Alkohol reduziert, um anschließend in einer Swern-Oxidation den Aldehyd zu liefern. Die Aldehyde wurden im finalen Schritt in einer Masamune-Reaktion mit Triethylphosphonoacetat zu den vinylogen Dipeptidestern umgesetzt. Die Stereoisomere CS42 und CS43 mit Tritylresten an der Glutaminseitenkette sind unspezifische, starke Inhibitoren humaner und parasit{\"a}rer Enzyme. In vitro zeigten sie starke Hemmung des Parasiten-Wachstums als auch Cytotoxizit{\"a}t an Makrophagen. Die Verbindungen ohne Tritylrest (CS44, CS45) erwiesen sich weder als Proteaseinhibitoren, noch in vitro als wirksam. Ferner wurden mit den synthetisierten Verbindungen in interdisziplin{\"a}ren Kooperationen weitere biologische Testungen durchgef{\"u}hrt. In Selektivit{\"a}tsstudien an den Aspartat-Proteasen Plasmepsin II und IV erwiesen sich die getesteten trans-konfigurierten Aziridin-basierten Inhibitoren als inaktiv, w{\"a}hrend die Leitstruktur der Michael-Akzeptor-basierten Inhibitoren 16a sowie deren Distereomer CS42 (= 16b) als Inhibitoren von Plasmepsin IV identifiziert werden konnten. Weder in Testungen an Plasmodium berghei infizierten humanen Hepatomzellen in Leberstadien, noch im Blut-Hirn-Schrankenmodell einer Trypanosoma-brucei-gambiense-Infektion sowie im In-vitro-Screening an Trichomonas vaginalis zeigten die jeweils getesteten Verbindungen Aktivit{\"a}t. Allein die Aziridin-2,3-dicarboxylat-basierten Cystein-Protease-Inhibitoren wiesen Wirksamkeit bez{\"u}glich des Wachstums von Schistosoma mansoni auf. In einem visuellen Ph{\"a}notyp-Screening inhibierte eine Vielzahl der getesteten Verbidungen das Wachstum der jungen Form (Schistosomula), im zweiten Schritts des In-vitro-Screenings zeigte sich jedoch keine Verbindung aktiv an der adulten Form (Schistosomen) des Parasiten.}, subject = {Proteaseinhibitor}, language = {de} } @phdthesis{Raaijmakers2013, author = {Raaijmakers, Nadja}, title = {Osteoporoseprophylaxe mit pflanzlichen Wirkstoffen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83341}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Osteoporose ist einer der h{\"a}ufigsten Knochenerkrankungen im fortschreitenden Alter und z{\"a}hlt, aufgrund der damit verbundenen hohen direkten und indirekten Behandlungskosten, zu einer der zehn wichtigsten volkswirtschaftlichen Krankheiten. Die Behandlung der Osteoporose ist langj{\"a}hrig und umfasst eine medikament{\"o}se Therapie auf der Basis einer „knochengesunden" Lebensweise hinsichtlich Ern{\"a}hrung und Bewegung. Im Rahmen von Untersuchungen zur Linderung von postmenopausalen Beschwerden, zeigte ein Extrakt der Pflanze Cimicifuga racemosa Potential zu osteoprotektiver Wirksamkeit und r{\"u}ckte somit in den Fokus f{\"u}r eine m{\"o}gliche Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Osteoporose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, in enger Zusammenarbeit mit der Bionorica SE, welche f{\"u}r die Aufreinigung und Fraktionierung des Pflanzenextraktes zust{\"a}ndig war, und mit der Arbeitsgruppe um Prof. Wuttke, welche parallele Rattenstudien durchf{\"u}hrte, Methoden anzuwenden, mit denen osteoprotektive Wirksamkeiten nachgewiesen und auf einzelne Fraktionen des Extraktes limitiert werden k{\"o}nnen. ...}, subject = {Osteoporose}, language = {de} } @phdthesis{Hiltensperger2013, author = {Hiltensperger, Georg}, title = {4-Chinolon-3-carboxamide: Entwicklung neuer Wirkstoffe zur Behandlung der afrikanischen Schlafkrankheit}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-83416}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die humane afrikanische Trypanosomiasis (Schlafkrankheit, HAT) wird durch die Parasiten Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense ausgel{\"o}st und f{\"u}hrt unbehandelt zum Tod. Wegen begrenzter Therapiem{\"o}glichkeiten sowie vernachl{\"a}ssigter Kontrollprogramme ist HAT eine gegenw{\"a}rtige Bedrohung, was die Suche nach neuen Wirkstoffen notwendig macht. Ausgangspunkt f{\"u}r die Leitstrukturfindung war das 7-Amino-4-chinolon-3-carboxamid IV mit einem IC50-Wert (T. b. brucei) von 1.2 µM. Die 4-Chinolon-3-carboxamid-Grundstrukturen wurden unter Verwendung der Gould-Jacobs- (1-Alkyl-Derivate) bzw. der Grohe-Heitzer-Synthese (1-Aryl-Derivate) aufgebaut und anhand strukturierter Variation der Substituenten in Pos. 1, 3 und 7 die f{\"u}r die antitrypanosomale Wirksamkeit essenziellen Strukturelemente identifiziert: Pos.1: Die Alkylkettenverl{\"a}ngerung von Ethyl zu n-Butyl bewirkte eine stetige Aktivit{\"a}tssteigerung, welche auch einem Aryl-Rest in dieser Position {\"u}berlegen war. Pos.3: Benzylamide mit HBD-Funktionen f{\"u}hrten zur Aktivit{\"a}tsabnahme, w{\"a}hrend HBA-Funktionen und unsubstituierte Reste zur Steigerung der Wirksamkeit, teilweise in den nanomolaren Konzentrationsbereich, beitrugen. Pos.7: Neben cyclischen sek. Aminen wurden auch aliphatische prim. Amine via konventioneller oder Mikrowellen-unterst{\"u}tzter SNAr eingef{\"u}hrt. Dabei zeigten sich die sek. Amine mit einer antitrypanosomalen Aktivit{\"a}t im teilweise submikromolaren Bereich den acyclischen Aminen deutlich {\"u}berlegen. Vor allem der Morpholin-Rest bewirkte eine sprunghafte Wirksamkeitsverbesserung. Durch Kombination der Einzelresultate konnte schließlich die den Lipinski's „Rule of 5" entsprechende Leitstruktur 33 mit vielversprechender antitrypanosomaler Wirksamkeit (IC50 (T. b. brucei) = 47 nM, IC50 (T. b. rhodesiense) = 9 nM) und geringer Zytotoxizit{\"a}t erhalten werden (SI = 19000). Erste Untersuchungen zur Identifikation des Targets der 4-Chinolon-3-carboxamide ergaben folgende Erkenntnisse: Fluoreszenzmikroskopieuntersuchungen zeigten eine deutliche Ver{\"a}nderung der Morphologie des Mitochondriums bei behandelten BSF-T. b. brucei-Zellen. Anhand einer Zellzyklus-Analyse wurde die Beeintr{\"a}chtigung der Segregation des Kinetoplasten beobachtet, was zu einem Segregationsdefekt f{\"u}hrte. Die Topoisomerase (TbTopoIImt) wurde durch ein „Knockdown"-Experiment als Haupt-Target ausgeschlossen. Trotz der bemerkenswerten biologischen Aktivit{\"a}t war eine In-vivo-Untersuchung der Leitstruktur wegen zu geringer Wasserl{\"o}slichkeit nicht m{\"o}glich, welche auf eine hochgeordnete Schichtgitterstruktur zur{\"u}ckzuf{\"u}hren war. Da die L{\"o}slichkeit im Wesentlichen eine Funktion der Lipophilie und der intermolekularen Wechselwirkungen ist, wurden zur Verbesserung der Wasserl{\"o}slichkeit pharmazeutisch-technische Methoden angewandt sowie chemische Strukturmodifikationen vorgenommen: Es wurde eine Lipid-basierte, selbstemulgierende Formulierung entwickelt. Durch Ausbildung stabiler Emulsionen war 33 bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml im W{\"a}ssrigen l{\"o}slich und somit f{\"u}r die In-vivo-Untersuchung zug{\"a}nglich. Nach 4-t{\"a}giger peroraler Behandlung von NMRI-M{\"a}usen mit einer w{\"a}ssrigen 1:1-Verd{\"u}nnung der Formulierung konnte keine In-vivo-Aktivit{\"a}t festgestellt werden. Die Spr{\"u}htrocknung von 33 resultierte in amorpher Modifikation, welche in Gegenwart von PVP bzw. Eudragit®L100 stabilisiert wurde. Beide Partikel erm{\"o}glichten die {\"U}bers{\"a}ttigung von 33 im W{\"a}ssrigen, was im Fall der Eudragit®L100-Partikel zu 200-facher L{\"o}slichkeitssteigerung gegen{\"u}ber der kristallinen Wirkstoffmodifikation f{\"u}hrte und somit die In-vivo-Untersuchung erm{\"o}glichte. Zusammen mit ersten Metabolismus-Untersuchungen von 33, welche die Berechnung einer Abbau-Kinetik bzw. Clearance erm{\"o}glichte, konnte mittels der Software Simcyp® ein Plasmakonzentrationsprofil der Verbindung 33 (Eudragit®L100-Partikel) erstellt werden. Basierend auf diesem Studiendesign wurde die In-vivo-Untersuchung von 33 an mit T. b. rhodesiense infizierten M{\"a}usen durchgef{\"u}hrt und zeigte nach 8-t{\"a}giger Behandlung einen deutlichen R{\"u}ckgang der Parasit{\"a}mie. Im Fokus der chemischen Strukturmodifikation stand das Einf{\"u}hren polarer und ionisierbarer Strukturelemente, um 4-Chinolon-3-carboxamid-Derivate mit erh{\"o}hter Hydrophilie (logP 1 - 3) bzw. Salz- und Co-Kristall-Strukturen zu erhalten. S{\"a}mtliche Strukturvariationen trugen zur Verbesserung der Wasserl{\"o}slichkeit und der „drug-like" Eigenschaften im Vergleich zu Verbindung 33 bei, waren allerdings von Aktivit{\"a}tsverlusten gegen{\"u}ber T. b. brucei begleitet. Anhand der „ligand efficiency"- und „lipophilic ligand efficiency"-Analyse wurden schließlich die vielversprechendsten Derivate (94 und 96) f{\"u}r die weitere Untersuchung ausgew{\"a}hlt. Mit IC50 (T. b. rhodesiense)-Werten von 4 nM (94) und 33 nM (96) und geringer Zytotoxizit{\"a}t wurden Selektivit{\"a}tsindizes bis zu 25000 gefunden, welche jene von 33 {\"u}bertrafen. Aufgrund einer L{\"o}slichkeit im millimolaren Bereich, einer moderaten Membranpermeabilit{\"a}t und einer Plasmastabilit{\"a}t von > 2 h k{\"o}nnen die Verbindungen 94 und 96 somit als erste Wirkstoffkandidaten angesehen werden. Die vollst{\"a}ndige physiko-chemische Charakterisierung wurde mittels eines Sirius-T3-Titrationssystems durchgef{\"u}hrt. Unter Verwendung dieser Parameter wurden f{\"u}r die Derivate 94 und 96 je zwei Plasmakonzentrationsprofile mit der Software Simcyp® simuliert. Basierend auf diesem Studiendesign wurde jeweils die hohe Dosis beider Derivate im Mausmodel (T. b. rhodesiense) untersucht. W{\"a}hrend nach 5-t{\"a}giger Behandlung mit 94 und 96 bei s{\"a}mtlichen Tiere keine Parasiten mehr nachweisbar waren, wurde ein leichter R{\"u}ckfall in beiden Versuchsgruppen an Tag 8 beobachtet. Gegenw{\"a}rtig wird die Behandlung mit beiden Derivaten fortgesetzt.}, subject = {Trypanosomiase}, language = {de} } @phdthesis{Schmidt2013, author = {Schmidt, Tobias}, title = {Biotransformation of trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene and 2,3,3,3-tetrafluoropropene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78579}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {The novel refrigerant 2,3,3,3-tetrafluoropropene (HFO-1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans-1-chloro-3,3,3-trifluoropropene (trans-HCFO-1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO-1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans-HCFO-1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane (CFC-113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans-HCFO-1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO-1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans-HCFO-1233zd and HFO-1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC-MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC-MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P-450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi-exposure study with HFO-1234yf. ...}, subject = {Propenderivate}, language = {en} } @phdthesis{Tischer2013, author = {Tischer, Maximilian}, title = {Bisquart{\"a}re Bisnaphthalimide - Neue Wirkstoffe gegen Infektionskrankheiten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-78527}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen des SFB 630 „Erkennung, Gewinnung und funktiona-le Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten" erstellt worden ist, besch{\"a}ftigt sich mit der Entwicklung und Synthese der bisquart{\"a}ren Bisnaphthalimide und deren antimikro-biellen Eigenschaften, speziell gegen Erreger tropischer Infektionskrankheiten, wie Plasmo-dien und Trypanosomen aber auch Bakterien wie Staphylococcus aureus. Erste Testungen einer kleinen Bibliothek verschiedener mono- und bisquart{\"a}rer Phthal- und Naphthalimide im SFB 630 offenbarten deren antimikrobielles Potenzial. Daher war es das Hauptziel dieser Arbeit, durch systematische Variation der verschiedenen Strukturbestandteile diese Bibliothek zu erweitern. Dazu mussten zuerst die entsprechenden Naphthalin-1,8-dicarbons{\"a}ure-Anhydride hergestellt werden. Im n{\"a}chsten Schritt wurden diese mit einem N,N-Dimethylaminopropylamin-Derivat zum Imid kondensiert und abschließend mit einem Alkyl-Linker zur bisquart{\"a}ren Verbindung alkyliert. So konnte die Bibliothek um 25 Verbin-dungen erweitert werden. Dabei umfassten die Variationen die Alkylkettenl{\"a}nge zwischen den quart{\"a}ren Stickstoffen mit 3-14 Methylen-Einheiten, das aromatische Substitutionsmuster mit Amino- bzw. Nitrogruppen und symmetrische, wie asymmetrische Bisnaphthalimide. Durch anschließende antimikrobielle Testung und qualitativen Vergleich der ermittelten IC50-Werte konnten verschiedene strukturelle Merkmale der Bisnaphthalimide identifiziert werden, die einen positiven Einfluss auf die Aktivit{\"a}t gegen den untersuchten Mikroorganismus haben.}, subject = {Ammoniumverbindungen}, language = {de} } @phdthesis{Topf2013, author = {Topf, Christine}, title = {Design, Synthese und biologische Testung von KasA-Inhibitoren als potentielle Wirkstoffe gegen Mycobacterium tuberculosis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77865}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung neuer Wirkstoffe gegen Tuberkulose, einer schwerwiegenden bakteriellen Infektionskrankheit, die am h{\"a}ufigsten die Lunge bef{\"a}llt. Die Entwicklung neuer Arzneistoffe gegen diese Erkrankung ist immens wichtig, da nach Angaben der WHO weltweit j{\"a}hrlich {\"u}ber 1 Million Menschen an den Folgen der Tuberkulose sterben, derzeit kein effizienter Impfstoff zur Verf{\"u}gung steht und sich die Therapiem{\"o}glichkeiten auf wenige Arzneistoffe beschr{\"a}nken. Zudem steigt weltweit das Auftreten von arzneistoff- und totalresistenten Tuberkuloseformen. Tuberkulose wird vorwiegend durch das Mycobacterium tuberculosis erregt. Eine Besonderheit des M. tuberculosis stellt die mykobakterielle Zellwand dar, da diese durch einen hohen Anteil an Fetts{\"a}uren besonders wachsartig und dick ist. Die mykobakterielle Fetts{\"a}uresynthese unterscheidet sich signifikant von der Synthese eukaryotischer Fetts{\"a}uren. Daher besteht die M{\"o}glichkeit, Inhibitoren der mykobakteriellen Fetts{\"a}uresynthese als effektive und selektive neue Antituberkulotika zu entwickeln. Zielstruktur dieser Arbeit ist KasA (β-Ketoacylsynthase), ein Enzym der mykobakteriellen Fetts{\"a}uresynthese II, das die Kondensation zwischen der wachsenden Fetts{\"a}urekette und Malonyl-ACP katalysiert. Ein literaturbekannter KasA-Inhibitor ist Thiolactomycin, ein Thiolacton-Derivat mit einer schwachen inhibitorischen Aktivit{\"a}t (IC50: 242 µM; Kd 226 µM), f{\"u}r den eine KasA-Komplexstruktur verf{\"u}gbar ist. Ziel der Arbeit war es, mittels computergest{\"u}tzten Wirkstoffdesigns neue Leitstrukturen f{\"u}r KasA-Inhibitoren zu entwickeln und davon abgeleitet Substanzbibliotheken kleiner Molek{\"u}le zu synthetisieren. Zur Bestimmung der In-vitro-Aktivit{\"a}ten sollte KasA exprimiert und ein Assay etabliert werden. Theoretische und experimentelle Affinit{\"a}ten sollten anschließend analysiert und bewertet werden. Zur Identifizierung neuer potenzieller KasA-Inhibitoren wurde mit Hilfe des Thiolactomycin-Bindemodus ein Pharmakophor-Modell erstellt. In diesem wurden die essentielle Wasserstoffbr{\"u}cke zwischen den Histidinen und dem Carbonyl-Sauerstoff des Thiolactonrings, zwei hydrophobe Bereiche und ein verbindendes Strukturelement definiert und das Volumen des Pharmakophors begrenzt. Das Screening der Datenbank erfolgte mit GOLD4.0 und GOLDscore. Zur Identifizierung der 16 aussichtsreichsten Verbindungen wurden Rescorings mit ChemScore und sfc_score290m durchgef{\"u}hrt, sowie verschiedene physikochemische Deskriptoren und der errechnete Bindungsmodus einbezogen. Ausgew{\"a}hlte Verbindungen des Screenings wurden synthetisiert. Weitere Variationen wurden durch Einf{\"u}hrung von Substituenten und Bromierung und Nitrierung der Grundger{\"u}ste erhalten. Zur biologischen Testung dieser Verbindungen konnte KasA in M. smegmatis exprimiert werden. Die Reinigung des Proteins erfolgte mittels Affinit{\"a}ts- und Gr{\"o}ßenausschlusschromatographie. Affinit{\"a}tswerte an KasA konnten mit einem Fluoreszenzassays bestimmt werden, da in jedem KasA-Monomer vier Tryptophane zur intrinsischen Fluoreszenz beitragen. Die Bindung eines Inhibitors in die TLM-Bindetasche f{\"u}hrte zum Quenching der Fluoreszenz von KasA und konnte unter Ber{\"u}cksichtigung von Verd{\"u}nnungs- und inneren Filtereffekten zur Berechnung der Dissoziationskonstante Kd herangezogen werden. Die In-vitro-Untersuchungen der Inhibitoren von KasA zeigten im Vergleich zu TLM eine Verbesserung der Affinit{\"a}t bis zu einem Faktor von 11, die beste Verbindung war das Nitroisatin-Derivat 2l (22.1 µM). Einen Hinweis auf Hemmung des Wachstums von Mykobakterien war f{\"u}r die Verbindungen 2e (5-Nitro-1-phenethyl-2,3-indolindion) und 3a (5,7-Dibrom-1-(4-chlorbenzyl)indolin-2,3-dion) ersichtlich. Die {\"u}brigen Verbindungen zeigten keine Aktivit{\"a}t, was dadurch bedingt sein kann, dass sie Substanzen nicht lipophil genug sind (clogP-Werte zwischen 1 und 3), um die mykobakterielle Zellwand zu durchdringen. Analog dem Docking im Rahmen des virtuellen Screenings wurde ein Docking mit GOLD4.0 und GOLDscore f{\"u}r die Substanzbibliothek durchgef{\"u}hrt. Verglichen mit den In-vitro-Affinit{\"a}ten konnte eine gute {\"U}bereinstimmung in der Differenzierung der Substanzklassen gefunden werden. Da kleine Molek{\"u}le mit großer biologischer Aktivit{\"a}t zu bevorzugen sind, wurde die „ligand efficiency", die inhibitorische Potenz unabh{\"a}ngig vom Molekulargewicht, f{\"u}r die Verbindungen berechnet. F{\"u}r die Substanzbibliothek wurde eine gute Korrelation von „ligand efficiency" und GOLDscore pro Schweratom erzielt (R2=0.65), beste Substanzgruppen waren monoalkylierte Uracil- und Isatin-Derivate. Der beste Wert wurde f{\"u}r das Isatin-Derivat 1a erzielt. Mit den erarbeiteten theoretischen und experimentellen Ergebnissen und den etablierten Methoden bietet diese Arbeit eine wichtige Grundlage, um erste „hits" von KasA-Inhibitoren zu neuen Leitstrukturen f{\"u}r Wirkstoffe gegen Mycobakterium tuberculosis zu entwickeln.}, subject = {Tuberkelbakterium}, language = {de} }