@phdthesis{Eman2013,
  author    = {Eman, Maher Othman Sholkamy},
  title     = {In Vitro and In Vivo Analysis of Insulin-Induced Oxidative Stress and DNA Damage},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69274},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2013},
  abstract  = {Hyperinsulinemia, a condition with excessively high insulin blood levels, is related to an increased cancer incidence. Diabetes mellitus, metabolic syndrome, obesity and polycystic ovarian syndrome are the most common of several diseases accompanied by hyperinsulinemia. Since an elevated cancer risk especially for colon and kidney cancers, was reported for those patients, we investigated for the first time the induction of genomic damage by insulin mainly in HT29 (human colon cells), LLC-PK1 (pig kidney cells), HK2 (human kidney cells) and peripheral lymphocytes, and to confirm the genotoxicity of insulin in other cells from different tissues. To ascertain that the insulin effects were not only limited to permanent cell lines, rat primary colon, kidney, liver and fatty tissue cells were also studied. To connect the study and the findings to in vivo conditions, two in vivo models for hyperinsulinemia were used; Zucker diabetic fatty rats in a lean and diabetic state infused with different insulin concentrations and peripheral lymphocytes from type 2 diabetes mellitus patients. First, the human colon adenocarcinoma cells (HT29) showed significant elevation of DNA damage using comet assay and micronucleus frequency analysis upon treatment with 5 nM insulin in standard protocols. Extension of the treatment to 6 days lowered the concentration needed to reach significance to 0.5-1 nM. Insulin enhanced the cellular ROS production as examined by the oxidation of the dyes 2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA) and dihydroethidium (DHE). The FPG modified comet assay and the reduction of damage by the radical scavenger tempol connected the insulin-mediatedDNA damage to ROS production. To investigate the sources of ROS upon insulin stimulation, apocynin and VAS2870 as NADPH oxidase inhibitors and rotenone as mitochondrial inhibitor were applied in combination with insulin and all of them led to a reduction of the genomic damage. Investigation of the signaling pathway started by evaluation of the binding of insulin to its receptor and to the IGF-1 receptor. The results showed the involvement of both receptors in the signaling mechanism. Following the activation of both receptors, PI3K activation occurs leading to phosphorylation of AKT which in turn activates two pathways for ROS production, the first related to mitochondria and the second through activation of Rac1 , resulting in the activation of Nox1. Both pathways could be activated through AKT or through the mitochondrial ROS which in turn could activates Nox1. Studying another human colon cancer cell line, Caco-2 and rat primary colon cells in vitro confirmed the effect of insulin on cellular chromatin. We conclude that pathophysiological levels of insulin can cause DNA damage in colon cells, which may contribute to the induction or progression of colon cancer. Second, in kidney cells, insulin at a concentration of 5 nM caused a significant increase in DNA damage in vitro. This was associated with the formation of reactive oxygen species (ROS). In the presence of antioxidants, blockers of the insulin and IGF-1 receptors, and a phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) inhibitor, the insulin mediated DNA damage was reduced. Phosphorylation of AKT was increased and p53 accumulated. Inhibition of the mitochondrial and NADPH oxidase related ROS production reduced the insulin mediated damage. In primary rat cells insulin also induced genomic damage. HK2 cells were used to investigate the mechanistic pathway in the kidney The signaling is identical to the one in the colon cells untill the activation of the mitochondrial ROS production, because after the activation of PI3K activation of Nox4 occurs at the same time across talk between mitochondria and Nox4 activation has been suggested and might play a role in the observed effects. In the in vivo model, kidneys from healthy, lean ZDF rats, which were infused with insulin to yield normal or high blood insulin levels, while keeping blood glucose levels constant, the amounts of ROS and p53 were elevated in the high insulin group compared to the control level group. ROS and p53 were also elevated in diabetic obese ZDF rats. The treatment of the diabetic rats with metformin reduced the DNA oxidation measured as 8-oxodG as well as the ROS production in that group. HL60 the human premyelocytic cells and cultured lymphocytes as models for the hemopoietic system cells showed a significant induction for DNA damage upon treatment with insulin. The diabetic patients also exhibited an increase in the micronucleus formation over the healthy individuals. In the present study, we showed for the first time that insulin induced oxidative stress resulting in genomic damage in different tissues, and that the source of the produced ROS differs between the tissues. If the same mechanisms are active in patients, hyperinsulinemia might cause genomic damage through the induction of ROS contributing to the increased cancer risk, against which the use of antioxidants as well as mitochondrial and NADPH oxidase inhibitors might exert protective effects with cancer preventive potential under certain conditions. Normal healthy human plasma insulin concentrations are in the order of 0.04 nM after overnight fasting and increase to less than about 0.2 nM after a meal. Pathophysiological levels can reach 1 nM and can stay above 0.2 nM for the majority of the daytime yielding condictions close to the insulin concentrations determined in the present study. Whether the observed effects also occur in vivo and whether they actually initiate or promote tumor formation remains to be determined. However, if proof of that can be obtained, our experiments with inhibitors indicate chances for pharmacological intervention applying antioxidants or enzyme inhibitors. It will not be the aim to reduce ROS in any case or as much as possible because ROS have now been recognized as important signaling molecules and participatants in immune defense, but a reduction to physiological levels instead of pathophysiological levels in the context of a disease associated with ROS overproduction might be beneficial.},
  subject      = {Insulin},
  language  = {en}
}
@phdthesis{Brand2012,
  author    = {Brand, Susanne},
  title     = {Oxidativer Stress und DNA-Sch{\"a}den induziert durch das Peptidhormon Angiotensin II in vivo : Identifizierung des AT1-Rezeptors und reaktiver Sauerstoffspezies als urs{\"a}chliche Faktoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77573},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2012},
  abstract  = {Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) reguliert den Blutdruck und den Wasser- und Elektrolythaushalt des K{\"o}rpers. Angiotensin II (Ang II), das aktive Peptid des RAAS, bewirkt eine Vasokonstriktion und in h{\"o}heren Konzentrationen Bluthochdruck. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine Verbindung zwischen Hypertonie und dem geh{\"a}uften Auftreten von Krebs besteht. Eine Metaanalyse von 13 Fall-Kontroll-Studien konnte einen Zusammenhang zwischen Hypertonie und einem erh{\"o}hten Risiko, an einem Nierenzellkarzinom zu erkranken nachweisen. In vitro-Studien und Studien an der isolierten Niere konnten bereits genotoxische Effekte des blutdruckregulierenden Hormons Ang II zeigen. Zielsetzung dieser Arbeit war es, zun{\"a}chst in vivo zu pr{\"u}fen, ob steigende Ang II-Konzentrationen einen Einfluss auf die genomische Stabilit{\"a}t von Nieren- und Herzzellen besitzen. Hierzu wurden im Dosisversuch m{\"a}nnliche C57BL/6-M{\"a}use mit osmotischen Minipumpen ausgestattet, die Ang II in vier verschiedenen Konzentrationen zwischen 60 ng/kg min und 1 µg/kg min {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen abgeben sollten. W{\"a}hrend des Versuchszeitraums fanden regelm{\"a}ßige, nicht-invasive Blutdruckmessungen an der Maus statt. Die Behandlung mit Ang II f{\"u}hrte zu einem signifikanten Anstieg des Blutdrucks und zu histopathologischen Ver{\"a}nderungen der Glomeruli und des Tubulussystems, was sich in einer verschlechterten Albumin-Ausscheidung wiederspiegelte. Außerdem induzierte die Behandlung mit Ang II die dosisabh{\"a}ngige Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies, DNA-Doppelstrangbr{\"u}chen und oxidativer DNA-Sch{\"a}den. Diese Parameter waren bereits in Tieren erh{\"o}ht, die keinen Bluthochdruck entwickelten und stiegen mit der h{\"o}chsten Ang II-Konzentration noch an, obwohl hier im Vergleich zur Vorg{\"a}ngergruppe, die eine geringere Ang II-Konzentration erhielt, kein h{\"o}herer Blutdruck vorlag. Diese Beobachtung deutet auf eine m{\"o}gliche Unabh{\"a}ngigkeit des entstandenen Schadens vom Bluthochdruck hin und lenkt die Aufmerksamkeit auf Ang II als genomsch{\"a}digenden Faktor. Der folgende Interventionsversuch sollte Aufschluss {\"u}ber die m{\"o}gliche blutdruckunabh{\"a}ngige genomsch{\"a}digende Wirkung von Ang II geben. Dazu wurden C57BL/6-M{\"a}use neben der Ang II-Behandlung in einer Konzentration von 600 ng/kg min zus{\"a}tzlich {\"u}ber einen Zeitraum von 28 Tagen mit 5 verschiedenen Substanzen behandelt: Candesartan, Ramipril, Hydralazin, Eplerenon und Tempol. Candesartan ist ein Ang II-Rezeptor-Antagonist, der selektiv den AT1-Rezeptor blockiert. Ramipril wirkt als Hemmer des Angiotensin-Konversions-Enzyms und verhindert die Bildung von endogenem Ang II aus Ang I. Hydralazin, als Vasodilatator, greift nicht in das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ein. Eplerenon blockiert als selektiver Aldosteronantagonist den Mineralkortikoidrezeptor. Tempol wirkt als Antioxidans. Die Behandlung mit Ang II in einer Konzentration von 600 ng/kg min im Interventionsversuch f{\"u}hrte zur Hochregulierung der NADPH-Oxidase 4 und zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Niere und im kardiovaskul{\"a}ren Gewebe. Der entstandene oxidative Stress f{\"u}hrte wiederum zu DNA-Sch{\"a}den und einer Aktivierung der Transkriptionsfaktoren Nrf2 und NF-B. Nrf2-vermittelt wurde die Induktion antioxidativer Gene ausgel{\"o}st, was allerdings nicht ausreichend war, um vor Ang II-induzierten ROS und DNA-Sch{\"a}den zu sch{\"u}tzen. Eine l{\"a}ngerfristige NF-B-Aktivierung durch hohe Ang II-Spiegel kann das {\"U}berleben und die Proliferation von Zellen, die DNA-Sch{\"a}den in Form von Doppelstrangbr{\"u}chen tragen, f{\"o}rdern, was eine Tumor-initiierende Wirkung haben k{\"o}nnte. Die beschriebenen Effekte erh{\"o}hter Ang II-Spiegel konnten durch die Intervention mit dem AT1-Rezeptorblocker Candesartan verhindert werden, was die Beteiligung des Rezeptors nachweist. Eine blutdruckunabh{\"a}ngige, genomsch{\"a}digende Wirkung von Ang II konnte leider durch die Intervention mit Hydralazin nicht verdeutlicht werden, da die erw{\"u}nschte langfristige Blutdrucksenkung ausblieb. Allerdings zeigte die Intervention mit Tempol eine Abnahme an oxidativem Stress und DNA-Sch{\"a}den trotz ausbleibender Blutdrucksenkung. Die Bedeutung von ROS in der Bildung von DNA-Sch{\"a}den und die Unabh{\"a}ngigkeit dieser Sch{\"a}den vom Blutdruck konnten somit hervorgehoben werden. Die Tatsache, dass die Intervention mit Ramipril den Blutdruck nicht senken konnte, der oxidative Stress und die DNA-Sch{\"a}den durch m{\"o}gliche antioxidative Eigenschaften aber vermindert wurden, unterst{\"u}tzt diese Beobachtung. Die Intervention mit Eplerenon f{\"u}hrte zum Teil zu einer Verminderung an ROS und DNA-Sch{\"a}den, brachte diese Parameter aber nicht auf Kontrollniveau zur{\"u}ck. Somit ist eine Beteiligung von Aldosteron nicht auszuschließen.},
  subject      = {Oxidativer Stress},
  language  = {de}
}