@phdthesis{Zugelder2019,
  author    = {Zugelder, Laurens},
  title     = {Etablierung eines stabilen induzierbaren Multikassetten-Systems f{\"u}r shRNA-Knockdown-Konstrukte in Myelom Zelllinien und Anwendung zur Analyse des NFκB-Signalwegs},
  doi       = {10.25972/OPUS-18837},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-188377},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2019},
  abstract  = {Das Multiple Myelom muss trotz stetiger Fortschritte im Hinblick auf die verf{\"u}gbaren Therapieoptionen und die Krankheitsprognose weiterhin im Wesentlichen als eine unheilbare Erkrankung angesehen werden. Dies kann vor allem auf die große inter- und intraindividuelle Heterogenit{\"a}t des MM zur{\"u}ckgef{\"u}hrt werden, welche die Entwicklung gezielter molekularer Therapiestrategien erheblich erschwert. Hierbei stellen loss-of-function- Experimente, welche die Identifikation einzelner oder mehrerer potenziell therapeutisch relevanter Zielstrukturen durch die (kombinierte) Depletion von Proteinen erm{\"o}glichen, eine wichtige S{\"a}ule dar, f{\"u}r deren Durchf{\"u}hrung verschiedene Systeme mit jeweils eigenen Vor- und Nachteilen zur Verf{\"u}gung stehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Etablierung eines auf RNA-Interferenz basierenden stabilen und induzierbaren Knockdownsystems durch Elektroporation von MM Zelllinien mit Einzel- und Mehrfach-shRNA-Vektoren abgeschlossen werden. Die Transfektion von tet-Repressor-exprimierenden Zellinien mit einer oder mehreren shRNAExpressionskassetten innerhalb eines Plasmidvektors erm{\"o}glicht durch die vollst{\"a}ndige Repression der shRNA-Transkription im nicht-induzierten Zustand die Selektion erfolgreich transponierter Zellen ohne Effekt-vermittelte Bias und die Generierung großer Zellmengen f{\"u}r Versuchsreihen in vergleichsweise kurzer Zeit. Die Induktion der verschiedenen in dieser Arbeit evaluierten Einzel- und Mehrfach-shRNA-Konstrukte gegen (Kombinationen von) Zielstrukturen im Ras/MAPK- sowie im NFκB-Signalsystem mittels Doxyzyklin als Induktionsagens zeigte durchweg deutliche und den Erwartungen aus transienten Experimenten entsprechende Knockdownergebnisse. Auch die Resultate hinsichtlich funktioneller Readouts und zellphysiologischer Effekte der induzierten Knockouts stehen im Einklang mit vorangegangenen Experimenten und best{\"a}tigen somit die {\"A}quivalenz des stabilen induzierbaren Systems zu transienten Ans{\"a}tzen auf RNAi-Basis oder zu pharmakologischen Inhibitoren. Der hierbei erzielte hypomorphe Ph{\"a}notyp innerhalb einer polyklonalen Zellpopulation bildet die Realit{\"a}t einer medikament{\"o}sen Blockade einer oder weniger Zielstrukturen einer heterogenen MM Tumorpopulation n{\"a}herungsweise ab, weshalb das vorgestellte System ein hilfreiches, kosteneffizientes und leicht zu handhabendes Werkzeug f{\"u}r die Identifikation potenziell relevanter Zielstrukturen f{\"u}r molekulare Therapieans{\"a}tze im Multiplen Myelom darstellt},
  subject      = {Plasmozytom},
  language  = {de}
}
@phdthesis{Hertzig2006,
  author    = {Hertzig, Tobias},
  title     = {Funktionelle Charakterisierung des coronaviralen Replikationskomplexes},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20152},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Coronaviren besitzen mit etwa 30 kb das gr{\"o}ßte Genom aller bisher bekannten RNA-Viren. Die Synthese der subgenomischen RNAs findet durch einen einzigartigen Mechanismus, die sog. diskontinuierliche Transkription, statt. Diese beiden Besonderheiten erfordern einen leistungsf{\"a}higen Replikationskomplex, der sich aus den Prozessierungsprodukten der Polyproteine 1a und 1ab und einigen zellul{\"a}ren Proteinen zusammensetzt. Die Aktivit{\"a}ten und die Expression der beteiligten Proteine werden auf co- und posttranslationeller Ebene reguliert. Dazu geh{\"o}rt eine ribosomale Leserasterverschiebung, die das Verh{\"a}ltnis zwischen den ORF1aund ORF1b-kodierten Proteinen festlegt, sowie eine umfangreiche proteolytische Prozessierung durch virale Proteasen. W{\"a}hrend die hochkonservierten ORF1b-kodierten Proteine vor allem RNA-synthetisierende und -prozessierende Funktionen besitzen, {\"u}bernehmen die weniger konservierten ORF1a-kodierten Proteine vor allem organisierende oder regulierende Funktionen. So sind sie beispielsweise maßgeblich an der intrazellul{\"a}ren Lokalisation, strukturellen Organisation und proteolytischen Regulation des Replikationskomplexes beteiligt und haben dar{\"u}ber hinaus nichtessentielle Aufgaben, die m{\"o}glicherweise bei spezifischen Interaktionen des Virus mit seinem Wirt von Bedeutung sind. Die meisten der bisher charakterisierten ORF1bkodierten Proteine besitzen essentielle Enzymfunktionen im viralen RNA-Metabolismus. Einige dieser Enzyme, wie die NendoU oder ExoN, sind spezifisch f{\"u}r die Nidovirales oder nur bestimmte Nidovirusfamilien. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels eines revers-genetischen Ansatzes versucht, die Funktion und Bedeutung verschiedener viraler Proteine im Replikationszyklus von HCoV-229E zu untersuchen. Dazu wurden Transkripte von HCoV-229E-cDNAs genomischer L{\"a}nge, in die entsprechende Substitutionen eingef{\"u}hrt worden waren, in Zellen transfiziert und anschließend analysiert, inwieweit eine virale RNA-Synthese stattfand. Sofern sich infekti{\"o}se Viren im Zellkultur{\"u}berstand befanden, wurde diese n{\"a}her charakterisiert, insbesondere um m{\"o}gliche Defekte in der Virusreplikation und Ver{\"a}nderungen in der Sequenz zu identifizieren. Es wurde gezeigt, dass die Nichtstrukturproteine 13, 14, 15 und 16 wichtige Funktionen innerhalb der viralen RNA-Synthese besitzen, wobei die Aktivit{\"a}ten von nsp13 und nsp16 essentiell waren. Als besonders kritisch erwiesen sich auch die zinkbindenden Reste der Nterminalen Subdom{\"a}ne (ZBD) des Nichtstrukturproteins 13. Das Nichtstrukturprotein 14 besitzt ebenfalls eine zentrale Rolle innerhalb der viralen RNA-Synthese und scheint dar{\"u}ber hinaus an der Synthese der subgenomischen RNAs beteiligt zu sein. Die Bedeutung von nsp15 f{\"u}r die Lebensf{\"a}higkeit von HCoV-229E konnte anhand entsprechender Mutanten zweifelsfrei nachgewiesen werden, wobei die maßgeblichen Defekte wohl nicht ausschießlich in der RNASynthese, sondern eher in einem sp{\"a}teren Schritt des Replikationszyklus zu suchen sind. Mittels verschiedener Mutanten, die Substitutionen an Spaltstellen der MPRO trugen, konnte die essentielle Bedeutung der posttranslationellen Regulation der Replikaseaktivit{\"a}t durch die Hauptprotease gezeigt werden. In den allermeisten F{\"a}llen f{\"u}hrten Mutationen, die die Spaltungseffizienz reduzierten, zu einem Abfall in der RNA-Synthese und lebensf{\"a}hige Viren konnten nicht isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Replikon auf der Basis des HCoV-229E hergestellt, das {\"u}ber Monate in Zellkultur gehalten und dessen Reportergenexpression durch Fluoreszenz- Mikroskopie beobachtet werden konnte. Es zeigte sich, dass f{\"u}r eine dauerhafte Koexistenz von Wirtszelle und Replikon-RNA nur wenige Ver{\"a}nderungen im viralen Genom notwendig waren. Mit Hilfe eines mutierten Derivats dieses Replikons gelang es, den Defekt einer viralen nsp15- Mutante n{\"a}her zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit widmete sich der Charakterisierung von chim{\"a}ren HCoV-229E-Klonen, deren Nichtstrukturproteine 7 und 8 bzw. 7 bis 9 gegen die entsprechenden Proteine des HCoVNL63 ausgetauscht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nichtstrukturproteine 7 und 8 von derselben Spezies stammen m{\"u}ssen, damit RNA-Synthese stattfindet, was auf eine essentielle Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen schließen ließ. Die Identifizierung und Analyse adaptiver Mutationen in allen hier untersuchten chim{\"a}ren Klonen zeigte, dass offenbar neben der nsp7-nsp8-Interaktion noch weitere Interaktionen dieser Proteine mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel nsp12 und nsp13, auf funktioneller und/oder struktureller Ebene von Bedeutung sind. Dar{\"u}ber hinaus ließen eine Reihe von Mutationen im Bereich des Leserasterverschiebungselements darauf schließen, dass sich bei diesen Viren die Leserasterverschiebungsrate ge{\"a}ndert haben k{\"o}nnte. Diese Hypothese konnte durch In-vitro- Translationsexperimente best{\"a}tigt werden. Es zeigte sich, dass durch diese Mutationen die Leserasterverschiebungsrate von 50 \% in der wildtypischen Situation auf 65 - 70 \% angehoben wurde. Diese relative {\"U}berexpression von ORF1b-Proteinen scheint zur Kompensation funktioneller Defekte, die durch die Fremdproteine nsp7 und nsp8 verursacht wurden, beizutragen. Obwohl bei den meisten chim{\"a}ren Klonen eine RNA-Synthese auf nahezu wildtypischem Niveau beobachtet werden konnte, wiesen Reduktionen im Virustiter um 60 - 90 \% auf verbliebene funktionelle Defekte im Replikationszyklus dieser Viren hin.},
  subject      = {Coronaviren},
  language  = {de}
}