@phdthesis{Meyer2007, author = {Meyer, Thomas Hans-Georg}, title = {Entwicklung neuer Strategien zur Isolation, Expansion und Differenzierung von adulten Stammzellen aus humanen Pankreasinseln}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25202}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die Zelltherapie stellt einen neuen Ansatz zur Therapie des Diabetes mellitus Typ 1 dar und ist eine Alternative zur exogenen Insulinsubstitution. Um diese Therapieoption zu etablieren und zu optimieren ben{\"o}tigt man jedoch ausreichend Material, was angesichts des Mangels an Spenderorganen problematisch ist. Als potentieller unlimitierter Zellpool sind embryonale und adulte Stammzellen in den Fokus der Forschung ger{\"u}ckt. Da gegen{\"u}ber der Verwendung embryonaler Stammzellen in Deutschland ethische Bedenken bestehen und die Forschung an ihnen rechtlich untersagt ist, konzentriert sich diese Arbeit auf die Etablierung einer Strategie zur Expansion und Differenzierung gewebsspezifischer adulter Stammzellen. Nestin als Stammzellmarker spielt hierbei eine zentrale Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Vektoren konstruiert, welche die zellspezifische Expression eines Reportergens in Nestin-positiven Zellen selektiv erm{\"o}glichen. Diese Ergebnisse tragen dazu bei, daß im weiteren Schritte folgen k{\"o}nnten, um die Proliferation adulter Stammzellen voranzutreiben und somit einen unlimitierten Zellpool zu generieren. Nach dessen Differenzierung in Insulin produzierende ß-Zellen und deren Pr{\"a}paration k{\"o}nnte der substantielle Mangel an Spenderorganen ausgeglichen und die Optimierung und Etablierung der ß-Zell-Ersatztherapie entscheidend vorangebracht werden. Zum jetzigen Zeitpunkt ist noch wenig {\"u}ber die molekularen Mechanismen, welche die Expansion und Differenzierung von ß-Zellen bzw. Stammzellen kontrollieren, bekannt. Ebenso unklar ist, ob die in Tiermodellen oder Zelllinien erarbeiteten Ergebnisse auf humane Zellen {\"u}bertragbar sind. Dennoch geht man davon aus einen Punkt erreicht zu haben, an dem man mit Bestimmtheit davon ausgehen kann, in der Zukunft voll funktionelle Insulin produzierende ß-Zellen generieren zu k{\"o}nnen. Vor der Einf{\"u}hrung in die Klinik werden jedoch noch mehrere Jahre vergehen. Inzwischen ist es notwendig, die derzeit bereits vorhandenen Therapiem{\"o}glichkeiten des Diabetes mellitus auszubauen und zu verfeinern. Denn bereits jetzt ist absehbar, dass auf den Großteil der derzeit zur Verf{\"u}gung stehenden Behandlungsm{\"o}glichkeiten - selbst bei der optimalen Entwicklung einer Stammzell-basierten Therapie - nicht verzichtet werden kann.}, subject = {Adulte Stammzelle}, language = {de} } @phdthesis{Heintel2006, author = {Heintel, Timo Michael}, title = {Einfluss von Stickstoffmonoxid auf die Genexpression humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten w{\"a}hrend Expansion und Redifferenzierung in einem in-vitro-Modell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20456}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {Bei der Kultivierung humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten f{\"u}r eine m{\"o}gliche therapeutische Anwendung gilt es, deren besondere zellphysiologische Eigenschaften zu ber{\"u}cksichtigen, um ein zell- und molekularbiologisch hochwertiges Transplantat erzielen zu k{\"o}nnen. Stickstoffmonoxid (NO) gilt als ein wichtiger Faktor f{\"u}r die Hom{\"o}ostase der chondrogenen Extrazellul{\"a}rmatrix, der f{\"u}r die Funktion des hyalinen Gelenkknorpels entscheidenden Gewebekomponente. Es stellt bisherigen Untersuchungen nach einen wichtigen Regulator im sensiblen Gleichgewicht zwischen der Synthese knorpelspezifischer Matrixproteine und dem Matrixabbau dar. Trotz dieser Bedeutung ist das Wissen {\"u}ber die Expression der NO-generierenden Enzyme in humanen artikul{\"a}ren Chondrozyten, insbesondere unter Kulturbedingungen, sehr begrenzt. Des Weiteren fehlen Erkenntnisse {\"u}ber den Einfluss von NO auf den Differenzierungsstatus dieser Zellen. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Charakterisierung der Genexpression adulter Gelenkknorpelzellen w{\"a}hrend deren Expansion und anschließender Redifferenzierung in einem in vitro-Modell. Das Hauptaugenmerk wurde hierbei auf die 3 NOS-Isoformen sowie die beiden Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan gelegt. In Zusatzversuchen wurde die Bedeutung von NO f{\"u}r den Metabolismus sowie f{\"u}r Differenzierungsvorg{\"a}nge humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten untersucht. Hierbei sollten funktionelle Zusammenh{\"a}nge aufgezeigt und regulative Abh{\"a}ngigkeiten auf der Ebene der Transkription identifiziert werden. Humane artikul{\"a}re Chondrozyten wurden hierf{\"u}r unter standardisierten Bedingungen enzymatisch aus Knorpelgewebe von Femurk{\"o}pfen isoliert. Nach Expansion der Zellen in zweidimensionaler Monolayerkultur wurden die amplifizierten Zellen in Form dreidimensionaler Zellaggregate in einem chondrogenen Differenzierungsmedium rekultiviert. Ver{\"a}nderungen des zellul{\"a}ren Ph{\"a}notyps wurden morphologisch, histochemisch, immunhistochemisch und mittels RT-PCR auf Genexpressionsebene verfolgt. Im Verlauf der Expansion konnte eine funktionelle und morphologische Dedifferenzierung der Chondrozyten dokumentiert werden. Durch 21t{\"a}gige Rekultivierung in einem definierten chondrogenen Differenzierungsmedium konnten die Zellen ihre, zuvor verloren gegangenen knorpelspezifischen Eigenschaften wieder ausbilden (Redifferenzierung). Die Analyse der Genexpression der NOS-Isoformen humaner artikul{\"a}rer Chondrozyten auf RNA-Ebene ergab neben der, in der Literatur bereits beschriebenen induzierbaren NOS die Expression zweier weiterer Isoformen, der neuronalen und der endothelialen NOS. In weiteren Versuchen wurde der Effekt verschiedener Mediatoren auf die Genexpression der Gelenkknorpelzellen beobachtet. So wurden Zellaggregate w{\"a}hrend verschiedener Phasen der Redifferenzierung mit rhIL-1 beta bzw. rhTNF alpha stimuliert. Die Chondrozyten reagierten darauf mit einer starker Induktion der induzierbaren NOS sowie mit einem konsekutiven Anstieg der NO-Freisetzung. Die eNOS-Expression wurde negativ reguliert. Auf die Konzentration der nNOS-Transkripte hatten beide Zytokine keinen messbaren Einfluss. Zudem konnte auf diesen Reiz hin eine drastische Reduktion der Kollagen Typ II und Aggrecan-Expression festgestellt werden. In Zusatzversuchen, bei denen u.a. ein NO-Donor und ein NOS-Inhibitor zum Einsatz kamen wurde dieser Effekt genauer erforscht. Aus den gewonnenen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass der Effekt von IL-1 beta und TNF alpha auf die Synthese der beiden wichtigen Matrixproteine Kollagen Typ II und Aggrecan zumindest teilweise {\"u}ber NO vermittelt wird. In mehren Versuchsreihen gelang es des Weiteren die besondere Bedeutung von NO f{\"u}r die Zelldifferenzierung zu belegen. Die Modifikation des verwendeten chondrogenen Differenzierungsmediums durch Zusatz des NOS-Inhibitors NG-Amino-L-Arginin (L-NAA) f{\"u}hrte zu einer deutlich fr{\"u}heren bzw. st{\"a}rkeren Expression der beiden chondrogenen Markergene Kollagen Typ II und Aggrecan.}, language = {de} }