@phdthesis{Weidauer2010, author = {Weidauer, Stella Elisabeth}, title = {Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Knochenwachstums-Modulators Sclerostin}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-46224}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Die Knochenhom{\"o}ostase erfolgt durch das Zusammenspiel mehrerer Zelltypen. W{\"a}hrend die Osteoblasten f{\"u}r den Knochenaufbau verantwortlich sind, resorbieren die Osteoklasten Knochengewebe. Beide Vorg{\"a}nge werden durch die Osteozyten streng reguliert. Eine St{\"o}rung im strikt regulierten Gleichgewicht zwischen Knochenabbau und Knochenaufbau kann daher zu Knochenkrankheiten wie Osteoporose f{\"u}hren. Auf molekularer Ebene erfolgt die Kommunikation zwischen den einzelnen Zelltypen {\"u}ber zwei wichtige Signalwege, den der „Bone Morphogenetic Protein"-Superfamilie (BMPs) und den der Wnt-Proteine. Die Signal{\"u}bertragung wird hierbei durch sekretierte Faktoren induziert, die an Rezeptoren auf der Zelloberfl{\"a}che binden. Deren Aktivierung f{\"u}hrt zu einem intrazellul{\"a}ren Signal, welches letztlich die Expression von Zielgenen reguliert. Beide Signalwege werden auf mehreren Ebenen, extrazellul{\"a}r, membranst{\"a}ndig und intrazellul{\"a}r reguliert. Das 2003 identifizierte Sclerostin ist ein Vertreter der extrazellul{\"a}ren Regulatorproteine und wurde aufgrund seiner Zugeh{\"o}rigkeit zur DAN-Familie zun{\"a}chst f{\"a}lschlicherweise als direkter Inhibitor des BMP-Signalwegs eingestuft. Mittlerweile wird allerdings davon ausgegangen, dass Sclerostin den Wnt-Signalweg negativ reguliert, indem es die Wnt Ko-Rezeptoren LRP5 und LRP6 bindet, die beide zu der Familie der „Low-density lipoprotein receptors" geh{\"o}ren. {\"U}ber den molekularen Inhibitionsmechanismus von Sclerostin war jedoch zum Startpunkt dieser Dissertationsarbeit wenig bekannt. Daher wurde Sclerostin im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch und biochemisch charakterisiert. Die Aufkl{\"a}rung mittels NMR-Spektroskopie ergab f{\"u}r Sclerostin eine Struktur, die sich in drei Regionen gliedert: den Cystinknoten, sowie einen „Loop"-Bereich und die Fingerregion. Vom zentralen Cystinknoten gehen drei Peptid-Schleifen in zwei entgegengesetzte Richtungen aus. Schleife eins und drei bilden eine definierte ß-Faltblattstruktur und {\"a}hneln zwei Fingern einer Hand. Die zweite Schleife, welche vom Cystinknoten isoliert in die entgegengesetzte Richtung verl{\"a}uft („Loop"), ist wie die beiden langen N- und C-Termini flexibel und unstrukturiert. Die in Zusammenarbeit mit der Firma AbD-Serotec entstandenen Fab-Fragmente erm{\"o}glichten die Bestimmung des Bindeepitops der Sclerostin/LRP5-Interaktion im Bereich der unstrukturierten dritten Schleife von Sclerostin. Die Struktur von Sclerostin und die Identifikation des Bindeepitops auf Sclerostinseite geben nun erste Einblicke in den molekularen Mechanismus der Sclerostin/LRP5-Interaktion. Diese Kenntnis kann f{\"u}r die Entwicklung von Kleinmolek{\"u}linhibitoren mittels rationalem Drugdesign genutzt werden, welche, wie auch der in Kooperation entwickelte die Sclerostinaktivit{\"a}t neutralisierende Antik{\"o}rper AbD09097, hochinteressante Ans{\"a}tze f{\"u}r neuartige anabole Therapien von Krankheiten mit Knochenschwund darstellen.}, subject = {Cytokine}, language = {de} } @phdthesis{Weber2006, author = {Weber, Dionys A.}, title = {Aufkl{\"a}rung der Struktur und Charakterisierung des tern{\"a}ren Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-20735}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2006}, abstract = {„Bone Morphogenetic Proteins" (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehom{\"o}ostase. Wie TGF­-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. F{\"u}r die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Pr{\"a}paration, Kristallisation und Strukturaufkl{\"a}rung des tern{\"a}ren Komplexes aus BMP-2 und den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses tern{\"a}ren Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 pr{\"a}sentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Rezeptoren k{\"o}nnen keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativit{\"a}t bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erkl{\"a}rbar. Vielmehr repr{\"a}sentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativit{\"a}t {\"u}ber die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgef{\"u}hrten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. W{\"a}hrend polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbr{\"u}cke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinit{\"a}t, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminos{\"a}uren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen {\"u}ber den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifit{\"a}t m{\"o}glich. Diese BMP-2 Varianten k{\"o}nnen als Werkzeuge zur Aufkl{\"a}rung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso w{\"a}re es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgepr{\"a}gter Typ II Rezeptor Spezifit{\"a}t in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise k{\"o}nnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Ulbrich2010, author = {Ulbrich, Jannes}, title = {Integrierung und biochemische Charakterisierung ektoper BMP Rezeptoren in Zellmembranen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-55462}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {BMPs vermitteln ihre zellul{\"a}ren Effekte durch Rekrutierung und Aktivierung von zwei Typen spezifischer, membranst{\"a}ndiger Rezeptoren. Die genauen Mechanismen der Rezeptorakivierung und die Komposition eines funktionellen, signalvermittelnden Komplexes auf der Zelloberfl{\"a}che sind in den letzten Jahren genau untersucht worden. Die dimere Natur aller BMPs, die Promiskuitivit{\"a}t der BMPs sowie der entsprechenden Rezeptoren und die unterschiedlichen Rezeptorkonformationen (PFC, BISC) erschweren jedoch die experimentelle Zug{\"a}nglichkeit dieser Proteinfamilie. Um den Einfluss der Membranverankerung der Rezeptoren auf deren Affinit{\"a}t zu einzelnen Liganden zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden evaluiert, die eine quantitative Kopplung an Plasmamembranen erm{\"o}glichten. Die BMP Rezeptorektodom{\"a}nen wurden u.a. mittels einer lysin-spezifischen Kopplung lipidiert, oder aber als His6-Ektodom{\"a}nen an membranintegrierte Chelatlipide gekoppelt.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Schroeter2009, author = {Schr{\"o}ter, Benedikt Markus}, title = {Aufkl{\"a}rung der Funktion von CYR61/ CCN1 in Osteoblasten und Osteoklasten}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38830}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {No abstract available}, subject = {Osteoblast}, language = {de} } @phdthesis{Schmich2007, author = {Schmich, Andreas}, title = {Vergleich der induzierten Knochenbildung durch rhBMP-2 und zwei seiner Varianten mit verst{\"a}rkter Heparinbindung - Eine radiologische und histologische Untersuchung -}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-33302}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {In der vorliegenden Studie wurden zwei neuartige BMP-2 Varianten mit verst{\"a}rkter Bindung an die extrazellul{\"a}re Matrix auf ihre Osteoinduktivit{\"a}t hin untersucht und mit dem Wildtyp verglichen. Hierzu wurden die Morphogene an scheibenf{\"o}rmige Tr{\"a}ger (Kollagen Typ I) gebunden in die Muskulatur der vorderen Bauchwand von Ratten implantiert. {\"U}ber einen Beobachtungszeitraum von 35 Tagen wurden in Intervallen von sieben Tagen die Implantate explantiert und sowohl radiologisch als auch histologisch auf die erzielte Knochenneubildung hin untersucht. Die Morphogene wurden in zwei Konzentrationen (10 µg, 5 µg) implantiert. Bei 5 µg pro Implantat weist die Variante T4 mit vier repitiven Heparin-Bindungsstellen am N-Terminus eine signifikant gesteigerte Osteoinduktivit{\"a}t gegen{\"u}ber dem Wildtyp und der Variante T3 auf. Diese gesteigerte Knocheninduktion zeigt sich in einer schnelleren Knochenbildung, die bereits an Tag 14 ihr Maximum erreicht und nach einer Plateauphase von circa sieben Tagen einen osteoklast{\"a}ren Knochenabbau m{\"u}ndet. Die Variante T3 zeigt im R{\"o}ntgenverlauf in der Dosierung von 5 µg keinen signifikanten Unterschied zum Wildtyp BMP-2. In hoher Dosierung erweisen sich die Varianten T3 und T4 als die induktiveren Morphogene. Die Variante T3 zeigt einen zu T4 nahezu identischen Verlauf. Der Wildtyp besitzt eine gegen{\"u}ber den beiden Varianten deutlich reduzierte Osteinduktivit{\"a}t. Der beobachtete Unterschied ist jedoch statistisch nicht signifikant. Bei allen Proteinen wird die maximal erzielbare Knochenfl{\"a}che bereits an Tag 14 erreicht. In der darauf folgenden Zeit kommt es durch den osteoklast{\"a}ren Umbau zu einer deutlichen Fl{\"a}chenreduktion (um ca. 30\%). In den Untersuchungen konnte bewiesen werden, dass die gentechnische Modifikation des Morphogenes BMP-2 zu einer Steigerung der Osteoinduktivit{\"a}t f{\"u}hren kann. Gentechnologisch hergestellte Modifikationen von Wachstumsfaktoren bieten daher interessante M{\"o}glichkeiten der gezielten Beeinflussung der Pharmakokinetik der Faktoren. Sie versprechen ein hohes therapeutisches Potenzial in der rekonstruktiven Knochenchirurgie.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Savic2008, author = {Savic, Daniel}, title = {Die Unterkieferrekonstruktion mit osteoinduktiven Implantaten beim G{\"o}ttinger Minischwein - Eine biomechanische Untersuchung -}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-38527}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {In der vorliegenden Studie wurden biomechanische Versuche an unilateral rekonstruierten Unterkiefern des G{\"o}ttinger Minischweins durchgef{\"u}hrt. Die 5 cm langen Mandibulardefekte (Critical Size Defects) wurden in vorangegangener Studie mit osteoinduktiven Implantaten direkt versorgt und durch Fixation mit Osteosynthesematerialien stabilisiert. Dotiert wurde der kollagene Tr{\"a}ger (EXKK, extrahiertes xenogenes Knochenkollagen; 50x25x15 mm³) mit rekombinantem humanem BMP-2 (400 \&\#956;g/cm3) bzw. der Mutante T4 (300 \&\#956;g/cm3). Die Rekonstruktion der Kontrollgruppe erfolgte mit autologem Knochen. 12 Wochen postoperativ wurden die Versuchstiere geopfert und die Kiefer explantiert. Die Testung der Pr{\"a}parate im Drei-Punkt-Biegeversuch zeigte biomechanisch {\"a}ußerst belastbare Knochenregenerate. Differenziert nach E-Modul und maximal tolerierter Krafteinwirkung erreichten die mit osteoinduktiven Implantaten rekonstruierten Kiefer im Vergleich zur kontralateralen Seite (=100\%) Belastungswerte zwischen 55\% und 69\%. Die Messergebnisse f{\"u}r EXKK+T4 lagen im Mittel 18\% (E-Modul) und 19\% (maximal tolerierte Krafteinwirkung) {\"u}ber denen f{\"u}r EXKK+rhBMP-2. Bei der ausschließlich mit autologem Knochen rekonstruierten Kontrollgruppe war aufgrund fehlender osteogener Regeneration keine biomechanische Festigkeit nachzuweisen. Durch die verbesserter Ortsst{\"a}ndigkeit der Mutante T4 gegen{\"u}ber rhBMP-2 konnte eine 25\%ige Dosiseinsparung (300 \&\#956;g/cm3 zu 400 \&\#956;g/cm3) erzielt werden. Es ist f{\"u}r die rechtsseitige Unterkieferrekonstruktion im G{\"o}ttinger Minischwein gelungen, ein auch unter biomechanischen Gesichtspunkten funktionsstabiles kn{\"o}chernes Regenerat mithilfe vollst{\"a}ndig resorbierbarer, osteoinduktiver Implantate im Critical Size Defect zu implementieren. Der Vorteil dieser Methode ist eine von Beginn an stattfindende, direkte funktionelle Ausrichtung des kn{\"o}chernen Regenerates an die geforderte Biomechanik des Defektes und der vermeidbare, zur Gewinnung eines Transplantates notwendige, operative Zweiteingriff.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Mueller2009, author = {M{\"u}ller, Sophia}, title = {Molekulare Untersuchungen zur Rolle von Homeobox-Genen bei der Entwicklung von Echinococcus multilocularis}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-35616}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2009}, abstract = {Die alveol{\"a}re Echinokokkose ist eine, vorrangig in der n{\"o}rdlichen Hemisph{\"a}re verbreitete, parasit{\"a}re Erkrankung. Verursacht wird sie beim Menschen durch das Larvenstadium des Fuchsbandwurms. Homeoboxgene sind hochkonservierte Gene, die die Morphogenese von Lebewesen steuern. Die Anzahl und die Bedeutung von Homeoboxgenen in der Entwicklung von E.multilocularis waren bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit Hilfe von Sequenzanalysen im Genom des Fuchsbandwurms erstmals Homeoboxgene identifiziert und deren Expressionsmuster mittels PCR in verschiedenen Larvenstadien charakterisiert werden. Von insgesamt 23 gefundenen Homeoboxgenen wurden 15 Gene auf ihre larvenstadienspezifische Expression untersucht. Neun der untersuchten Gene zeigten in dem gew{\"a}hlten Versuchsaufbau eine Expression in den untersuchten Larvenstadien, f{\"u}nf davon zeigten eine verst{\"a}rkte Expression in den sp{\"a}ten Larvenstadien. F{\"u}r acht dieser neun Gene ließen sich dar{\"u}ber hinaus Hinweise auf eine Prozessierung ihrer mRNA {\"u}ber den Mechanismus des Trans-Spleißens finden. Vorangehende Versuche der Arbeitsgruppe von Prof. Brehm hatten einen Zusammenhang zwischen einer Stimulation fr{\"u}her Entwicklungsstadien der Parasitenlarven mit dem Zytokin BMP-2 und dessen rascherer Entwicklung in sp{\"a}tere Entwicklungsstadien nahegelegt. Die Auswirkung einer Behandlung fr{\"u}her Entwicklungsstadien mit dem Zytokin BMP-2 auf die jeweilige Genexpression wurde daher f{\"u}r die ausgew{\"a}hlten 15 Gene {\"u}berpr{\"u}ft. F{\"u}nf Gene zeigten unter dessen Einfluss eine verst{\"a}rkte Expression. Zwei darunter waren solche, die eine st{\"a}rkere Expression in sp{\"a}ten Larvenstadien aufwiesen. Diese zwei Gene stellen nun Kandidaten dar, die an der Entwicklung von E.multilocularis maßgeblich beteiligt sein k{\"o}nnten. Durch die Untersuchungen dieser Arbeit ergaben sich wichtige Hinweise auf die Entwicklung und die Regulationsmechanismen der Genexpression von E. multilocularis. Sie bilden eine Grundlage, die Rolle der Homeoboxgene f{\"u}r den Fuchsbandwurm n{\"a}her zu beschreiben und die hormonelle Kreuzregulation zwischen Parasit und Wirt weiter zu studieren.}, subject = {Fuchsbandwurm}, language = {de} } @phdthesis{Kotzsch2008, author = {Kotzsch, Alexander}, title = {BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2008}, abstract = {Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquit{\"a}re, sekretierte Proteine mit vielf{\"a}ltigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellul{\"a}ren Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhom{\"o}ostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt - und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signal{\"u}bermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-\&\#946;s und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen - Typ I und Typ II - existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen f{\"u}r die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verf{\"u}gung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuit{\"a}t {\"u}ben BMPs ihre biologische Funktion {\"u}berwiegend hochspezifisch aus, d.h. abh{\"a}ngig vom Liganden werden spezifische zellul{\"a}re Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellul{\"a}rer Signalkaskaden zusammenh{\"a}ngen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals", repr{\"a}sentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere {\"u}bermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel f{\"u}r Bindungspromiskuit{\"a}t und -spezifit{\"a}t. W{\"a}hrend BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinit{\"a}t bindet („promiske Interaktion"), zeigt GDF-5 eine 15-20fach h{\"o}here Bindungsaffinit{\"a}t zu BMPR-IB („spezifische" Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch {\"u}beraus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden bin{\"a}re und tern{\"a}re Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilit{\"a}t auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung n{\"a}her zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgekl{\"a}rt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. W{\"a}hrend in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinit{\"a}t bestimmt, tr{\"a}gt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit" vorliegt und die Molek{\"u}le entsprechend „aufeinander falten". (2) Die Bindungsspezifit{\"a}t wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, f{\"u}hrt erst die „richtige" Kombination aus Flexibilit{\"a}t in den Schleifen und Rigidit{\"a}t des Rezeptorgrundger{\"u}sts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplement{\"a}ren Oberfl{\"a}che. Die mangelnde sterische Komplementarit{\"a}t von Ligand- und Rezeptoroberfl{\"a}chen f{\"u}hrt zu der niedrigeren Bindungsaffinit{\"a}t von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgel{\"o}sten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne, das Transmembransegment und die intrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedom{\"a}nen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. M{\"o}glicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedom{\"a}nen der Typ I und Typ II Rezeptoren f{\"u}r eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren m{\"o}glicherweise vom Liganden abh{\"a}ngt. Angesichts der Bindungspromiskuit{\"a}t unter BMP-Liganden und -Rezeptoren k{\"o}nnten so spezifische Signale {\"u}bermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion m{\"o}glich ist, kann nun f{\"u}r die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden.}, subject = {Cytokine}, language = {de} } @phdthesis{Kottmair2014, author = {Kottmair, Mathias}, title = {Bambi - Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in h{\"o}heren Tieren, die viele Vorg{\"a}nge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen {\"u}ber absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt {\"u}ber promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabh{\"a}ngig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranst{\"a}ndigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegen{\"u}ber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg {\"u}ber Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war. In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne von hBambi anhand der gel{\"o}sten Kristallstruktur der extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlussk{\"o}rpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualit{\"a}tskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekund{\"a}rstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinit{\"a}t zu ann{\"a}hernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodom{\"a}nen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur f{\"a}lschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird {\"u}berdies nicht {\"u}ber die extrazellul{\"a}re Dom{\"a}ne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabh{\"a}ngige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich best{\"a}tigten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chim{\"a}re Konstrukte aus f{\"u}r Bambi- und BR1A-Dom{\"a}nen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgef{\"u}hrt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, h{\"o}here Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chim{\"a}ren Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antik{\"o}rper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellul{\"a}ren BR1A-Dom{\"a}ne mit zugeh{\"o}riger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, n{\"a}mlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein f{\"u}r die Strukturaufkl{\"a}rung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalit{\"a}t dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verst{\"a}ndnis der ICD aufkl{\"a}rende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament f{\"u}r weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Koerdt2011, author = {Koerdt, Steffen Christian Alexander}, title = {Immunhistochemische Untersuchungen zur Expression von Wachstumsfaktoren im Rahmen der Vaskularisation kn{\"o}cherner Kieferkammaugmentate im Schafmodell}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-69798}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2011}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression unterschiedlicher Marker f{\"u}r die Vaskularisation in verschiedenen Modifikationen zur Unterkieferaugmentation mit autologem kortikospongi{\"o}sen Beckenkammtransplantaten in-vivo am Schafmodell untersucht. Wie schon aus Voruntersuchungen bekannt, zeigte vor allem die Modifikation des Transplantatlagers in der Kombination einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran mit dem Knochenersatzmaterial (KEM) Bio-Oss® und einem kortikospongi{\"o}sen Transplantat die geringsten Resorptionsraten. Dieser Konditionierung wurden verschiedene andere Modikifationen des Transplantatlagers gegen{\"u}bergestellt und jeweils die Expression der Vaskularisationsmarker untersucht und verglichen. Sowohl die Untersuchungen zur Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und seinen Rezeptor-Isoformen VEGF-Rezeptor 1 und VEGF-Rezeptor 2, sowie den NOS-Isoformen eNOS und iNOS zeigen alle eine signifikant vermehrte Expression in der Konditionierung mit Bio-Oss® als KEM und einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran. Lediglich die Expression des von-Willebrand-Faktors (vWF) als Marker des Endothels zeigte keine signifikant vermehrte Expression in der mit Bio-Oss® und Bio-Gide® modifizierten Gruppe. Hier w{\"a}re die Tatsache, dass der vWF auch als Marker der endothelialen Dysfunktion beschrieben wird und in den klinisch st{\"a}rker atrophierten Modifikation vermehrt exprimiert wird, eine Erkl{\"a}rungsm{\"o}glichkeit. Die Untersuchungen zur Expression der Vaskularisationsmarker hinsichtlich der Regionen im Augmentat zeigen sowohl bei BMP-2 wie auch bei VEGF und seinen Rezeptorisoformen VEGF-R1 und VEGF-R2 eine signifikant vermehrte Expression im Bereich des Transplantates in der Bio-Oss® Modifikation. Diese Ergebnisse st{\"u}tzen den klinischen Aspekt der guten Vaskularisierung des Transplantates und unterstreichen die Bedeutung der Wachstumsfaktoren f{\"u}r die Vaskularisierung im Transplantat. Bei den F{\"a}rbungen auf NOS findet sich eine signifikant vermehrte Expression im Transplantatlager. Diese Ergebnisse stellen die Bedeutung von NOS f{\"u}r die Regulation der Osteogenese und die direkten Wirkungen auf Osteoblasten und Osteoklasten. Die Tatsache, dass gerade in der Bio-Oss® Modifikation, in der klinisch die geringste Resorption zu beobachten war, signifikant mehr Vaskularisationsmarker exprimiert wurden, ist Nachweis der besseren Vaskularisation dieser Konditionierung und unterstreicht sowohl den Nutzen von KEM wie Bio-Oss® bei Transplantationen autologen Knochens, wie auch die M{\"o}glichkeiten der therapeutischen Verwendung einzelner Wachstumsfaktoren wie z. B. BMP-2.}, subject = {Unterkiefer}, language = {de} } @phdthesis{Keller2004, author = {Keller, Sascha}, title = {Struktur- und Funktionsanalysen an BMP Ligand-Rezeptor-Komplexen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-12467}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2004}, abstract = {F{\"u}r BMPs wie auch die anderen Mitglieder der TGF-beta-Superfamilie beginnt der Signalweg mit der Bindung des Liganden an zwei Typen transmembran{\"a}rer Rezeptoren. Die Ligand-Rezeptor Interaktionen sind dabei durch unterschiedliche Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t gekennzeichnet und bilden wahrscheinlich die Grundlage f{\"u}r das breite Spektrum biologischer Funktionen. In dieser Arbeit wurde mittels einer Struktur- und Funktionsanalyse von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen die molekulare Basis f{\"u}r die Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t dieser Wechselwirkungen untersucht. Hierf{\"u}r wurde die Kristallstruktur des BMP-2 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplexes bei einer Aufl{\"o}sung von 1,9{\AA} ermittelt. Mit der h{\"o}heren Aufl{\"o}sung war die Charakterisierung der geometrischen Parameter eines Netzwerks von zehn Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen in der Interaktionsfl{\"a}che zwischen BMP-2 und BR-IAec m{\"o}glich. Deren zentrale Bedeutung f{\"u}r dieWechselwirkung konnte auch durch funktionelle Analyse best{\"a}tigt werden. So stellen die im Zentrum der Bindungsfl{\"a}che liegenden Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen BMP-2 Leu51 (N) : BR-IAec Gln86 (OE1) und BMP-2 Leu51 (O) : BR-IAec Gln86 (NE1), sowie die BMP-2 Asp53 (N) : BR-IAec Cys77 (O) H-Br{\"u}cke die Hauptdeterminanten der Ligand-Rezeptor Bindung dar. Dar{\"u}ber hinaus ließ sich aus der strukturellen Analyse des "wrist"-Epitops von BMP-2 eine besondere Bedeutung der Pr{\"a}-Helix Schleife L2, sowie der im Kontakt eingeschlossenen Wassermolek{\"u}le f{\"u}r die Anpassung der Bindungsfl{\"a}che an unterschiedliche Interaktionspartner ableiten. Diese Ergebnisse bilden die Grundlage f{\"u}r ein neues Modell zur Beschreibung von Affinit{\"a}t und Spezifit{\"a}t der hochaffinen BMP-Typ I Rezeptor Interaktion. Dabei stellen die Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen den Hauptanteil zur Bindungsenergie, w{\"a}hrend die hydrophobe Umgebung in der Interaktionsfl{\"a}che die Bildung von Wasserstoff-Br{\"u}ckenbindungen energetisch beg{\"u}nstigen und hydrophobe Wechselwirkungen nur geringf{\"u}gigen Einfluss auf die Affinit{\"a}t nehmen. Die vorliegenden Arbeit beschreibt zudem die Pr{\"a}paration und Kristallisation von bin{\"a}ren Ligand-Typ I Rezeptor Komplexen f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie die der tern{\"a}ren Komplexe von BMP-2, BR-IAec und ActR-IIec bzw. BR-IIec. Die extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen der hierf{\"u}r verwendeten Rezeptoren wurden durch Expression in E.coli oder Sf-9 Insektenzellen erhalten. Ihre funktionelle Charakterisierung erfolgte durch BIAcore Interaktionsanalyse an immobilisierten Liganden, wobei in Abh{\"a}ngigkeit vom Ligand-Rezeptor Komplex unterschiedliche Affinit{\"a}ten ermittelt werden konnten. In {\"U}bereinstimmung mit den hierbei erhaltenen Daten wurden die Ligand-BMP Typ IB Rezeptor Komplexe f{\"u}r BMP-2, BMP-6 und GDF-5, sowie der GDF-5 : BR-IAec Ligand-Rezeptor Komplex pr{\"a}pariert. Des Weiteren konnte die Bildung des tern{\"a}ren BMP-2 : BR-IAec : ActR-IIec Ligand-Rezeptor Komplexes in L{\"o}sung nachgewiesen werden. F{\"u}r all diese Komplexe konnten Kristallisationsbedingungen ermittelt werden. Trotz Optimierung dieser Bedingungen reichte die Qualit{\"a}t der erhaltenen Kristalle nicht f{\"u}r eine Aufkl{\"a}rung der Struktur aus. F{\"u}r eine detailliertes Verst{\"a}ndnis der Mechanismen der Rezeptoraktivierung muss die strukturelle und funktionelle Charakterisierung von BMP Ligand-Rezeptor Komplexen fortgef{\"u}hrt werden. Die pr{\"a}sentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass {\"u}ber die Kenntnis der einzelnen Affinit{\"a}ten und die gezielte Modifikation der Interaktionspartner eine erfolgreiche Strukturanalyse dieser Ligand-Rezeptor Komplexe m{\"o}glich ist.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Hellmann2013, author = {Hellmann, Tina Verena}, title = {Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2013}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die gr{\"o}ßte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schl{\"u}sselfunktionen w{\"a}hrend der fr{\"u}hen Embryogenese inne und regulieren dar{\"u}ber hinaus die Organogenese sowie die Hom{\"o}ostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale {\"u}ber zwei Typen transmembran{\"a}rer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur f{\"u}nf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegen{\"u}ber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuit{\"a}t der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden k{\"o}nnen, m{\"u}ssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. K{\"u}rzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben - die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. F{\"u}r das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abh{\"a}ngige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widerspr{\"u}chlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zun{\"a}chst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies erm{\"o}glichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodom{\"a}nen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten dar{\"u}ber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodom{\"a}nen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der l{\"o}sliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabh{\"a}ngig inhibiert, w{\"a}hrend die membranverankerte RGMb-Variante eine Verst{\"a}rkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberfl{\"a}chen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodom{\"a}nen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivit{\"a}t neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich f{\"u}r die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodom{\"a}ne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren k{\"o}nnen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere {\"U}berlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren f{\"u}r die Ausbildung der beobachteten Selektivit{\"a}t verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellul{\"a}rer Ebene analysieren zu k{\"o}nnen, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte f{\"u}r BMP-Rezeptoren sowie f{\"u}r RGMb synthetisiert und ein funktionelles F{\"a}rbeprotokoll f{\"u}r die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit pr{\"a}sentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt f{\"u}r die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Dar{\"u}ber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, m{\"o}glicherweise v{\"o}llig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifit{\"a}t und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden k{\"o}nnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge f{\"u}r eine zuk{\"u}nftige detaillierte Aufkl{\"a}rung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abh{\"a}ngigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellul{\"a}rer Ebene dar.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Heinecke2010, author = {Heinecke, Kai}, title = {Die Dynamik der prim{\"a}ren Erkennungsschritte von BMP-Rezeptoren}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-49257}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2010}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden zusammen mit den Activinen, Growth and Differentiation Factors (GDFs) und Transforming Growth Factor \&\#946; (TGF-\&\#946;) die Transforming Growth Factor \&\#946;-Superfamilie von sekretierten Signalproteinen. Sie spielen eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Erhaltung und Regeneration von Geweben und Organen. Die Signalvermittlung dieser Proteine erfolgt durch die Bindung von zwei verschiedenen Typen von Serin-/Threonin-Kinaserezeptoren, die als Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren bezeichnet werden. Im ersten Schritt erfolgt die Bindung an den hochaffinen Rezeptor (im Fall von BMP-2 der Typ-I-Rezeptor), im n{\"a}chsten Schritt wird der niederaffine Rezeptor in den Komplex rekrutiert. Bis heute sind lediglich sieben Typ-I- und f{\"u}nf Typ-II-Rezeptoren bekannt, was auf eine Promiskuit{\"a}t in der Liganden-Rezeptor-Interaktion schließen l{\"a}sst. Die Architektur beider Rezeptorsubtypen ist dabei relativ {\"a}hnlich. Beide bestehen aus einer ligandenbindenden extrazellul{\"a}ren Dom{\"a}ne, einer Transmembrandom{\"a}ne sowie einer intrazellul{\"a}ren Kinasedom{\"a}ne. Eine nacheinander ablaufende Transphosphorylierung der intrazellul{\"a}ren Dom{\"a}nen f{\"u}hrt zu einer Phosphorylierung von SMAD-Proteinen, die dann als nachgeschaltete Vermittler fungieren und die Transkription regulierter Gene ausl{\"o}sen. Im Hauptteil dieser Arbeit wurden die initialen Schritte der Rezeptorkomplexformierung sowie die Mobilit{\"a}t der Rezeptoren mit Hilfe von fluoreszenzmikroskopischen Methoden untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass f{\"u}r die Bildung eines Signalkomplexes eine bestimmte Schwellenkonzentration des Liganden n{\"o}tig ist und dass der Mechanismus nach einem Alles-oder-Nichts-Prinzip wie ein Schalter funktioniert. Außerdem konnten Unterschiede in der Nutzung der gleichen Rezeptoren durch verschiedene Liganden festgestellt werden. Die anderen Teile der Arbeit befassen sich mit der Funktionalit{\"a}t der verschiedenen Rezeptordom{\"a}nen in der Signal{\"u}bermittlung, der Analyse von hoch- und niederaffinen Ligandenbindestellen auf ganzen Zellen sowie dem Einfluss des SMAD- und des MAPK-Signalwegs auf die Induktion der Alkalischen Phosphatase. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Art der SMAD-Phosphorylierung allein vom Typ der Kinasedom{\"a}ne abh{\"a}ngig ist, dass auf einer Zelle verschiedene Rezeptorpopulationen existieren, welche von unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen angesprochen werden, und dass die Induktion der Alkalischen Phosphatase stark vom zeitlichen Verlauf der SMAD- und MAPK-Aktivierung abh{\"a}ngig ist.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} } @phdthesis{Fuchs2012, author = {Fuchs, Andreas Rudolf}, title = {3D-Pulverdruck von Zellkulturtr{\"a}gern mit Magnesium-Phosphat-Chemie}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-77415}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2012}, abstract = {In der vorliegenden Arbeit wurden erstmals im 3D-Pulerdruckverfahren hergestellte Struvit-Matrizes auf ihre Eignung als Tr{\"a}germaterial f{\"u}r Knochenzellen in vitro untersucht. Hierzu wurde die Zytokompatibilit{\"a}t sowie die chemische L{\"o}slichkeit von gedruckten Struvit-Strukturen betrachtet. In einem zweiten Schritt wurde untersucht, ob die biologische Funktion von BMP-2-L{\"o}sungen nach Durchlaufen des Druckprozesses erhalten bleibt und ob es m{\"o}glich ist, BMP-2 unter Beibehaltung seiner biologischen Wirksamkeit direkt in Struvit-Matrizes zu drucken. Als Reaktanten zur Herstellung der Struvit-Matrizes wurde modifiziertes Farringtonit-Pulver mit definierter K{\"o}rnung und eine {\"a}quimolare Binder-L{\"o}sung aus DAHP und ADHP verwendet. Die untersuchten Zellkulturtr{\"a}ger mit Magnesiumammoniumphosphatchemie zeigten eine ausreichende Zytokompatibilit{\"a}t in vitro. Außerdem wurde gezeigt, dass thermolabile Proteine wie BMP-2 im 3D-Pulverdruckverfahren unter weitgehender Beibehaltung ihrer biologischen Wirksamkeit in vitro grunds{\"a}tzlich prozessierbar sind. Die Freisetzung direkt eingedruckter Proteine aus den Struvit-Matrizes blieb jedoch hinter den Erwartungen zur{\"u}ck. Mit Struvit steht ein alternatives Zementsystem f{\"u}r den 3D-Pulverdruck zur Verf{\"u}gung, welches spezifische Vorteile gegen{\"u}ber den etablierten Calciumphosphaten bietet. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Ursache f{\"u}r die geringe BMP-Freisetzung aus den Struvit-Matrizes zu ermitteln und die Vorteile der neutralen Abbindereaktion voll nutzen zu k{\"o}nnen.}, subject = {Struvit}, language = {de} } @phdthesis{Fiebig2014, author = {Fiebig, Juliane}, title = {Twisted gastrulation - ein BMP-Modulatorprotein mit dualer Funktionalit{\"a}t}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-107270}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2014}, abstract = {Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) sind extrazellul{\"a}r vorkommende Wachstumsfaktoren und werden der Superfamilie der Transforming Growth Factors β (TGF-β) zugeordnet. Entgegen ihrem Namen spielen sie nicht nur eine Rolle bei der Ausbildung und Regeneration der Knochenmatrix, sondern regulieren bereits w{\"a}hrend der Embryonalentwicklung zahlreiche Abl{\"a}ufe. Unter anderem sind sie an der Festlegung der K{\"o}rperachsen und Entwicklung der Organanlagen beteiligt. Sp{\"a}ter steuern sie das Wachstum von Organen und Geweben und sind schließlich im adulten Organismus f{\"u}r deren Hom{\"o}ostase und Regeneration verantwortlich. Bei fast allen Mitgliedern der TGF-β Superfamilie erfolgt die Signalbildung nach derzeitigem Kenntnisstand durch die Bindung an transmembrane Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, die in zwei Untergruppen unterteilt werden k{\"o}nnen. Dabei werden von einem Liganden jeweils zwei Typ I- und zwei Typ II-Rezeptoren gebunden, wodurch ein aktiver Komplex entsteht, der im Inneren der Zelle eine Signalkaskade ausl{\"o}st. Um die vielseitigen Aufgaben der BMPs spezifisch vermitteln zu k{\"o}nnen, gibt es zahlreiche Mechanismen, die Signalbildung stringent neben der Ligand-Rezeptor-Interaktion zu regulieren. Die Small Mothers Against Decapentaplegic (Smad)-Signalkaskade im Zellinneren wird beispielsweise durch die Interaktion der inhibitorischen Smads mit rezeptor-regulierten Smads oder durch den proteasomalen Abbau der rezeptor-regulierten Smads durch die Bindung von Ubiquitin-Ligasen der Smurf-Familie beeinflusst. Auch auf Membranebene besteht die M{\"o}glichkeit der negativen Signalmodulation durch Pseudorezeptoren oder der Verst{\"a}rkung der Signalbildung durch positive Effektoren wie beispielsweise aktivit{\"a}tssteigernde Co-Rezeptoren. Ein Charakteristikum der TGF-β Superfamilie stellt jedoch die Vielzahl an sekretierten, l{\"o}slichen Modulatorproteinen dar. Die meist glykosylierten Proteine {\"u}ben, bis auf wenige Ausnahmen, einen antagonistischen Effekt auf die BMPs aus. Bei dem BMP-spezifischen Modulatorprotein Twisted gastrulation handelt es sich um ein extrazellul{\"a}res Glykoprotein, das im Gegensatz zu den meisten anderen BMP-Modulatoren jedoch eine duale Funktion als Besonderheit aufweist. Es zeigt zum einen eine anti-BMP-Wirkung, indem es den BMP-inhibierenden Einfluss von Chordin durch Bildung eines stabilen tern{\"a}ren Komplexes verst{\"a}rkt; andererseits kann Twisted gastrulation in Gegenwart spezifischer Metalloproteasen eine proteolytische Spaltung von Chordin und die anschließende Freisetzung von aktivem BMP f{\"o}rdern und so eine BMP-Aktivit{\"a}t vermittelnde Wirkung aufweisen. Twisted gastrulation hat keine beziehungsweise nur eine {\"a}ußerst geringe Homologie zu anderen (Modulator)Proteinen. Um daher den komplexen Wirkmechanismus detailliert molekular beschreiben zu k{\"o}nnen, ist die Aufkl{\"a}rung der Struktur /Funktions-beziehungen essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnten unterschiedliche Expressionsstrategien f{\"u}r die rekombinante Herstellung von Twisted gastrulation etabliert werden, welche eine umfassende Charakterisierung des Proteins in vitro erm{\"o}glichen. Erste Kristallisationsversuche von isoliertem Twisted gastrulation f{\"u}r die Aufkl{\"a}rung der dreidimensionalen Struktur mittels R{\"o}ntgenbeugung verliefen ohne Erfolg, allerdings gelang die Pr{\"a}paration stabiler tern{\"a}rer Proteinkomplexe f{\"u}r weiterf{\"u}hrende Kristallisationsans{\"a}tze. Hochdurchsatzverfahren f{\"u}r die Expression und Interaktionsanalyse erlauben zudem die Untersuchung einer Vielzahl von Twisted gastrulation-Proteinvarianten. Auf diese Weise konnten Aminos{\"a}uren identifiziert werden, die an der Wechselwirkung von Twisted gastrulation mit seinem Interaktionspartner BMP 2 beteiligt sind. Dies erm{\"o}glichte eine detaillierte Lokalisation des Bindeepitops im N-terminalen Bereich von Twisted gastrulation. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass die Glykosylierung von Twisted gastrulation f{\"u}r die Wechselwirkung mit BMP-2 von Bedeutung ist. Eine experimentelle Strukturanalyse von Twisted gastrulation f{\"u}r die detaillierte Aufkl{\"a}rung des Mechanismus der Interaktion mit BMP-2 und anderen Modulatorproteinen bleibt allerdings weiterhin aufgrund der Einzigartigkeit dieses Modulatorproteins zwingend erforderlich. F{\"u}r eine Fortsetzung der Untersuchungen bietet der stabile tern{\"a}re Komplex eine gute Voraussetzung in Hinblick auf weitere Kristallisationsans{\"a}tze.}, subject = {Knochen-Morphogenese-Proteine}, language = {de} }