@phdthesis{Guhling2006,
  author    = {Guhling, Ortwin},
  title     = {Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpenoide : Klonierung und Charakterisierung von Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis und Lycopersicon esculentum},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-21796},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2006},
  abstract  = {Triterpene finden sich in großer struktureller Vielfalt als Sekund{\"a}rmetabolite in Form von glycosylierten Verbindungen, aber auch als Aglykone, in zahlreichen Pflanzen. In einigen Arten akkumulieren Triterpene in großen Mengen als kutikul{\"a}re Wachsbestandteile im prim{\"a}ren Abschlussgewebe und beeinflussen auf diese Weise die Grenzfl{\"a}cheneigenschaften der oberirdischen Pflanzenorgane. In der vorliegenden Arbeit wurde die kutikulaspezifische Biosynthese von Triterpenen durch die Kombination molekulargenetischer und analytischer Methoden exemplarisch an Ricinus communis eingehend untersucht. Die Rizinus-Pflanze tritt in zwei Sprossachsenph{\"a}notypen in Erscheinung: Der Glossy-Ph{\"a}notyp ist frei von epikutikul{\"a}ren Wachskristallen, wohingegen die Sprossachsen von Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps von fadenf{\"o}rmigen epikutikul{\"a}ren Wachskristallen bedeckt sind. Eine vergleichende chemische Analyse zeigte, dass 67 Tage alte Hypokotyle der Individuen des Glossy-Ph{\"a}notyps mit etwa 12,5 µg/cm^2 kutikul{\"a}rem Wachs bedeckt sind, die Zusammensetzung des kutikul{\"a}ren Wachsgemisches wird von VLC-aliphatischen Verbindungen dominiert. Hypokotyle der Individuen vom Glaucous-Ph{\"a}notyp weisen mit 51,9 µg/cm^2 dagegen eine weit h{\"o}here Wachsbelegung auf, wobei das Wachsgemisch von Triterpen-Verbindungen, vor allem durch die Hauptkomponente Lupeol mit 56\% der Gesamtwachsmenge dominiert wird. Um die Akkumulation von Lupeol im Laufe der fr{\"u}hen Sprossachsenentwicklung des Glaucous-Ph{\"a}notyps zu dokumentieren, wurden entsprechende wachsanalytische Beprobungen an Hypokotylen durchgef{\"u}hrt. Es zeigte sich, dass Lupeol bereits in einer fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit hohen Raten in die Kutikula eingelagert wird: zwischen Tag 6 und Tag 25 nach der Keimung der Pflanzen nimmt die Lupeolwachsbelegung mit einer Rate von 1,2 µg cm^2 und Tag zu; dies entspricht einer t{\"a}glichen Lupeol-Zunahme von 0,013 ng/Zelle zwischen Tag 11 und Tag 18. Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen belegten, dass die Lupeolakkumulation von einer starken Zunahme der fadenf{\"o}rmigen Wachskristalle in der fr{\"u}hen Hypokotylentwicklung begleitet wird. Vor dem Hintergrund der wachsanalytischen und mikromorphologischen Daten war es von zentraler Bedeutung, die f{\"u}r die Biosynthese des kutikul{\"a}ren Lupeols verantwortliche Triterpensynthase zu klonieren. Mit Hilfe des entwickelten Primerdesigns zur homologiebasierten Klonierung pflanzlicher 2,3-Oxidosqualenzyklasen wurden zwei Epoxysqualenzyklasen aus Ricinus communis kloniert und durch heterologe Expression in der Lanosterolsynthase-defizienten Hefemutante GIL 77 jeweils als Cycloartenolsynthase (RcCAS1) und monofunktionale Lupeolsynthase (RcLUS1) charakterisiert. Die auf den Glaucous-Ph{\"a}notyp beschr{\"a}nkte sprossachsenspezifische Expression und die hohe Expressionsrate von RcLUS1 in der fr{\"u}hen Entwicklungsphase mit einem Peak an Tag 12 nach der Keimung stimmte exakt mit der zeitlichen Akkumulation von Lupeol in der Sprossachsenkutikula bei Individuen des Glaucous-Ph{\"a}notyps {\"u}berein. Damit handelt es sich bei RcLUS1 um die erste charakterisierte Triterpensynthase, die f{\"u}r die Bildung kutikul{\"a}rer Triterpene verantwortlich gemacht werden kann. Die Untersuchungen an R. communis zeigen, dass die Biosynthese von kutikul{\"a}ren Triterpenen {\"u}ber die enzymatisch gesteuerte Zyklisierung von 2,3-Oxidosqualen bewerkstelligt wird. Offensichtlich spielt eine Transkriptionsregulation auf der Ebene der jeweiligen Triterpensynthase dabei eine zentrale Rolle. Phylogenetische Vergleiche zeigten, dass RcLUS1 nur relativ geringe Sequenz{\"a}hnlichkeiten zu den bisher charakterisierten Lupeolsynthasen aufzeigt und somit als Vertreter einer bisher nicht beschriebenen Klasse pflanzlicher Triterpensynthasen angesprochen werden muss. Durch gerichtete Mutagenisierung wurde die RcLUS1-Mutante F257W hergestellt und funktionell charakterisiert. Das Produktspektrum der mutagenisierten Lupeolsynthase verschob sich von Lupeol nach \&\#946;-Amyrin und best{\"a}tigte damit die Bedeutung des dem Phenylalanin in Amyrinsynthasen korrespondierenden Tryptophans f{\"u}r die katalytische Funktionalit{\"a}t dieser Enzyme. Mit der Klonierung der Triterpensynthasen LeTTS1 und LeTTS2 aus Lycopersicon esculentum wurde der erste wichtige Schritt f{\"u}r ein tieferes Verst{\"a}ndnis der Biosynthese kutikul{\"a}rer Triterpene in dieser Pflanze getan. LeTTS1 konnte als \&\#946;-Amyrinsynthase charakterisiert werden. Im Gegensatz zur Stammkutikula des Glaucous-Ph{\"a}notyps von Ricinus communis werden in die Fruchtkutikula von Tomate nicht nur ein, sondern mit \&\#945;-, \&\#946;- und \&\#948;-Amyrin gleich drei Triterpene in gr{\"o}ßeren Mengen eingelagert. Der Nachweis einer tats{\"a}chlichen Relevanz der klonierten OSCs f{\"u}r die Biosynthese dieser kutikul{\"a}ren Triterpene muss durch Untersuchungen zur Expression dieser Gene erbracht werden.},
  subject      = {Rizinus},
  language  = {de}
}