@phdthesis{Stempka2011,
  author    = {Stempka, Martin},
  title     = {Expression und Reinigung der SARS-Coronavirus-M<sup>pro</sup> und deren Co-Kristallisation mit spezifischen Inhibitoren},
  url       = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-57083},
  school      = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg},
  year      = {2011},
  abstract  = {Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom") handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivit{\"a}t einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schl{\"u}sselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren f{\"u}r diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolek{\"u}len an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Molek{\"u}ls pro Enzym-Monomer: {\"u}berraschenderweise hatten bis zu vier Molek{\"u}le MH211A bzw. zwei Molek{\"u}le UK-VI-1g an ein Proteasemolek{\"u}l gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminos{\"a}uren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der N{\"a}he der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimts{\"a}ure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei m{\"o}gliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer R{\"o}ntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass fr{\"u}her ver{\"o}ffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal {\"u}berdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und fr{\"u}heren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.},
  subject      = {SARS},
  language  = {de}
}