@phdthesis{Sampers2023, author = {Sampers, Ren{\´e}}, title = {Einfluss von Autophagie-modulierenden Wirkstoffen auf die Proliferation von oralen Tumorzelllinien}, doi = {10.25972/OPUS-32066}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-320662}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2023}, abstract = {Die Autophagie nimmt als ein zentraler Bestandteil des zellul{\"a}ren Metabolismus eine wichtige Rolle f{\"u}r die Proliferationsf{\"a}higkeit von Tumorzellen ein. Dabei zeigt sich, dass sich der Einfluss der Autophagie kontextabh{\"a}ngig zwischen und innerhalb einzelner Tumorentit{\"a}ten unterscheidet und das Tumorzellwachstum sowohl f{\"o}rdern als auch hemmen kann. Durch den Einsatz der Wirkstoffe Chloroquin, Bafilomycin und Rapamycin konnte effektiv die Autophagie in den untersuchten Zelllinien moduliert und durch Proteinanalyse mit Hilfe der SDS-Page validiert werden. Dosisabh{\"a}ngige Reduktionen der Zellzahlen konnten vor allem bei den inhibitorisch wirkenden Substanzen Chloroquin und Bafilomycin erreicht werden, w{\"a}hrend Rapamycin als Autophagie-induzierender Wirkstoff keine antiproliferativen Effekte erzeugen konnte. Auch FasL und TNFα konnten in den untersuchten Tumorzelllinien nur zu einer m{\"a}ßigen Zellzahlreduktion f{\"u}hren. Cisplatin hingegen konnte in allen Zelllinien dosisabh{\"a}ngige Zellzahlreduktionen induzieren. Durch die Kombination von Chloroquin mit FasL konnte in den FasL-responsiven Zelllinien eine signifikante Sensitivierung im Sinne einer Proliferationshemmung induziert werden. {\"A}hnliche Effekte ließen sich bei der Kombination von Rapamycin mit FasL beobachten. Auch f{\"u}r die MR konnte ein proliferationshemmender Effekt in den zwei untersuchten Tumorzelllinien FaDu und Detroit562 validiert werden. In der Kombination mit FasL wurde bei einer Zelllinie eine Sensitivierung auf das extrinsische Todessignal nachgewiesen. Die kombinatorische Anwendung der MR mit TNFα und Autophagiemodulatoren zeigte keine signifikanten, proliferationshemmenden Effekte. Auswirkungen ließen sich dagegen in der IL-8 Expression feststellen, wobei die MR allein zu einem signifikanten Anstieg f{\"u}hrte und Rapamycin die Expressionsrate in Kombination mit der MR signifikant senkte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit das Potenzial der Autophagiemodulation vor allem bei responsiven HNSCC-Tumorzellen auf. Auch die MR konnte in vitro vielversprechende Ergebnisse liefern. Die kontextabh{\"a}ngigen Auswirkungen der Autophagie auf das Tumorwachstum bedeuten allerdings auch eine Menge offener Fragen, die es in Zukunft zu kl{\"a}ren gilt, bevor die Autophagiemodulation Einzug in die klinische Praxis der Tumortherapie erhalten kann. Ausschlaggebend f{\"u}r die Weiterentwicklung effektiver Therapien wird unter anderem ein verbessertes Verst{\"a}ndnis {\"u}ber intrinsische und extrinsische Resistenzmechanismen sein und welche Rolle die Autophagie dabei einnimmt.}, subject = {Chloroquin}, language = {de} } @phdthesis{Stein2022, author = {Stein, Florian}, title = {Untersuchungen zur Aufkl{\"a}rung der adversen Effekte von HES auf Zellen (HK-2) des proximalen Nierentubulus}, doi = {10.25972/OPUS-28251}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-282514}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2022}, abstract = {In der Volumentherapie galt das Kolloid Hydroxyethylst{\"a}rke (HES) lange Zeit als ideale Infusionsl{\"o}sung und war der in Deutschland am h{\"a}ufigsten eingesetzte Plasmaexpander. In den letzten Jahren mehrten sich jedoch die Hinweise, dass HES insbesondere bei kritisch Kranken zu einer akuten Nierenfunktionsverschlechterung beitragen k{\"o}nnte, welche das klinische Ergebnis wesentlich beeinflusst. Der genaue Pathomechanismus ist bis heute nicht gekl{\"a}rt. Bekannt ist, dass sich HES nach intraven{\"o}ser Applikation in vielen verschiedenen Geweben ablagert, wobei eine renale Anreicherung bevorzugt in proximalen Tubuluszellen stattfindet. Histopathologisch finden sich große Mengen intrazellul{\"a}rer Vesikel im Zytoplasma, welche zu einer Zellschwellung f{\"u}hren, die auch als osmotische Nephrose bezeichnet und als prinzipiell reversibel erachtet wird. Der zellul{\"a}re Abbau soll dabei im Allgemeinen {\"u}ber das lysosomale System stattfinden. Dieses ist fester Bestandteil der Autophagie, welche ein evolution{\"a}r in allen Eukaryonten konservierter stress-induzierter kataboler Prozess ist, der der zellul{\"a}ren Hom{\"o}ostase und energieeffizienten Selbstreinigung dient. Hierbei werden defekte Makromolek{\"u}le durch Lysosomen in ihre Grundbestandteile zerlegt und der Zelle als Bausteine wieder zur Verf{\"u}gung gestellt. In dieser Arbeit wurde in einem ersten Schritt der Einfluss von HES der 3. Generation auf die Viabilit{\"a}t von HK-2-Zellen mit zwei unabh{\"a}ngigen in vitro Assays {\"u}berpr{\"u}ft. Diese beruhen auf einem Substratumsatz durch zytosolische bzw. mitochondriale Dehydrogenasen. F{\"u}r beide Assays konnte zu verschiedenen Inkubationszeitpunkten bis 21 Stunden jeweils eine konzentrationsabh{\"a}ngige Viabilit{\"a}tsreduktion durch HES festgestellt werden, welche auch nach einer „Regenerationsphase" noch verringert nachweisbar und somit partiell reversibel war. Im n{\"a}chsten Schritt wurde die Hypothese {\"u}berpr{\"u}ft, ob eine medikament{\"o}se Induktion der Autophagie die beobachtete Viabilit{\"a}tsreduktion abschw{\"a}chen oder sogar aufheben kann. Hierbei wurde analog zu einer Arbeit von Liu et al. (2014) eine Inkubationszeit von insgesamt acht Stunden gew{\"a}hlt, da nach diesem Zeitraum eine perinukle{\"a}re Cluster-Bildung der Lysosomen beobachtet werden konnte, welche f{\"u}r eine erh{\"o}hte Autophagierate spricht. Es kamen im Folgenden HES-L{\"o}sungen von 0,75\% zum Einsatz, da diese aufgrund einer Viabilit{\"a}tsreduktion um zirka ein Drittel als am besten geeignet betrachtet wurden. Der Autophagieinduktor Everolimus zeigte hierbei in dem auf mitochondrialen Dehydrogenasen basierenden EZ4U-Assay eine fast vollst{\"a}ndige Aufhebung der HES-vermittelten Viabilit{\"a}tsreduktion. Dieser Effekt konnte durch den MAP-Kinase-Kinase-Blocker U0126 aufgehoben werden. Andere Autophagiemodulatoren hingegen bewirkten zumeist nur geringe {\"A}nderungen der Zellviabilit{\"a}t. Zuletzt wurde auf Proteinebene untersucht, ob zentrale Molek{\"u}le bzw. Komplexe der Autophagie unter HES zum einen im zeitlichen Verlauf und zum anderen unter zus{\"a}tzlichem Einfluss der Modulatoren eine Expressions{\"a}nderung aufwiesen. HES alleine bewirkte im zeitlichen Verlauf weitestgehend keine signifikante Expressions{\"a}nderung. Auch im Vergleich zu einer 0\%-HES-Kontrolll{\"o}sung konnten keine relevanten Unterschiede festgestellt werden. Die Koinkubation mit Everolimus f{\"u}hrte zu einer erh{\"o}hten Expression der Quotienten ppERK/pERK und LC3BII/LC3BI, U0126 konnte dies jeweils weitestgehend wieder aufheben. Perifosin bewirkte ebenso wie 3-Methyladenin eine verringerte Expression von Akt, Chloroquin f{\"u}hrte zu keiner signifikanten Expressions{\"a}nderung aller bestimmter Proteine. Dar{\"u}ber hinaus verursachten alle Modulatoren keine signifikante Expressions{\"a}nderung des zentralen Autophagiekomplexes Beclin1 sowie von LAMP2 und SQSTM1. Insgesamt sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine allgemeine, direkte Beeinflussung von klassischer Autophagie durch HES. Der Autophagieinduktor Everolimus zeigte jedoch einen protektiven Effekt auf die Zellviabilit{\"a}t, welcher vermutlich {\"u}ber einen Autophagie-vermittelten Weg verursacht wird. Unsere Arbeitsgruppe konnte dar{\"u}ber hinaus eine HES-vermittelte Reduktion von ROS beobachten. Das Autophagienetzwerk ist eng mit der zellul{\"a}ren Redox-Hom{\"o}ostase verkn{\"u}pft. Eine verminderte ROS-Bildung k{\"o}nnte zu einer verminderten Autophagierate und somit auch verringerten Zellviabilit{\"a}t f{\"u}hren, welche durch Everolimus kompensiert wird. Bisher ungekl{\"a}rt ist auch, auf welchem Weg HES in die Zelle aufgenommen wird. Denkbar w{\"a}re, dass gr{\"o}ßere HES-Molek{\"u}le via Endozytose in die Zelle gelangen. Hierbei ist der mTORC1-Komplex ein wichtiger Regulator, der durch Everolimus gehemmt wird und somit {\"u}ber eine verringerte HES-Aufnahme zu einer Viabilit{\"a}tssteigerung f{\"u}hren k{\"o}nnte. Kleinere HES-Molek{\"u}le dagegen k{\"o}nnten {\"u}ber Glukose-Transporter aufgenommen werden, die m{\"o}glicherweise {\"u}ber AMPK reguliert werden.}, subject = {Hydroxyethylst{\"a}rke}, language = {de} } @phdthesis{Stetter2021, author = {Stetter, Maurice}, title = {LC3-associated phagocytosis seals the fate of the second polar body in \(Caenorhabditis\) \(elegans\)}, doi = {10.25972/OPUS-23198}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-231981}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2021}, abstract = {This work investigates the death and degradation of the second polar body of the nematode C. elegans in order to improve our understanding how pluripotent undifferentiated cells deal with dying cells. With the use of fluorescence microscopy this work demonstrates that both polar bodies loose membrane integrity early. The second polar body has contact to embryonic cells and gets internalized, dependent on the Rac1-ortholog CED-10. The polar body gets degraded via LC3-associated phagocytosis. While lysosome recruitment depends on RAB-7, LC3 does not improve lysosome recruitment but still accelerates polar body degradation. This work establishes the second polar body as a genetic model to study cell death and LC3-associated phagocytosis and has revealed further aspects of phagosome maturation and degradation.}, subject = {Polk{\"o}rper}, language = {en} } @phdthesis{Boerner2020, author = {B{\"o}rner, Kevin}, title = {How CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells}, doi = {10.25972/OPUS-20023}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-200230}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2020}, abstract = {Genomweite Assoziationsstudien haben CLEC16A als ein Suszeptibilit{\"a}tsgen f{\"u}r Typ 1 Diabetes und weitere Autoimmunerkrankungen identifiziert. Die genaue Funktion von CLEC16A bleibt jedoch ungekl{\"a}rt. Studien zeigten, dass sowohl das Drosophila Ortholog ema als auch das murine Clec16a eine Rolle in Autophagie spielen. Autophagie tr{\"a}gt zur Beladung der MHC-Klasse-II Molek{\"u}le und somit der Antigenpr{\"a}sentation bei. Dar{\"u}ber hinaus konnten Studien belegen, dass Autophagie zur Antigenpr{\"a}sentation w{\"a}hrend der T-Zell Selektion in Thymus-Epithelzellen ben{\"o}tigt wird. Dies schl{\"a}gt eine m{\"o}gliche Funktion von CLEC16A in Thymus-Epithelzellen w{\"a}hrend der T-Zell Selektion vor. Außerdem berichteten Arbeiten, dass CLEC16A als quantitativer Trait Locus f{\"u}r seine Nachbargene fungiert und dass Clec16a KD in Langerhans Inseln im Pankreas die Insulinsekretion und den Glukosestoffwechsel beeintr{\"a}chtigt. Dieser Arbeit vorausgehend hatten Schuster et al. eine Clec16a KD NOD Maus generiert, welche vor spontanem autoimmunem Diabetes gesch{\"u}tzt war. F{\"u}r diese Arbeit wurde vermutet, dass CLEC16A als Suszeptibilit{\"a}tsgen f{\"u}r Typ 1 Diabetes den Prozess der Autophagie in Thymus-Epithelzellen beeintr{\"a}chtigt und somit Antigenpr{\"a}sentation und das T-Zell Repertoire beeinflusst. Um auf der Vorarbeit von Schuster et al. aufzubauen und diese zu erg{\"a}nzen, zielte diese Arbeit darauf ab, den Einfluss von CLEC16A auf Thymus-Epithelzellen zu untersuchen. Hierf{\"u}r wurde ein CLEC16A KD in menschlichen Zellen mittels RNA Interferenz erzeugt und Autophagie durch Immunoblotting untersucht. Zus{\"a}tzlich wurde die Entz{\"u}ndung im Pankreasgewebe von Clec16a KD NOD M{\"a}usen mittels H.E. F{\"a}rbung beurteilt und bewertet. Thymus-Transplanationen wurden durchgef{\"u}hrt, um zu sehen, ob der Einfluss von Clec16a KD T-Zell intrinsisch ist. Außerdem wurden intraperitoneale Glukosetoleranztests durchgef{\"u}hrt, um den Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD M{\"a}usen zu beurteilen. Schließlich wurden mittels qPCR Expressionslevel der benachbarten Gene, wie zum Beispiel Dexi und Socs1, erhoben, um die Eigenschaften von CLEC16A als quantitativer Trait Locus einzuordnen. Gemeinsam mit den Ergebnissen von Schuster et al. kann diese Arbeit aufzeigen, dass Clec16a KD die Auspr{\"a}gung von Insulitis im Pankreas reduziert und Clec16a KD NOD M{\"a}use vor spontanem Autoimmundiabetes sch{\"u}tzt. Dieser Schutz vor Erkrankung wird durch beeintr{\"a}chtigte Autophagie in Thymus-Epithelzellen hervorgerufen, welche die T-Zell Selektion beeinflusst und die Reaktivit{\"a}t von T-Zellen reduziert. Der Einfluss des Clec16a KD ist innerhalb des Thymus wirksam. Der Blutzuckerstoffwechsel in Clec16a KD NOD M{\"a}usen bleibt unver{\"a}ndert und kann deshalb als Ursache f{\"u}r den Schutz vor Type 1 Diabetes ausgeschlossen werden. Clec16a und Dexi zeigen {\"a}hnliche Expressionslevel auf, dennoch ben{\"o}tigt es weitere detaillierte Studien, um eine Beziehung zwischen den beiden Genen etablieren zu k{\"o}nnen. Letztlich konnte die Beeintr{\"a}chtigung von Autophagie in menschlichen CLEC16A KD Zellen nachgewiesen werden, was bedeutet, dass die Funktion von CLEC16A evolution{\"a}r konserviert ist und ein m{\"o}glicher Zusammenhang zwischen CLEC16A Polymorphismen und einem erh{\"o}hten Risiko f{\"u}r Typ 1 Diabetes im Menschen besteht.}, subject = {Thymus}, language = {en} } @phdthesis{Hahlbrock2017, author = {Hahlbrock, Theresa}, title = {Das onkologische Supportivprodukt Avemar: Untersuchungen zum antiproliferativen und antimetabolischen Effekt an humanen gastrointestinalen Tumorzellen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-145787}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2017}, abstract = {Unter dem Namen Avemar sind fermentierte Weizenkeimlinge als onkologisches Supportivprodukt erh{\"a}ltlich. Der hohe Anteil an 2,6-Dimethoxy-1,4-benzochinonen (DMBQ) in Avemar soll f{\"u}r das \(in\) \(vitro\) und \(in\) \(vivo\) belegte antikanzerogene Potential verantwortlich sein. DMBQ wirken {\"u}ber Semichinonradikale bzw. durch Ausbildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Induktion von oxidativem Stress zytotoxisch. Da Tumorzellen empfindlicher auf oxidativen Stress reagieren als gesunde Zellen, kann dies die selektive zytotoxische Wirkung von Avemar erkl{\"a}ren. Die Beteiligung von DMBQ am antiproliferativen Effekt von Avemar und die Wirkung von Avemar auf den Stoffwechsel maligner Zellen sind derzeit nicht eindeutig gekl{\"a}rt. Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar und DMBQ als Reinsubstanz wurden miteinander verglichen. Hierzu wurden DMBQ in einer zu Avemar mit 0,04\% Benzochinonen {\"a}quimolaren Konzentration von 24 μmol/L eingesetzt. Die Ergebnisse der Arbeit lassen den Schluss zu, dass der starke zytotoxische Effekt von Avemar bei BxPc-3 Zellen auf einen DMBQ-induzierten oxidativen Stress zur{\"u}ckzuf{\"u}hren ist. Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle wurde f{\"u}r BxPc-3 Zellen bei der Inkubation mit DMBQ eine 20-fache bzw. mit Avemar eine 40-fache Zunahme des ROS-Indikators 2',7'-Dichlorofluorescein gemessen. Im Westernblot ließ sich bei BxPc-3 Zellen das Enzym DT-Diaphorase, welches die Zellen vor Benzochinon-induziertem oxidativem Stress sch{\"u}tzt, nicht nachweisen. In Zellen der anderen beiden Zelllinien konnte das Enzym nachgewiesen werden. Das mangelnde Schutzsystem gegen{\"u}ber DMBQ-induziertem oxidativen Stress k{\"o}nnte demzufolge den DMBQ vermittelten zytotoxischen Effekt von Avemar in BxPc-3 Zellen erkl{\"a}ren. Zus{\"a}tzlich zum zytotoxischen Effekt wies Avemar zwei weitere antiproliferative Effekte auf: Zytostase bei 23132/87 Zellen und Wachstumsverz{\"o}gerung bei HRT-18 Zellen. Beide antiproliferativen Effekte waren auf die Beeinflussung des Zellmetabolismus zur{\"u}ckzuf{\"u}hren. Avemar verringerte den zellul{\"a}ren Glukoseverbrauch von HRT-18 Zellen um 69\% und von 23132/87 Zellen um 99\%. In 23132/87 Zellen korrelierte der verringerte Glukoseverbrauch mit einer Abnahme von ATP um 70\% und einem Zellzyklusarrest in der G\(_2\)/M Phase. Der durch die Inkubation von HRT-18 Zellen mit Avemar ausgel{\"o}ste verringerte Glukoseverbrauch beeinflusste hingegen weder den ATP-Gehalt noch den Zellzyklus, induzierte aber Autophagie. Dies ließ sich zeigen durch morphologische Ver{\"a}nderungen wie die Bildung von intrazellul{\"a}ren Vakuolen und durch den Nachweis des Autophagiemarkers LC3-II. Die Wertigkeit dieses Ph{\"a}nomens f{\"u}r die zytotoxischen Eigenschaften von Avemar ist in weiteren Untersuchungen zu kl{\"a}ren. Die antiproliferativen Eigenschaften von Avemar f{\"u}hren zu Ver{\"a}nderungen im Zellmetabolismus von gastrointestinalen Tumorzellen. Ausschlaggebend daf{\"u}r, welcher der drei antiproliferativen Effekte von Avemar (zytotoxisch, zytostatisch oder wachstumsverz{\"o}gernd) dominiert, sind vermutlich zelleigene Schutzsysteme und metabolische Charakteristika der Zellen. Avemar weist ein breites Spektrum antiproliferativer Effekte auf, deren Einfluss auf Zellfunktion und Zellstoffwechsel im Detail noch weiter untersucht werden sollte.}, subject = {Oxidativer Stress}, language = {de} } @phdthesis{Schober2016, author = {Schober, Kilian}, title = {Der Einfluss von CLEC16A auf Autophagie - ein neuer Mechanismus in der Pathogenese von Typ-1-Diabetes}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-138715}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2016}, abstract = {Das Gen CLEC16A ist mit der Autoimmunerkrankung Typ-1-Diabetes assoziiert. NOD-M{\"a}use mit einem Clec16a-KD sind vor der Entwicklung von Diabetes gesch{\"u}tzt, der entscheidende Wirkungsort f{\"u}r Clec16a sind dabei TECs. Im Rahmen zentraler Toleranz pr{\"a}sentieren TECs CD4+ Thymozyten Selbstantigene auf MHC II-Komplexen. Autophagie ist ein Zellprozess, der in TECs MHC II-Komplexen Selbstantigene zuf{\"u}hrt und so f{\"u}r die Entwicklung zentraler Toleranz essentiell ist. Das Ortholog von CLEC16A, ema, f{\"o}rdert die Bildung von Autophagosomen. So wurde vermutet, dass CLEC16A ein Suszeptibilit{\"a}tsgen f{\"u}r Typ-1-Diabetes ist, weil es Autophagie in TECs und somit deren MHC II-Beladung ver{\"a}ndert. Die vorliegende Arbeit schaltete CLEC16A in einer humanen Zelllinie durch RNAi aus und untersuchte die autophagische Aktivit{\"a}t dieser Zellen. Außerdem untersuchte sie die Autophagie von TECs aus NOD-Clec16a-KD-M{\"a}usen. Die Beurteilung erfolgte morphologisch durch Immunzytochemie bzw. -histochemie und funktionell durch Immunoblots. Es wurde gezeigt, dass der KD von CLEC16A in vitro und in vivo Autophagie funktionell beeintr{\"a}chtigt. Damit liefert die vorliegende Arbeit zusammen mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe Kissler einen m{\"o}glichen Erkl{\"a}rungsansatz, warum CLEC16A ein mit Typ-1-Diabetes assoziiertes Gen ist. CLEC16A f{\"o}rdert Autophagie in TECs, was die Selbstantigen-Beladung von MHC II-Komplexen ver{\"a}ndert. Selbstreaktive CD4+ Thymozyten f{\"u}hren so zum Verlust zentraler Toleranz und der Entwicklung von Typ-1-Diabetes. Weitere Untersuchungen sind jedoch notwendig, um diese Hypothese zu bekr{\"a}ftigen.}, subject = {Thymus}, language = {de} } @phdthesis{Frank2015, author = {Frank, Benjamin}, title = {Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-137277}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2015}, abstract = {Die von der WHO zu den 17 wichtigsten NTDs gez{\"a}hlte Leishmaniose wird durch intrazellul{\"a}re Parasiten der Gattung Leishmania hervorgerufen. Der Lebenszyklus der Parasiten besteht aus zwei Phasen. Die l{\"a}nglichen und beweglichen Promastigoten kennzeichnen die Phase in der Sandm{\"u}cke - der Vektor der Leishmaniose. Hingegen ist die Phase im S{\"a}ugerwirt durch runde unbewegliche Amastigoten charakterisiert. Aufgrund des Mangels an potenten antileishmanialen Therapien wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion zwischen L. m. Parasiten und der Hauptwirtszelle, der Makrophage, v. a. in Hinblick auf autophage Prozesse in den infizierten Makrophagen n{\"a}her untersucht, um demgem{\"a}ß neue Erkenntnisse zu gewinnen, welche bei der Herstellung zuk{\"u}nftiger anti-leishmanialer Medikamente helfen k{\"o}nnten. Bei der Autophagie handelt es sich um einen katabolen Prozess, wodurch Zellen bei Nahrungsmangel oder zellul{\"a}rem Stress ihre Hom{\"o}ostase erhalten k{\"o}nnen. Durch diesen Prozess k{\"o}nnen {\"u}berfl{\"u}ssige oder besch{\"a}digte Organellen recycelt werden, um die Funktionen der Zelle aufrechtzuerhalten. Daneben {\"u}bernimmt Autophagie auch eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von ins Zytosol eindringenden Pathogenen. Mittels des neu etablierten totalen Autophagiescore konnte festgestellt werden, dass Autophagie in L. m.-infizierten BMDM induziert wird. Die intrazellul{\"a}ren Amastigoten werden durch Autophagie in den BMDM verdaut. Die erh{\"o}hte autophage Aktivit{\"a}t konnte zudem durch Western-Blot-Analysen der autophagierelevanten Proteine ATG5, LC3B und UB best{\"a}tigt werden. Die molekulargenetischen Untersuchungen von L. m.-infizier-ten BMDM mithilfe von Affymetrix Microarrays f{\"u}hrten zu einem Netzwerk aus autophagierelevanten und infektionsspezifischen Genen, welches als LISA bezeichnet worden ist. Hier hat sich ebenfalls eine starke Verkn{\"u}pfung von autophagierelevanten Genen und den Genen der Glykolyse, einem zweiten katabolen Prozess, gezeigt. Zudem konnten zwei weitere autophagierelevante und infektionsspezifische Gene außerhalb von LISA identifiziert werden, n{\"a}mlich Bnip3 und Ctse, welche im Anschluss genauer untersucht worden sind. Bei beiden Genen konnte auf Proteinebene gezeigt werden, dass sie in L. m.-infizierten BMDM signifikant erh{\"o}ht sind. Durch siRNA-Analysen konnte {\"u}berdies beobachtet werden, dass beide f{\"u}r die erfolgreiche Elimination der Amastigoten essenziell sind. Somit konnte mit den Proteinen BNIP3 und CTSE zwei potenzielle neue Ansatzpunkte f{\"u}r m{\"o}gliche zuk{\"u}nftige antileishmaniale Therapien gefunden werden. Auch die in LISA enthaltenen Gene stellen prinzipiell vielversprechende Ziele f{\"u}r k{\"u}nftige Medikamente gegen Leishmaniose dar. Durch all diese Untersuchungen kommt man dem Ziel einer neuen, gezielten und nebenwirkungs{\"a}rmeren Behandlung der Leishmaniose einen Schritt n{\"a}her.}, subject = {Autophagie}, language = {de} } @phdthesis{Riedel2007, author = {Riedel, Alexander}, title = {Untersuchungen zur endogenen MHC-Klasse-II-restringierten Pr{\"a}sentation nukle{\"a}rer Antigene}, url = {http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:20-opus-25183}, school = {Universit{\"a}t W{\"u}rzburg}, year = {2007}, abstract = {Die endogene Pr{\"a}sentation von intrazellul{\"a}ren Antigenen auf Major-Histokompatibilit{\"a}tskomplex Klasse-II (MHC-II) -Molek{\"u}len ist von entscheidender Bedeutung f{\"u}r eine Reihe von immunologischen Prozessen. Die mechanistischen Grundlagen dieses Pr{\"a}sentationsweges sind aber noch weitgehend unverstanden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Beitrag zum molekularen Verst{\"a}ndnis der Abl{\"a}ufe zu leisten, die an der endogenen Pr{\"a}sentation nukle{\"a}rer Antigene auf MHC-II-Molek{\"u}len beteiligt sind. Dazu sollte am Beispiel des nukle{\"a}r lokalisierten Modellantigens Neomycin-Phosphotransferase II (NucNeoR) sowie des viralen Kernantigens Epstein-Barr-virus nuclear antigen 3C (EBNA3C) und entsprechender antigenspezifischer MHC-II-restringierter CD4+ T-Zellen die verantwortlichen Pr{\"a}sentationswege in professionell und nicht-professionell antigenpr{\"a}sentierenden Zellen untersucht werden. In beiden Zellsystemen wurde NucNeoR {\"u}ber einen endogenen Pr{\"a}sentationsweg und nicht {\"u}ber die Freisetzung und Wiederaufnahme als exogenes Protein auf MHC-II-Molek{\"u}len pr{\"a}sentiert. Durch die Verwendung chemischer Inhibitoren konnte eine Beteiligung der Autophagie an der endogenen Antigenpr{\"a}sentation nachgewiesen werden. Da Autophagie ausschließlich im Zytoplasma stattfindet, wurde nach m{\"o}glichen Eintrittspforten f{\"u}r nukle{\"a}re Proteine in diesen Abbauweg gesucht. F{\"u}r die Autophagie-abh{\"a}ngige Pr{\"a}sentation von NucNeoR war weder ein CRM1-vermittelter aktiver Export des Antigens aus dem Kern ins Zytoplasma, noch eine Aufl{\"o}sung der Kernmembran im Rahmen der Zellteilung und der dadurch bedingten Durchmischung nukle{\"a}rer und zytoplasmatischer Bestandteile notwendig. Mit Hilfe eines konditionalen Antigenexpressionsystems und der Auftrennung antigenexprimierender Zellen nach Zellzyklusphasen konnte eine verst{\"a}rkte Antigenpr{\"a}sentation in der G1/0-Phase nachgewiesen werden, die mit fortschreitendem Zellzyklus immer mehr abnahm. Die Antigenpr{\"a}sentation korrelierte dabei mit der ebenfalls im Laufe des Zellzyklus abnehmenden Transkriptions- bzw. Translationsrate des Antigens, aber nicht mit der absoluten Menge an Antigen in den Zellen. Bei abgeschalteter Antigentranskription dagegen korrelierte die Antigenpr{\"a}sentation mit der MHC-II-Oberfl{\"a}chenexpression, die von der G1/0- bis hin zur G2/M-Phase kontinuierlich zunahm. Eine {\"a}hnliche Korrelation von Antigentranskription/ Antigentranslation und Autophagie-abh{\"a}ngiger Antigenpr{\"a}sentation wurde auch f{\"u}r EBNA3C und die zytoplasmatisch lokalisierte NeoR-Variante beobachtet. Diese Ergebnisse identifizieren die Autophagie-abh{\"a}ngige Pr{\"a}sentation neusynthetisierter Proteine als den verantwortlichen molekularen Mechanismus f{\"u}r die endogene Pr{\"a}sentation der untersuchten nukle{\"a}ren Antigene auf MHC-II-Molek{\"u}len. Durch die Kopplung von Translation und autophagischem Abbau erlangen Proteine unabh{\"a}ngig von ihrer subzellul{\"a}ren Lokalisation Zugang zu diesem Pr{\"a}sentationsweg und erweitern so das Spektrum der intrazellul{\"a}ren Antigene, die einer CD4+ T-Zell{\"u}berwachung unterliegen.}, subject = {Autophagie}, language = {de} }